Tutkimuksessa verrataan mikrobiomitutkimuksessa käytettyjä DNA:n erotus- ja monistusmenetelmiä

Totta puhuen, olemme tuloshakuinen yhteiskunta. Liian keskittynyt lopputulokseen, ihmiset eivät usein ajattele "miten". Esimerkiksi, Mietitkö "miten" tulit töihin tänä aamuna vai tulitko juuri sinne? Mikrobiomitutkimuksissa tulokset ovat kaavioita ja tietoja, mutta "miten, "kuten työmatkalla, on usein vain osa rutiinia.

Kuitenkin, olennainen osa mikrobiomien analysointia (isännästä riippumatta) perustuu DNA:n uuttamis- ja monistusmenetelmiin. Kymmenet tällä hetkellä markkinoilla olevat DNA -uuttomenetelmät kumpikin kykenevät erottamaan DNA:ta ja tuottamaan hyvämaineisia tuloksia, mutta jokaisella on hieman erilainen "miten". Laboratorioilla on usein "go-to" -paketti, jonka laboratorion johtaja valitsee ja joka välitetään jatko-opiskelijoiden sukupolvelta toiselle. Ja kun olet valinnut menetelmän, on parasta noudattaa tätä menetelmää yksinkertaisesti siksi, että kaikki tietävät, että eri pakkaus tuottaa hieman erilaisia ​​tuloksia. Mutta mikä menetelmä on paras? Miten valitset? Kuinka paljon "miten" todella vaikuttaa tuloksiin? Ja milloin kannattaa vaihtaa?

Kokeellisesta suunnittelusta ja näytteenotosta keskustellaan yleensä pitkään projektin alussa, kuitenkin DNA:n uuttomenetelmät jäävät usein huomiotta. Tästä uhkaavasta puolueellisuudesta jättää huomiotta DNA -uuttomenetelmän merkitys tuli tutkijan Cecelia Giangacomon ja hänen neuvonantajansa Jason G.Wallacen viimeisimmässä kysymyksessä. Phytobiomes Journal julkaisu, "Vertaamalla DNA:n uuttoa ja 16S rRNA -geenin monistusmenetelmiä kasveihin liittyville bakteeriyhteisöille." Wallace toteaa, "Tämä tutkimus kertoo meille parhaat/tehokkaimmat menetelmät jatkossa. Laboratoriomme tekee paljon kasvien mikrobiomityötä, joten haluamme varmistaa, että käytämme näitä resursseja hyvin. Olin todella yllättynyt siitä, ettei kukaan ollut tehnyt tätä aiemmin, joten toivomme, että muut laboratoriot pitävät sitä hyödyllisenä. "

DNA -uuttopakkaukset on suunniteltu laajakirjoisiksi toimimaan sekä mikrobeille että niiden isännälle. Useimmissa kasvi-mikrobiomiprojekteissa on pieni määrä mikrobi-DNA:ta isäntään verrattuna. Täten, suurin haaste mikrobiomien sekvensoinnissa on mikrobi -DNA:n uuttamisen optimointi isäntä -DNA:n tulvassa näytteessä.

Kun DNA on uutettu, tutkijat monistavat usein yhden palan DNA:ta kaikista näytteen organismeista. Tämä DNA -pala on säilynyt eri kiinnostuksen kohteena olevien lajien välillä, mutta se on tarpeeksi erilainen eri lajien välillä luonnehtimaan näytteen monimuotoisuutta. Yksi yleisimmistä bakteerien tutkimiskohteista; 16S ribosomaalinen RNA-geeni; on myös läsnä kasvien kloroplasteissa. Joten vaikka tämä monistusmenetelmä toimii hyvin erottaessaan isännän mikrobista ihmisen ja ympäristönäytteissä, se silti tuottaa isännän kontaminaatiota (kloroplastin monistamisen kautta) kasvinäytteissä.

