Lo studio confronta i metodi di estrazione e amplificazione del DNA utilizzati per la ricerca sul microbioma

Affrontiamolo, siamo una società orientata ai risultati. Troppo concentrato sul risultato, le persone non pensano spesso al "come". Ad esempio, hai pensato a "come" sei arrivato al lavoro stamattina o ci sei appena arrivato? Negli studi sul microbioma i risultati sono i grafici e i dati ma il "come, "come il pendolarismo, spesso fa parte di una routine.

Però, un aspetto fondamentale dell'analisi dei microbiomi (indipendentemente dall'ospite) si basa sui metodi di estrazione e amplificazione del DNA. Decine di metodi di estrazione del DNA attualmente sul mercato sono in grado di estrarre il DNA e produrre risultati affidabili, ma ognuno ha un "come" leggermente diverso. I laboratori spesso hanno il loro kit "go-to" selezionato dal leader del laboratorio e tramandato di generazione in generazione di studenti laureati. E una volta scelto un metodo, è meglio attenersi a quel metodo semplicemente perché tutti sanno che un kit diverso produrrà risultati leggermente diversi. Ma qual è il metodo migliore? Come scegli? Quanto incide davvero il "come" sui risultati? E quando dovresti cambiare?

Il disegno sperimentale e la raccolta di campioni sono generalmente discussi a lungo all'inizio di qualsiasi progetto, tuttavia i metodi di estrazione del DNA sono spesso trascurati. Questo incombente pregiudizio di ignorare l'importanza del metodo di estrazione del DNA è diventato la domanda centrale per la ricercatrice Cecelia Giangacomo e il suo consulente Jason G. Wallace nel loro ultimo Phytobiomes Journal pubblicazione, "Confronto tra estrazione del DNA e metodi di amplificazione del gene rRNA 16S per le comunità batteriche associate alle piante". Wallace afferma, "Questa ricerca ci consente di conoscere i metodi migliori/più efficaci in futuro. Il nostro laboratorio svolge molto lavoro sul microbioma vegetale, quindi vogliamo assicurarci di utilizzare bene queste risorse. Ero davvero sorpreso che nessuno l'avesse fatto prima, quindi speriamo che altri laboratori lo trovino utile."

I kit di estrazione del DNA sono progettati per essere ad ampio spettro e funzionare sia per i microbi che per il loro ospite. Nella maggior parte dei progetti di microbioma vegetale ci sarà una quantità minima di DNA microbico rispetto all'ospite. Così, la sfida più grande nel sequenziamento del microbioma è ottimizzare l'estrazione del DNA microbico nel diluvio di DNA ospite all'interno di un campione.

Una volta estratto il DNA, i ricercatori spesso amplificano un singolo pezzo di DNA da tutti gli organismi nel campione. Questo pezzo di DNA è conservato in varie specie di interesse, ma è abbastanza diverso tra le specie per caratterizzare la diversità all'interno del campione. Uno dei bersagli più comuni per esaminare i batteri, il gene dell'RNA ribosomiale 16S, è presente anche nei cloroplasti delle piante. Quindi, mentre questo metodo di amplificazione funziona bene nel separare l'ospite dal microbo nei campioni umani e ambientali, produce ancora la contaminazione dell'ospite (attraverso l'amplificazione del cloroplasto) nei campioni di piante.

Wallace e il suo team hanno confrontato quattro comuni metodi di estrazione del DNA disponibili in commercio:DNeasy Plant (Qiagen), DNA veloce (Zymo), Estratto-N-Amp (Sigma-Aldrich), e Power Soil Kit (Qiagen). Hanno anche esaminato quattro diversi metodi di amplificazione che prendono di mira regioni specifiche del gene dell'RNA ribosomiale 16S per determinare quale metodo ha svolto il miglior lavoro nell'escludere il DNA ospite preservando il DNA microbico.

Un modo in cui i ricercatori possono selezionare il DNA ospite è attraverso la modifica del processo di amplificazione. Wallace e i suoi colleghi hanno esaminato l'aggiunta di morsetti molecolari che avrebbero represso il cloroplasto e il DNA mitocondriale, essenzialmente bloccando l'amplificazione del DNA indesiderato. Hanno anche provato ad amplificare una regione diversa del gene 16S che avrebbe discriminato cloroplasti e mitocondri portando a un DNA più amplificato del microbioma. Il loro metodo finale per ottimizzare il processo di amplificazione utilizzava sequenze che "avvelenavano" il DNA indesiderato in modo che non potesse essere ulteriormente amplificato.

Questo processo è analogo a prendere più percorsi sul tuo tragitto giornaliero. Ciascuno può avere alcuni scenari sovrapposti ma anche attributi unici; uno può essere più scenografico, uno più veloce, un altro più stressante. Nella ricerca di Wallace potrebbero utilizzare le varie vie di estrazione e amplificazione per confrontare come il "come" dei metodi influisca sui risultati complessivi. Mentre la maggior parte dei ricercatori sa che c'è un pregiudizio nei loro metodi, si trattava di un confronto diretto fianco a fianco che mostrava come ciascun metodo producesse risultati diversi e modificasse la composizione complessiva del campione.

Questo studio dovrebbe aiutare le persone a fare le scelte migliori in termini di come spendere tempo e denaro per la ricerca sul microbioma".

Jason G. Wallace

Wallace ha sottolineato che non esiste un "metodo perfetto", e anche all'interno del loro studio alcuni metodi hanno funzionato meglio per alcuni tipi di campioni ma non per altri. Questi dati forniscono ai ricercatori le conoscenze per prendere decisioni più informate riguardo ai loro metodi. Anche il metodo migliore qui potrebbe non essere il metodo migliore per progetti specifici, campioni, tipi, o budget. Le aziende cercano costantemente di ottimizzare i loro prodotti, quindi, mentre andiamo avanti, si spera che questa sfida diventi più facile per i ricercatori.

Più importante, questa ricerca dimostra che ci sono differenze tra i metodi che possono avere un impatto sui risultati. Non esiste un "metodo perfetto". Spetta ai ricercatori comprendere le sfumature dei loro campioni e scegliere il metodo migliore per la questione scientifica che sperano di affrontare. Quindi, mentre tutte le strade possono portare a un risultato, potrebbe valere la pena di sperimentare il "come" per trovare il percorso migliore per la ricerca sul microbioma. "Questo non è un cambio di paradigma, ma è uno dei piccoli, modifiche incrementali che ci aiutano a fare ricerca solo un po' meglio, e nel tempo quelli si sommano a miglioramenti piuttosto grandi, " spiega Wallace.

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