Štúdia porovnáva metódy extrakcie a amplifikácie DNA používané na výskum mikrobiómov

Priznajme si to, sme spoločnosť založená na výsledkoch. Príliš zameraný na výsledok, ľudia často nerozmýšľajú nad tým „ako“. Napríklad premýšľali ste o tom „ako“ ste sa dnes ráno dostali do práce alebo ste sa tam len dostali? V mikrobiómových štúdiách sú výsledkami grafy a údaje, ale „ako, „ako dochádzanie do práce, je často len súčasťou rutiny.

Avšak, základný aspekt analýzy mikrobiómov (bez ohľadu na hostiteľa) závisí od metód extrakcie a amplifikácie DNA. Desiatky metód extrakcie DNA, ktoré sú v súčasnosti na trhu, sú schopné extrahovať DNA a priniesť renomované výsledky, ale každý má trochu iné „ako“. Laboratóriá často nechávajú súpravu „go-to“ vybrať vedúci laboratória a dedia ju z generácie na generáciu postgraduálnych študentov. A akonáhle si vyberiete metódu, je najlepšie sa tejto metódy držať jednoducho preto, že každý vie, že iná súprava prinesie mierne odlišné výsledky. Ale ktorá metóda je najlepšia? Ako si vyberiete? Ako veľmi „ako“ skutočne ovplyvňuje výsledky? A kedy by ste mali prestúpiť?

Experimentálny dizajn a zber vzoriek sa zvyčajne prediskutujú na začiatku akéhokoľvek projektu, metódy extrakcie DNA sú často prehliadané. Táto hroziaca zaujatosť ignorovania dôležitosti metódy extrakcie DNA sa stala ústrednou otázkou pre výskumnú pracovníčku Ceceliu Giangacomo a jej poradcu Jasona G. Wallace v ich najnovšom Fytobiomes Journal publikácia, „Porovnanie metód extrakcie DNA a génovej amplifikácie 16S rRNA pre bakteriálne komunity súvisiace s rastlinami.“ Wallace uvádza, "Tento výskum nám umožňuje poznať najlepšie/najúčinnejšie metódy do budúcna. Naše laboratórium robí veľa práce s mikrobiómami rastlín, preto sa chceme uistiť, že tieto zdroje používame dobre. Bol som skutočne prekvapený, že to nikto predtým neurobil. dúfame, že to bude pre ostatné laboratóriá užitočné. “

Súpravy na extrakciu DNA sú navrhnuté tak, aby boli širokospektrálne a fungovali tak pre mikróby, ako aj pre ich hostiteľov. Vo väčšine projektov rastlinných mikrobiómov bude v porovnaní s hostiteľom malé množstvo mikrobiálnej DNA. Preto najväčšou výzvou v sekvenovaní mikrobiómov je optimalizácia extrakcie mikrobiálnej DNA v záplave hostiteľskej DNA vo vzorke.

Akonáhle je DNA extrahovaná, vedci často amplifikujú jeden kus DNA zo všetkých organizmov vo vzorke. Tento kus DNA je konzervovaný v rôznych záujmových druhoch, ale medzi druhmi je dostatočne odlišný na charakterizáciu diverzity vo vzorke. Jeden z najbežnejších cieľov skúmania baktérií-16S ribozomálny RNA gén-; je prítomný aj v rastlinných chloroplastoch. Aj keď tento spôsob amplifikácie funguje dobre pri oddeľovaní hostiteľa od mikróbu vo vzorkách ľudí a životného prostredia, stále spôsobuje hostiteľskú kontamináciu (prostredníctvom amplifikácie chloroplastu) vo vzorkách rastlín.

Wallace a jeho tím porovnali štyri bežne dostupné komerčne dostupné metódy extrakcie DNA:DNeasy Plant (Qiagen), Rýchla DNA (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), a súpravu Power Soil Kit (Qiagen). Tiež sa pozreli na štyri rôzne amplifikačné metódy, ktoré sa zameriavajú na špecifické oblasti 16S ribozomálneho RNA génu, aby zistili, ktorá metóda urobila najlepšiu prácu pri vylúčení hostiteľskej DNA pri zachovaní mikrobiálnej DNA.

Jeden spôsob, akým sa vedci môžu rozhodnúť proti hostiteľskej DNA, je modifikácia procesu amplifikácie. Wallace a jeho kolegovia sa pozreli na pridanie molekulárnych svoriek, ktoré by obmedzili chloroplasty a mitochondriálnu DNA, v podstate blokuje amplifikáciu nechcenej DNA. Pokúsili sa tiež amplifikovať inú oblasť génu 16S, ktorá by diskriminovala chloroplasty a mitochondrie, čo by viedlo k viac amplifikovanej DNA mikrobiómu. Ich konečná metóda optimalizácie procesu amplifikácie použila sekvencie, ktoré „otrávia“ nechcenú DNA, takže ju nemožno ďalej amplifikovať.

Tento proces je analogický ako keď cestujete po viacerých trasách. Každý môže mať nejaké prekrývajúce sa scenérie, ale aj jedinečné atribúty; jeden môže byť krajší, jeden rýchlejší, ďalší viac stresujúci. Vo Wallaceovom výskume mohli použiť rôzne spôsoby extrakcie a amplifikácie na porovnanie toho, ako „ako“ metódy ovplyvňujú celkové výsledky. Aj keď väčšina vedcov vie, že ich metódy sú zaujaté, toto bolo priame porovnanie vedľa seba, ktoré ukázalo, ako každá metóda priniesla rôzne výsledky a zmenila celkové zloženie vzorky.

Táto štúdia by mala ľuďom pomôcť pri výbere najlepších možností, ako tráviť čas a peniaze na výskum mikrobiómov. “

Jason G. Wallace

Wallace zdôraznil, že neexistuje „dokonalá metóda“, a dokonca aj v rámci ich štúdie niektoré metódy fungovali lepšie pre niektoré typy vzoriek, ale pre iné nie. Tieto údaje poskytujú vedcom znalosti potrebné na to, aby sa mohli lepšie rozhodnúť o svojich metódach. Aj tu najlepšia metóda nemusí byť najlepšou metódou pre konkrétne projekty, vzorky, typy, alebo rozpočty. Spoločnosti sa neustále snažia optimalizovať svoje výrobky, takže ako sa pohneme vpred, táto výzva bude pre vedcov dúfajme jednoduchšia.

Čo je najdôležitejšie, tento výskum ukazuje, že medzi metódami, ktoré môžu ovplyvniť výsledky, existujú rozdiely. Neexistuje žiadna „dokonalá metóda“. Je na vedcoch, aby pochopili nuansy svojich vzoriek a vybrali si najlepšiu metódu pre vedeckú otázku, ktorou sa chcú zaoberať. Aj keď všetky cesty môžu viesť k výsledku, experimentovanie s otázkou „ako“ môže stáť za námahu nájsť najlepšiu cestu pre výskum mikrobiómov. „Toto nie je zmena paradigmy, ale je to jeden z malých, prírastkové zmeny, ktoré nám pomáhajú robiť výskum o niečo lepšie, a postupom času sa tieto pridávajú k dosť veľkým vylepšeniam, “vysvetľuje Wallace.

• Sociálno-ekonomický status rodiny môže ovplyvniť zloženie črevného mikrobiómu detí
• Emocionálna podpora a odolnosť môžu pomôcť zmierniť psychologické dôsledky pandémie