Študija primerja metode ekstrakcije in amplifikacije DNA, ki se uporabljajo za raziskave mikrobiomov

Priznajmo si, smo družba, ki temelji na rezultatih. Preveč osredotočen na rezultat, ljudje ne razmišljajo pogosto o tem, kako. Na primer, ali ste danes zjutraj razmišljali o tem, kako ste prišli v službo, ali ste šele prišli tja? V študijah mikrobiomov so rezultati grafi in podatki, vendar "kako, "kot vožnja na delo, je pogosto le del rutine.

Vendar pa Temeljni vidik analize mikrobiomov (ne glede na gostitelja) temelji na metodah ekstrakcije in amplifikacije DNA. Več deset načinov ekstrakcije DNK, ki so trenutno na trgu, lahko odvzamejo DNK in prinesejo ugledne rezultate, vsak pa ima nekoliko drugačen "kako". Laboratoriji pogosto izberejo komplet "go-to", ki ga izbere vodja laboratorija in se prenaša iz generacije v generacijo podiplomskih študentov. In ko izberete metodo, se je najbolje držati te metode preprosto zato, ker vsi vedo, da bo drugačen komplet prinesel nekoliko drugačne rezultate. Toda katera metoda je najboljša? Kako izbirate? Koliko "kako" resnično vpliva na rezultate? In kdaj morate zamenjati?

O poskusnem načrtovanju in zbiranju vzorcev se običajno na dolgo in široko razpravlja na začetku katerega koli projekta, vendar se metode ekstrakcije DNK pogosto spregledajo. Ta grozeča pristranskost zanemarjanja pomena metode ekstrakcije DNK je postala osrednje vprašanje raziskovalke Cecelie Giangacomo in njenega svetovalca Jasona G. Wallacea Phytobiomes Journal objava, "Primerjava metod ekstrakcije DNA in 16S rRNA genskih ojačevalskih metod za bakterijske skupnosti, povezane z rastlinami." Wallace navaja, "Ta raziskava nam omogoča, da poznamo najboljše/najučinkovitejše metode za naprej. Naš laboratorij veliko deluje na mikrobiome rastlin, zato se želimo prepričati, da te vire dobro uporabljamo. Pravzaprav sem bil presenečen, da tega še nihče ni storil, zato upamo, da bodo drugi laboratoriji koristni. "

Kompleti za ekstrakcijo DNA so zasnovani tako, da delujejo tako za mikrobe kot za njihovega gostitelja. V večini rastlinsko-mikrobiomskih projektov bo majhna količina mikrobne DNA v primerjavi z gostiteljem. Tako največji izziv pri sekvenciranju mikrobiomov je optimizacija ekstrakcije mikrobne DNA pri poplavi DNK gostitelja v vzorcu.

Ko je DNK ekstrahirana, raziskovalci bodo pogosto ojačali en sam kos DNK iz vseh organizmov v vzorcu. Ta del DNK je ohranjen pri različnih zanimivih vrstah, vendar je med vrstami dovolj različen, da označi raznolikost vzorca. Eden najpogostejših ciljev za raziskovanje bakterij-gen 16S ribosomske RNA-je prisoten tudi v rastlinskih kloroplastih. Torej, čeprav ta metoda pomnoževanja dobro deluje pri ločevanju gostitelja od mikrobov v vzorcih ljudi in okolja, še vedno povzroča kontaminacijo gostitelja (z ojačanjem kloroplasta) v vzorcih rastlin.

Wallace in njegova ekipa sta primerjali štiri običajne komercialno dostopne metode ekstrakcije DNK:DNeasy Plant (Qiagen), Hitra DNK (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), in Power Soil Kit (Qiagen). Ogledali so si tudi štiri različne metode pomnoževanja, ki ciljajo na specifična območja gena 16S ribosomske RNA, da bi ugotovili, katera metoda je najbolje izločila DNK gostitelja, hkrati pa ohranila mikrobno DNA.

Eden od načinov, kako se raziskovalci lahko odločijo proti DNK gostitelja, je spreminjanje procesa pomnoževanja. Wallace in njegovi sodelavci so preučili dodajanje molekularnih sponk, ki bi pritrdile kloroplast in mitohondrijsko DNA, v bistvu blokira pomnoževanje neželene DNK. Poskušali so tudi ojačati drugo območje gena 16S, ki bi razlikovalo kloroplast in mitohondrije, kar bi vodilo do bolj ojačane DNK mikrobioma. Njihova zadnja metoda optimizacije procesa pomnoževanja je uporabila sekvence, ki "zastrupljajo" nezaželeno DNA, tako da je ni mogoče dodatno ojačati.

Ta postopek je podoben sprejemanju več poti na vaši poti. Vsak ima lahko nekaj prekrivajočih se pokrajin, pa tudi edinstvene lastnosti; lahko je kdo bolj slikovit, eno hitreje, še ena bolj stresna. V Wallaceovi raziskavi bi lahko uporabili različne načine pridobivanja in pomnoževanja, da bi primerjali, kako "kako" metode vplivajo na splošne rezultate. Medtem ko večina raziskovalcev ve, da so njihove metode pristranske, to je bila neposredna vzporedna primerjava, ki je pokazala, kako je vsaka metoda dala različne rezultate in spremenila celotno sestavo vzorca.

Ta študija bi morala ljudem pomagati pri najboljši izbiri glede tega, kako porabiti svoj čas in denar za raziskave mikrobiomov. "

Jason G. Wallace

Wallace je poudaril, da ne obstaja "popolna metoda", in tudi v okviru njihove študije so nekatere metode delovale bolje za nekatere vrste vzorcev, za druge pa ne. Ti podatki raziskovalcem dajejo znanje za sprejemanje bolj informiranih odločitev glede njihovih metod. Tudi najboljša metoda tukaj morda ni najboljša metoda za posebne projekte, vzorci, vrste, ali proračunov. Podjetja nenehno poskušajo optimizirati svoje izdelke, tako da bomo z napredovanjem ta izziv raziskovalcem olajšali.

Najpomembneje, Ta raziskava opozarja, da obstajajo razlike med metodami, ki lahko vplivajo na rezultate. Ni "popolne metode". Raziskovalci morajo razumeti nianse svojih vzorcev in izbrati najboljšo metodo za znanstveno vprašanje, ki ga upajo obravnavati. Čeprav lahko vse ceste vodijo do rezultatov, eksperimentirati z "kako" je morda vredno truda, da bi našli najboljšo pot za raziskave mikrobiomov. "To ni sprememba paradigme, ampak to je eno malih, postopne spremembe, ki nam pomagajo nekoliko bolje raziskati, in sčasoma se to poveča na precej velike izboljšave, "razlaga Wallace.

• Družinsko-ekonomski status družine lahko vpliva na sestavo črevesnega mikrobioma pri otrocih
• Čustvena podpora in odpornost lahko pomagata ublažiti psihološke učinke pandemije