Derimot, et grunnleggende aspekt ved analyse av mikrobiomer (uavhengig av verten) er avhengig av DNA -ekstraksjon og amplifikasjonsmetoder. Dusinvis av DNA -ekstraksjonsmetoder som for tiden er på markedet, er hver i stand til å ekstrahere DNA og produsere anerkjente resultater, men hver har et litt annet "hvordan". Labs har ofte sitt "go-to" -sett valgt av laboratorielederen og overført fra generasjon til generasjon doktorgradsstudenter. Og når du først har valgt en metode, er det best å holde seg til den metoden rett og slett fordi alle vet at et annet sett vil gi litt forskjellige resultater. Men hvilken metode er den beste? Hvordan velger du? Hvor mye påvirker "hvordan" egentlig resultatene? Og når bør du bytte?
Eksperimentell design og prøvesamling diskuteres vanligvis i stor lengde ved starten av et prosjekt, men DNA -ekstraksjonsmetoder blir ofte oversett. Denne truende skjevheten om å ignorere viktigheten av DNA -ekstraksjonsmetoden ble det sentrale spørsmålet for forsker Cecelia Giangacomo og hennes rådgiver Jason G. Wallace i deres siste Phytobiomes Journal utgivelse, "Sammenligning av DNA-ekstraksjon og 16S rRNA genforsterkningsmetoder for planteassosierte bakteriesamfunn." Wallace sier, "Denne forskningen lar oss vite de beste/mest effektive metodene fremover. Laboratoriet vårt gjør mye plantemikrobiomarbeid, så vi vil være sikker på at vi bruker disse ressursene godt. Jeg var faktisk overrasket over at ingen hadde gjort dette før, så vi håper andre laboratorier finner det nyttig. "
DNA -ekstraksjonssett er designet for å være et bredt spekter for å fungere for både mikrober og deres vert. I de fleste plante-mikrobiomprosjekter vil det være en liten mengde mikrobielt DNA sammenlignet med verten. Og dermed, den største utfordringen i mikrobiomsekvensering er å optimalisere ekstraksjonen av det mikrobielle DNA i flommen av vert -DNA i en prøve.
Når DNA er ekstrahert, forskere vil ofte forsterke et enkelt stykke DNA fra alle organismer i prøven. Denne biten av DNA er bevart på tvers av forskjellige arter av interesse, men er forskjellig nok mellom artene til å karakterisere mangfoldet i prøven. Et av de vanligste målene for undersøkelse av bakterier; 16S ribosomalt RNA-genet; er også tilstede i plantekloroplaster. Så mens denne amplifiseringsmetoden fungerer godt ved å skille vert fra mikrobe i mennesker og miljøprøver, produserer den fremdeles vertskontaminering (gjennom amplifikasjon av kloroplast) i planteprøver.
Wallace og hans team sammenlignet fire vanlige kommersielt tilgjengelige DNA -ekstraksjonsmetoder:DNeasy Plant (Qiagen), Rask DNA (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), og Power Soil Kit (Qiagen). De så også på fire forskjellige amplifikasjonsmetoder som er målrettet mot spesifikke regioner i 16S -ribosomalt RNA -genet for å avgjøre hvilken metode som gjorde den beste jobben med å ekskludere verts -DNA -et samtidig som det bevarte det mikrobielle DNA.
En måte forskere kan velge mot vert -DNA er ved å endre amplifikasjonsprosessen. Wallace og hans kolleger så på å legge til molekylære klemmer som ville klemme ned på kloroplast og mitokondrielt DNA, blokkerer hovedsakelig amplifikasjon av uønsket DNA. De prøvde også å forsterke en annen region av 16S -genet som ville diskriminere kloroplast og mitokondrier som fører til mer amplifisert DNA av mikrobiomet. Deres siste metode for å optimalisere forsterkningsprosessen brukte sekvenser som "forgifter" uønsket DNA, slik at det ikke kan forsterkes ytterligere.
Denne prosessen er analog med å ta flere ruter på pendlingen. Hver kan ha noen overlappende natur, men også unike attributter; en kan være mer naturskjønn, en raskere, en annen mer stressende. I Wallaces forskning kunne de bruke de forskjellige ekstraksjons- og forsterkningsveiene for å sammenligne hvordan 'hvordan' metodene påvirker de samlede resultatene. Selv om de fleste forskere vet at det er skjevhet i metodene deres, Dette var en direkte sammenligning side om side som viste hvordan hver metode ga forskjellige resultater og endret prøvens samlede sammensetning.
Denne studien skal hjelpe folk til å ta de beste valgene når det gjelder hvordan de skal bruke tid og penger på mikrobiomforskning. "
Jason G. Wallace
Wallace understreket at det ikke er noen "perfekt metode", og selv i studien fungerte noen metoder bedre for noen prøvetyper, men ikke for andre. Disse dataene gir forskerne kunnskap til å ta bedre informerte beslutninger angående metodene deres. Selv den beste metoden her er kanskje ikke den beste metoden for spesifikke prosjekter, prøver, typer, eller budsjetter. Bedrifter prøver hele tiden å optimalisere produktene sine, så når vi går videre vil denne utfordringen forhåpentligvis bli lettere for forskere.
Viktigst, denne forskningen driver hjem at det er forskjeller mellom metoder som kan påvirke resultatene. Det er ingen "perfekt metode". Det er opp til forskerne å forstå nyansene i prøvene sine og velge den beste metoden for det vitenskapelige spørsmålet de håper å ta opp. Så mens alle veier kan føre til et resultat, å eksperimentere med "hvordan" kan være verdt innsatsen for å finne den beste ruten for mikrobiomforskning. "Dette er ikke et paradigmeskifte, men det er en av de små, trinnvise endringer som hjelper oss med å forske litt bedre, og over tid utgjør de ganske store forbedringer, "forklarer Wallace.
Antibiotikum X-206 effektivt mot SARS-CoV-2 in vitro
Tarmmikrobiom endres ved tilberedning av vegetabilsk mat,
Allergi knyttet til høyere søppelmatforbruk,
DNA -metabarkoding kan forbedre analysen av menneskelig kosthold
De første funnene fra Human Microbiome Project utløste "hundrevis av påfølgende studier"
Vestlig kosthold kan øke risikoen for "dødelig sepsis",
Søvnkvalitet kan være indikator for senere studier av Alzheimers sykdom
En ny studie fra forskerne ved University of California, Berkeley har vist at gradvis synkende søvnkvalitet blant de i 50- og 60 -årene kan indikere proteintråder i hjernen som kan føre til senere utv
Kortkjedet fettsyretilskudd forbedrer slaggjenoppretting,
musestudie viser Tilskudd av kroppens kortkjedede fettsyrer kan forbedre slaggjenoppretting, ifølge forskning på mus som nylig ble publisert i JNeurosci. Kortkjedet fettsyretilskudd kan være et ikke-i
Plast som nå ofte finnes i avføring fra mennesker
Nesten åtte milliarder tonn plast finner veien til havene hvert år. Denne enorme mengden plast skyller enten i land eller brytes ned i små biter som er mindre enn 5 millimeter i diameter og kalles mik