Tyrime lyginami DNR ištraukimo ir amplifikacijos metodai, naudojami mikrobiomų tyrimams

Pripažinkime, mes esame į rezultatus orientuota visuomenė. Per daug susikoncentravęs į rezultatą, žmonės dažnai negalvoja apie „kaip“. Pavyzdžiui, ar galvojote apie tai, „kaip“ šį rytą pradėjote dirbti, ar ką tik pasiekėte? Mikrobiomų tyrimų rezultatai yra grafikai ir duomenys, bet „kaip, „kaip į darbą ir atgal, dažnai yra tik rutinos dalis.

Tačiau, pagrindinis mikrobiomų analizės aspektas (nepriklausomai nuo šeimininko) priklauso nuo DNR ekstrahavimo ir amplifikacijos metodų. Dešimtys šiuo metu rinkoje esančių DNR išskyrimo metodų gali išgauti DNR ir duoti gerų rezultatų, bet kiekvienas turi šiek tiek kitokį „kaip“. Laboratorijos dažnai renkasi laboratorijos vadovą, kuris perduodamas iš kartos į kartą absolventams. Ir kai pasirinksite metodą, geriausia to laikytis, nes visi žino, kad kitoks rinkinys duos šiek tiek skirtingus rezultatus. Bet kuris metodas yra geriausias? Kaip renkatės? Kiek „kaip“ iš tikrųjų veikia rezultatus? O kada reiktu keistis?

Eksperimentinis dizainas ir pavyzdžių rinkimas paprastai yra ilgai aptariami pradedant bet kokį projektą, vis dėlto dažnai nepaisoma DNR išskyrimo metodų. Šis gresiantis šališkumas ignoruojant DNR išskyrimo metodo svarbą tapo pagrindiniu tyrėjos Cecelia Giangacomo ir jos patarėjo Jasono G. Wallace'o naujausiu klausimu. Phytobiomes Journal leidinys, "DNR ekstrahavimo ir 16S rRNR genų amplifikacijos metodų palyginimas su augalais susijusioms bakterijų bendruomenėms". Wallace'as teigia, "Šis tyrimas leidžia mums žinoti geriausius/efektyviausius metodus. Mūsų laboratorija atlieka daug augalų mikrobiomų, todėl norime įsitikinti, kad tuos išteklius naudojame gerai. Tiesą sakant, buvau nustebęs, kad niekas to nedarė anksčiau, todėl tikimės, kad kitoms laboratorijoms tai bus naudinga “.

DNR ištraukimo rinkiniai yra plataus spektro, kad galėtų veikti ir mikrobai, ir jų šeimininkai. Daugelyje augalų ir mikrobiomų projektų bus nedidelis mikrobų DNR kiekis, palyginti su šeimininku. Taigi, didžiausias mikrobiomų sekos nustatymo iššūkis yra optimizuoti mikrobinės DNR ištraukimą mėginyje esančioje DNR šeimininkėje.

Išskyrus DNR, tyrėjai dažnai sustiprins vieną DNR gabalą iš visų mėginyje esančių organizmų. Šis DNR gabalas yra išsaugotas įvairiose dominančiose rūšyse, tačiau yra pakankamai skirtingas tarp rūšių, kad apibūdintų mėginio įvairovę. Vienas iš labiausiai paplitusių bakterijų tyrimo tikslų; 16S ribosomų RNR genas; taip pat yra augalų chloroplastuose. Taigi, nors šis amplifikacijos metodas gerai veikia atskiriant šeimininką nuo mikrobų žmogaus ir aplinkos mėginiuose, jis vis tiek gamyklose užteršia šeimininką (stiprindamas chloroplastą).

Wallace'as ir jo komanda palygino keturis įprastus komerciškai prieinamus DNR išskyrimo metodus:DNeasy Plant (Qiagen), Greita DNR (Zymo), „Extract-N-Amp“ („Sigma-Aldrich“), ir „Power Soil Kit“ („Qiagen“). Jie taip pat pažvelgė į keturis skirtingus amplifikacijos metodus, skirtus tam tikriems 16S ribosominės RNR geno regionams, kad nustatytų, kuris metodas geriausiai padėjo pašalinti šeimininko DNR, išlaikant mikrobinę DNR.

Vienas iš būdų, kaip mokslininkai gali pasirinkti prieš šeimininko DNR, yra modifikuoti amplifikacijos procesą. Wallace'as ir jo kolegos svarstė galimybę pridėti molekulinius spaustukus, kurie prispaustų chloroplastą ir mitochondrijų DNR, iš esmės blokuoja nepageidaujamos DNR amplifikaciją. Jie taip pat bandė sustiprinti kitą 16S geno sritį, kuri diskriminuotų chloroplastus ir mitochondrijas, o tai leistų labiau sustiprinti mikrobiomos DNR. Paskutiniame jų stiprinimo proceso optimizavimo metode buvo naudojamos sekos, kurios „nuodija“ nepageidaujamą DNR, todėl jos negalima toliau stiprinti.

Šis procesas yra analogiškas kelių maršrutų kelionėms į darbą ir atgal. Kiekvienas iš jų gali turėti keletą sutampančių dekoracijų, bet ir unikalių atributų; vienas gali būti vaizdingesnis, vienas greitesnis, kitas labiau įtemptas. Wallace'o tyrimuose jie galėjo naudoti įvairius išgavimo ir stiprinimo būdus, kad palygintų, kaip metodų „kaip“ veikia bendrus rezultatus. Nors dauguma tyrinėtojų žino, kad jų metodai yra šališki, tai buvo tiesioginis palyginimas, parodantis, kaip kiekvienas metodas davė skirtingus rezultatus ir pakeitė bendrą mėginio sudėtį.

Šis tyrimas turėtų padėti žmonėms geriausiai pasirinkti, kaip praleisti laiką ir pinigus mikrobiomų tyrimams “.

Jasonas G. Wallace'as

Wallace pabrėžė, kad nėra „tobulo metodo“, ir net jų tyrimo metu kai kurie metodai geriau veikė kai kurių tipų mėginiams, bet ne kitiems. Šie duomenys suteikia tyrėjams žinių, kad jie galėtų priimti labiau pagrįstus sprendimus dėl savo metodų. Net geriausias metodas čia gali būti ne geriausias būdas konkretiems projektams, pavyzdžiai, tipai, arba biudžetai. Įmonės nuolat stengiasi optimizuoti savo produktus, taigi, einant į priekį, tikimasi, kad mokslininkams taps lengviau.

Svarbiausia, šis tyrimas rodo, kad metodai, kurie gali turėti įtakos rezultatams, skiriasi. Nėra „tobulo metodo“. Tyrėjai turi suprasti savo mėginių niuansus ir pasirinkti geriausią metodą moksliniam klausimui, kurį jie tikisi išspręsti. Taigi, nors visi keliai gali duoti rezultatą, eksperimentuoti su „kaip“ gali būti verta pastangų, norint rasti geriausią mikrobiomų tyrimo kelią. „Tai nėra paradigmos pasikeitimas, bet tai vienas iš mažų papildomi pokyčiai, padedantys mums šiek tiek geriau atlikti tyrimus, ir laikui bėgant jie patobulėjo, “, - aiškina Wallace'as.

• Šeimos socialinė ir ekonominė padėtis gali turėti įtakos vaikų žarnyno mikrobiomos sudėčiai
• Emocinė parama ir atsparumas gali padėti sušvelninti psichologinius pandemijos padarinius