Estudo compara os métodos de extração e amplificação de DNA usados ​​para pesquisa de microbioma

Vamos encarar, somos uma sociedade voltada para resultados. Muito focado no resultado, as pessoas nem sempre pensam no "como". Por exemplo, você pensou sobre "como" você começou a trabalhar esta manhã ou você acabou de chegar lá? Em estudos de microbioma, os resultados são os gráficos e os dados, mas o "como, "como se locomover, geralmente é apenas parte de uma rotina.

Contudo, um aspecto fundamental da análise de microbiomas (independentemente do hospedeiro) depende de métodos de extração e amplificação de DNA. Dezenas de métodos de extração de DNA atualmente no mercado são, cada um, capaz de extrair DNA e produzir resultados confiáveis, mas cada um tem um "como" ligeiramente diferente. Os laboratórios costumam ter seu kit "go-to" selecionado pelo líder do laboratório e passado de geração em geração de alunos de pós-graduação. E depois de escolher um método, é melhor segui-lo simplesmente porque todos sabem que um kit diferente produzirá resultados ligeiramente diferentes. Mas qual método é o melhor? Como você escolhe? Quanto o "como" realmente afeta os resultados? E quando você deve mudar?

O design experimental e a coleta de amostras são geralmente discutidos detalhadamente no início de qualquer projeto, ainda assim, os métodos de extração de DNA são freqüentemente esquecidos. Esse viés crescente de ignorar a importância do método de extração de DNA tornou-se a questão central para a pesquisadora Cecelia Giangacomo e seu conselheiro Jason G. Wallace em seu último Phytobiomes Journal publicação, "Comparando DNA Extraction and 16S rRNA Gene Amplification Methods For Plant-Associated Bacterial Communities." Wallace afirma, "Esta pesquisa nos permite saber os métodos melhores / mais eficazes no futuro. Nosso laboratório faz muitos trabalhos de microbioma vegetal, por isso, queremos ter certeza de que estamos usando bem esses recursos. Fiquei realmente surpreso que ninguém tivesse feito isso antes, portanto, esperamos que outros laboratórios o considerem útil. "

Os kits de extração de DNA são projetados para serem de amplo espectro para trabalhar tanto para micróbios quanto para seu hospedeiro. Na maioria dos projetos de microbioma de planta, haverá uma quantidade mínima de DNA microbiano em comparação com o hospedeiro. Assim, o maior desafio no sequenciamento do microbioma é otimizar a extração do DNA microbiano no dilúvio de DNA do hospedeiro dentro de uma amostra.

Uma vez que o DNA é extraído, os pesquisadores freqüentemente amplificam um único pedaço de DNA de todos os organismos da amostra. Este pedaço de DNA é conservado em várias espécies de interesse, mas é diferente o suficiente entre as espécies para caracterizar a diversidade dentro da amostra. Um dos alvos mais comuns para pesquisar bactérias - o gene do RNA ribossômico 16S - também está presente em cloroplastos de plantas. Portanto, embora esse método de amplificação funcione bem na separação do hospedeiro do micróbio em amostras humanas e ambientais, ele ainda produz contaminação do hospedeiro (por meio da amplificação do cloroplasto) em amostras de plantas.

Wallace e sua equipe compararam quatro métodos comuns de extração de DNA disponíveis no mercado:DNeasy Plant (Qiagen), DNA rápido (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), e Power Soil Kit (Qiagen). Eles também analisaram quatro métodos de amplificação diferentes que têm como alvo regiões específicas do gene do RNA ribossômico 16S para determinar qual método fez o melhor trabalho de excluir o DNA do hospedeiro enquanto preservava o DNA microbiano.

Uma das maneiras pelas quais os pesquisadores podem selecionar contra o DNA do hospedeiro é através da modificação do processo de amplificação. Wallace e seus colegas analisaram a adição de grampos moleculares que restringiriam o cloroplasto e o DNA mitocondrial, essencialmente bloqueando a amplificação de DNA indesejado. Eles também tentaram amplificar uma região diferente do gene 16S que discriminaria o cloroplasto e as mitocôndrias, levando a um DNA mais amplificado do microbioma. Seu método final de otimizar o processo de amplificação usou sequências que "envenenam" o DNA indesejado, de forma que ele não pode ser amplificado posteriormente.

Esse processo é análogo a fazer vários trajetos em seu trajeto. Cada um pode ter alguns cenários sobrepostos, mas também atributos únicos; um pode ser mais cênico, um mais rápido, outro mais estressante. Na pesquisa de Wallace, eles poderiam usar as várias rotas de extração e amplificação para comparar como o "como" dos métodos afeta os resultados gerais. Embora a maioria dos pesquisadores saiba que há preconceito em seus métodos, esta foi uma comparação direta lado a lado, mostrando como cada método produziu resultados diferentes e mudou a composição geral da amostra.

Este estudo deve ajudar as pessoas a fazerem as melhores escolhas em termos de como gastar seu tempo e dinheiro em pesquisas de microbiomas. "

Jason G. Wallace

Wallace enfatizou que não existe um "método perfeito", e mesmo dentro de seu estudo, alguns métodos funcionaram melhor para alguns tipos de amostra, mas não para outros. Esses dados fornecem aos pesquisadores o conhecimento para tomar decisões mais bem informadas sobre seus métodos. Mesmo o melhor método aqui pode não ser o melhor método para projetos específicos, amostras, tipos, ou orçamentos. As empresas estão constantemente tentando otimizar seus produtos, portanto, à medida que avançamos, esse desafio se tornará mais fácil para os pesquisadores.

Mais importante, esta pesquisa mostra que existem diferenças entre os métodos que podem impactar os resultados. Não existe um "método perfeito". Cabe aos pesquisadores entender as nuances de suas amostras e escolher o melhor método para a questão científica que desejam abordar. Portanto, embora todos os caminhos possam levar a um resultado, experimentar o "como" pode valer o esforço para encontrar a melhor rota para a pesquisa do microbioma. "Esta não é uma mudança de paradigma, mas é um dos pequenos, mudanças incrementais que nos ajudam a pesquisar um pouco melhor, e com o tempo isso se soma a grandes melhorias, "explica Wallace.

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