Imidlertid, et grundlæggende aspekt ved analyse af mikrobiomer (uanset værten) er afhængig af DNA -ekstraktions- og amplifikationsmetoder. Snesevis af DNA -ekstraktionsmetoder, der i øjeblikket er på markedet, er hver i stand til at udtrække DNA og producere velrenommerede resultater, men hver har et lidt anderledes "hvordan". Labs har ofte deres "go-to" kit udvalgt af laboratorielederen og overført fra generation til generation af kandidatstuderende. Og når du først har valgt en metode, er det bedst at holde sig til den metode, simpelthen fordi alle ved, at et andet kit vil give lidt forskellige resultater. Men hvilken metode er den bedste? Hvordan vælger du? Hvor meget påvirker "hvordan" virkelig resultaterne? Og hvornår skal du skifte?
Eksperimentelt design og prøvesamling diskuteres normalt i stor længde i starten af ethvert projekt, alligevel overses DNA -ekstraktionsmetoder ofte. Denne truende bias om at ignorere vigtigheden af DNA -ekstraktionsmetoden blev det centrale spørgsmål for forsker Cecelia Giangacomo og hendes rådgiver Jason G. Wallace i deres seneste Phytobiomes Journal offentliggørelse, "Sammenligning af DNA-ekstraktion og 16S rRNA-genforstærkningsmetoder til planteassocierede bakteriesamfund." Wallace siger, "Denne forskning lader os kende de bedste/mest effektive metoder fremover. Vores laboratorium laver meget plantemikrobiomarbejde, så vi vil sikre os, at vi bruger disse ressourcer godt. Jeg var faktisk overrasket over, at ingen havde gjort dette før, så vi håber, at andre laboratorier finder det nyttigt. "
DNA -ekstraktionssæt er designet til at have et bredt spektrum til at fungere for både mikrober og deres vært. I de fleste plante-mikrobiomprojekter vil der være en lille mængde mikrobielt DNA sammenlignet med værten. Dermed, den største udfordring i mikrobiomsekventering er at optimere ekstraktionen af det mikrobielle DNA i syndfloden af værts -DNA i en prøve.
Når DNA er ekstraheret, forskere vil ofte forstærke et enkelt stykke DNA fra alle organismerne i prøven. Dette stykke DNA er bevaret på tværs af forskellige arter af interesse, men er forskelligt nok mellem arterne til at karakterisere mangfoldigheden i prøven. Et af de mest almindelige mål for undersøgelse af bakterier-; det 16S ribosomale RNA-gen-; er også til stede i plantens kloroplaster. Så selvom denne amplifikationsmetode fungerer godt ved at adskille vært fra mikrobe i humane og miljømæssige prøver, producerer den stadig værtskontaminering (gennem amplifikation af chloroplast) i planteprøver.
Wallace og hans team sammenlignede fire almindelige kommercielt tilgængelige DNA -ekstraktionsmetoder:DNeasy Plant (Qiagen), Hurtigt DNA (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), og Power Soil Kit (Qiagen). De kiggede også på fire forskellige amplifikationsmetoder, der er målrettet mod specifikke regioner i 16S -ribosomalt RNA -genet for at bestemme, hvilken metode der udførte det bedste job med at ekskludere værts -DNA, samtidig med at det mikrobielle DNA blev bevaret.
En måde forskere kan vælge mod vært -DNA på er ved at ændre amplifikationsprocessen. Wallace og hans kolleger kiggede på tilføjelse af molekylære klemmer, som ville klemme ned på chloroplast og mitokondrielt DNA, i det væsentlige blokerer amplifikation af uønsket DNA. De forsøgte også at amplificere en anden region af 16S -genet, der ville diskriminere kloroplast og mitokondrier, hvilket ville føre til mere amplificeret DNA af mikrobiomet. Deres sidste metode til optimering af amplifikationsprocessen brugte sekvenser, der "forgiftede" uønsket DNA, så det ikke kan amplificeres yderligere.
Denne proces er analog med at tage flere ruter på din pendling. Hver kan have nogle overlappende scenerier, men også unikke attributter; man kan være mere naturskøn, en hurtigere, en anden mere stressende. I Wallaces forskning kunne de bruge de forskellige ekstraktions- og amplifikationsveje til at sammenligne, hvordan metodernes 'hvordan' påvirker de samlede resultater. Mens de fleste forskere ved, at der er skævhed i deres metoder, dette var en direkte sammenligning side om side, der viste, hvordan hver metode frembragte forskellige resultater og ændrede prøvens samlede sammensætning.
Denne undersøgelse skal hjælpe folk med at træffe de bedste valg med hensyn til, hvordan de skal bruge deres tid og penge til mikrobiomforskning. "
Jason G. Wallace
Wallace understregede, at der ikke er nogen "perfekt metode", og selv inden for deres undersøgelse fungerede nogle metoder bedre for nogle prøvetyper, men ikke for andre. Disse data giver forskere viden til at træffe bedre informerede beslutninger vedrørende deres metoder. Selv den bedste metode her er muligvis ikke den bedste metode til specifikke projekter, prøver, typer, eller budgetter. Virksomheder forsøger hele tiden at optimere deres produkter, så efterhånden som vi går videre, bliver denne udfordring forhåbentlig lettere for forskere.
Mest vigtigt, denne forskning driver hjem, at der er forskelle mellem metoder, der kan påvirke resultaterne. Der er ingen "perfekt metode". Det er op til forskerne at forstå nuancerne i deres prøver og vælge den bedste metode til det videnskabelige spørgsmål, de håber at løse. Så selvom alle veje kan føre til et resultat, at eksperimentere med 'hvordan' kan være indsatsen værd for at finde den bedste vej til mikrobiomforskning. "Dette er ikke et paradigmeskifte, men det er en af de små, inkrementelle ændringer, der hjælper os med at forske lidt bedre, og med tiden udgør disse temmelig store forbedringer, "forklarer Wallace.
Forskere finder en ny måde at beskytte mod sygdom i MS -modellen
Nyt forsøg viser forbedret overlevelse for patienter med avanceret kolorektal BRAF-mutant kræft
Rotavirus -vaccination er ikke forbundet med risiko for type 1 -diabetes mellitus
Lungemikrober kan hjælpe med at forudsige resultater hos alvorligt syge
Nyopdagede store fager slører grænsen mellem liv og ikke-liv
Hvorfor har jeg brug for en koloskopi?
Ny forskning identificerer en forbindelse mellem tarmmikrobiomet og slagtilfælde
En nylig undersøgelse foretaget på Cleveland Clinic demonstrerer virkningen af kost, der er højt i cholin, som ofte findes i store mængder i rødt kød og æggeblommer, og trimethylamin om stigende sla
Sædmikrobiom afsløret med RNA -sekventering
En ny undersøgelse rapporterer den første nogensinde detaljerede beskrivelse af det menneskelige sædmikrobiom, ved hjælp af nyere RNA -sekventeringsteknikker, der er i stand til at skelne mellem sæd -
Undersøgelse afslører antivirale virkninger af curcumin
Curcumin, en naturlig forbindelse, der findes i krydderi gurkemeje, kan hjælpe med at fjerne visse vira, forskning har fundet. En undersøgelse offentliggjort i Journal of General Virology viste, a