Wallace ja hänen tiiminsä vertailivat neljää yleistä kaupallisesti saatavilla olevaa DNA:n uuttomenetelmää:DNeasy Plant (Qiagen), Nopea DNA (Zymo), Extract-N-vahvistin (Sigma-Aldrich), ja Power Soil Kit (Qiagen). He tarkastelivat myös neljää erilaista monistusmenetelmää, jotka kohdistuvat 16S -ribosomaalisen RNA -geenin tiettyihin alueisiin sen määrittämiseksi, mikä menetelmä teki parhaan työn isäntä -DNA:n sulkemiseksi pois säilyttäen samalla mikrobisen DNA:n.

Yksi tapa, jolla tutkijat voivat valita isäntä -DNA:ta vastaan, on muokata monistusprosessia. Wallace ja hänen kollegansa tarkastelivat molekyylipuristimien lisäämistä, jotka puristaisivat kloroplastia ja mitokondrioiden DNA:ta, oleellisesti estäen ei -toivotun DNA:n monistumisen. He yrittivät myös monistaa 16S -geenin eri aluetta, joka syrjisi kloroplastia ja mitokondrioita, mikä johtaisi mikrobiomin monistuneempaan DNA:han. Heidän viimeisessä menetelmässään monistusprosessin optimoimiseksi käytettiin sekvenssejä, jotka "myrkyttävät" ei -toivottua DNA:ta, joten sitä ei voida monistaa edelleen.

Tämä prosessi on samanlainen kuin useiden reittien ottaminen työmatkalla. Jokaisella voi olla päällekkäisiä maisemia, mutta myös ainutlaatuisia ominaisuuksia; yksi voi olla kauniimpi, yksi nopeampi, toinen stressaavampi. Wallacen tutkimuksessa he voisivat käyttää erilaisia ​​uuttamis- ja monistusreittejä verratakseen kuinka menetelmien 'miten' vaikuttaa kokonaistuloksiin. Vaikka useimmat tutkijat tietävät, että heidän menetelmiinsä liittyy puolueellisuutta, tämä oli suora rinnakkaisvertailu, joka osoitti, kuinka jokainen menetelmä tuotti erilaisia ​​tuloksia ja muutti näytteen kokonaiskoostumusta.

Tämän tutkimuksen pitäisi auttaa ihmisiä tekemään parhaita valintoja siitä, miten he käyttävät aikaa ja rahaa mikrobiomitutkimukseen. "

Jason G. Wallace

Wallace korosti, ettei ole olemassa "täydellistä menetelmää", ja jopa tutkimuksensa aikana jotkut menetelmät toimivat paremmin joillekin otostyypeille, mutta eivät toisille. Nämä tiedot antavat tutkijoille tietoa tehdä parempia päätöksiä menetelmistään. Jopa paras menetelmä tässä ei ehkä ole paras menetelmä tietyille hankkeille, näytteet, tyypit, tai budjetteja. Yritykset pyrkivät jatkuvasti optimoimaan tuotteitaan, joten tästä haasteesta tulee toivottavasti helpompi tutkijoille.

Ennenkaikkea, Tämä tutkimus ajaa kotiin, että menetelmissä on eroja, jotka voivat vaikuttaa tuloksiin. Ei ole olemassa "täydellistä menetelmää". Tutkijoiden tehtävänä on ymmärtää näytteidensä vivahteet ja valita paras menetelmä tieteelliseen kysymykseen, jota he toivovat voivansa käsitellä. Vaikka kaikki tiet voivat johtaa tulokseen, kokeilu 'miten' voi olla vaivan arvoista löytää paras reitti mikrobiomitutkimukselle. "Tämä ei ole paradigman muutos, mutta se on yksi pienistä, lisämuutokset, jotka auttavat meitä tekemään tutkimusta hieman paremmin, ja ajan myötä niistä tulee melko suuria parannuksia, "selittää Wallace.

• Perheiden sosioekonominen asema voi vaikuttaa lasten suoliston mikrobiomikoostumukseen
• Emotionaalinen tuki ja sietokyky voivat auttaa lieventämään pandemian psykologisia vaikutuksia