Cependant, un aspect fondamental de l'analyse des microbiomes (quel que soit l'hôte) repose sur les méthodes d'extraction et d'amplification de l'ADN. Des dizaines de méthodes d'extraction d'ADN actuellement sur le marché sont chacune capables d'extraire l'ADN et de produire des résultats fiables, mais chacun a un "comment" légèrement différent. Les laboratoires ont souvent leur kit "go-to" sélectionné par le chef de laboratoire et transmis de génération en génération d'étudiants diplômés. Et une fois que vous avez choisi une méthode, il est préférable de s'en tenir à cette méthode simplement parce que tout le monde sait qu'un kit différent produira des résultats légèrement différents. Mais quelle méthode est la meilleure ? Comment choisissez-vous? Dans quelle mesure le « comment » a-t-il vraiment un impact sur les résultats ? Et quand faut-il changer ?
La conception expérimentale et la collecte d'échantillons sont généralement discutées en détail au début de tout projet, pourtant, les méthodes d'extraction d'ADN sont souvent négligées. Ce biais imminent consistant à ignorer l'importance de la méthode d'extraction de l'ADN est devenu la question centrale de la chercheuse Cecelia Giangacomo et de son conseiller Jason G. Wallace dans leur dernier Journal des phytobiomes publication, "Comparer les méthodes d'extraction d'ADN et d'amplification du gène de l'ARNr 16S pour les communautés bactériennes associées aux plantes." Wallace déclare, "Cette recherche nous permet de connaître les méthodes les meilleures/les plus efficaces pour l'avenir. Notre laboratoire fait beaucoup de travail sur le microbiome végétal, nous voulons donc nous assurer que nous utilisons bien ces ressources. J'étais en fait surpris que personne n'ait fait ça avant, nous espérons donc que d'autres laboratoires le trouveront utile."
Les kits d'extraction d'ADN sont conçus pour être à large spectre afin de fonctionner à la fois pour les microbes et leur hôte. Dans la plupart des projets de microbiome végétal, il y aura une quantité infime d'ADN microbien par rapport à l'hôte. Ainsi, le plus grand défi du séquençage du microbiome est d'optimiser l'extraction de l'ADN microbien dans le déluge d'ADN hôte dans un échantillon.
Une fois l'ADN extrait, les chercheurs amplifient souvent un seul morceau d'ADN de tous les organismes de l'échantillon. Ce morceau d'ADN est conservé à travers diverses espèces d'intérêt, mais est suffisamment différent entre les espèces pour caractériser la diversité au sein de l'échantillon. L'une des cibles les plus courantes pour étudier les bactéries, le gène de l'ARN ribosomique 16S, est également présente dans les chloroplastes des plantes. Ainsi, bien que cette méthode d'amplification fonctionne bien pour séparer l'hôte du microbe dans les échantillons humains et environnementaux, elle produit toujours une contamination de l'hôte (par amplification du chloroplaste) dans les échantillons de plantes.
Wallace et son équipe ont comparé quatre méthodes d'extraction d'ADN courantes disponibles dans le commerce :DNeasy Plant (Qiagen), ADN rapide (Zymo), Extrait-N-Amp (Sigma-Aldrich), et Power Soil Kit (Qiagen). Ils ont également examiné quatre méthodes d'amplification différentes qui ciblent des régions spécifiques du gène de l'ARN ribosomique 16S afin de déterminer quelle méthode permettait le mieux d'exclure l'ADN de l'hôte tout en préservant l'ADN microbien.
Une façon pour les chercheurs de sélectionner l'ADN de l'hôte consiste à modifier le processus d'amplification. Wallace et ses collègues ont envisagé d'ajouter des pinces moléculaires qui réduiraient le chloroplaste et l'ADN mitochondrial, bloquant essentiellement l'amplification de l'ADN indésirable. Ils ont également essayé d'amplifier une région différente du gène 16S qui discriminerait le chloroplaste et les mitochondries, conduisant à un ADN plus amplifié du microbiome. Leur méthode finale d'optimisation du processus d'amplification utilisait des séquences qui "empoisonnent" l'ADN indésirable afin qu'il ne puisse pas être amplifié davantage.
Ce processus est analogue à prendre plusieurs itinéraires sur votre trajet domicile-travail. Chacun peut avoir des paysages qui se chevauchent mais aussi des attributs uniques; on peut être plus pittoresque, un plus rapide, un autre plus stressant. Dans les recherches de Wallace, ils pourraient utiliser les différentes voies d'extraction et d'amplification pour comparer l'impact du « comment » des méthodes sur les résultats globaux. Alors que la plupart des chercheurs savent que leurs méthodes sont biaisées, il s'agissait d'une comparaison directe côte à côte montrant comment chaque méthode produisait des résultats différents et modifiait la composition globale de l'échantillon.
Cette étude devrait aider les gens à faire les meilleurs choix quant à la façon de consacrer leur temps et leur argent à la recherche sur le microbiome."
Jason G. Wallace
Wallace a souligné qu'il n'y a pas de "méthode parfaite", et même au sein de leur étude, certaines méthodes ont mieux fonctionné pour certains types d'échantillons mais pas pour d'autres. Ces données fournissent aux chercheurs les connaissances nécessaires pour prendre des décisions plus éclairées concernant leurs méthodes. Même la meilleure méthode ici peut ne pas être la meilleure méthode pour des projets spécifiques, échantillons, les types, ou budgétaire. Les entreprises cherchent constamment à optimiser leurs produits, donc à mesure que nous avançons, ce défi deviendra, espérons-le, plus facile pour les chercheurs.
Plus important encore, cette recherche montre qu'il existe des différences entre les méthodes qui peuvent avoir un impact sur les résultats. Il n'y a pas de "méthode parfaite". Aux chercheurs de comprendre les nuances de leurs échantillons et de choisir la meilleure méthode pour la question scientifique qu'ils espèrent aborder. Alors que tous les chemins peuvent mener à un résultat, expérimenter le « comment » peut valoir la peine de trouver la meilleure voie pour la recherche sur le microbiome. "Ce n'est pas un changement de paradigme, mais c'est l'un des petits, des changements progressifs qui nous aident à faire des recherches un peu mieux, et au fil du temps, cela s'ajoute à des améliorations assez importantes, " explique Wallace.
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