Studie vergelijkt DNA-extractie- en amplificatiemethoden die worden gebruikt voor microbioomonderzoek

Laten we eerlijk zijn, we zijn een resultaatgerichte samenleving. Te gefocust op het resultaat, mensen denken niet vaak na over het 'hoe'. Bijvoorbeeld, heb je nagedacht over "hoe" je vanmorgen op je werk bent gekomen of ben je er net aangekomen? In microbioomstudies zijn de resultaten de grafieken en de gegevens, maar het "hoe, "zoals woon-werkverkeer, is vaak slechts een onderdeel van een routine.

Echter, een fundamenteel aspect van het analyseren van microbiomen (ongeacht de gastheer) is afhankelijk van DNA-extractie- en amplificatiemethoden. Tientallen DNA-extractiemethoden die momenteel op de markt zijn, zijn elk in staat om DNA te extraheren en gerenommeerde resultaten te produceren, maar elk heeft een iets ander 'hoe'. Labs hebben vaak hun "go-to" -kit geselecteerd door de lableider en doorgegeven van generatie op generatie van afgestudeerde studenten. En als je eenmaal een methode hebt gekozen, is het het beste om je aan die methode te houden, simpelweg omdat iedereen weet dat een andere kit iets andere resultaten zal opleveren. Maar welke methode is de beste? Hoe kies je? Hoeveel invloed heeft het "hoe" echt op de resultaten? En wanneer moet je overstappen?

Experimenteel ontwerp en monsterverzameling worden meestal uitgebreid besproken aan het begin van een project, toch worden DNA-extractiemethoden vaak over het hoofd gezien. Deze dreigende vooringenomenheid van het negeren van het belang van de DNA-extractiemethode werd de centrale vraag voor onderzoeker Cecelia Giangacomo en haar adviseur Jason G. Wallace in hun laatste Phytobiomes Journal publicatie, "Het vergelijken van DNA-extractie en 16S rRNA-genamplificatiemethoden voor plant-geassocieerde bacteriële gemeenschappen." Wallace stelt, "Dit onderzoek laat ons weten wat de beste/meest effectieve methoden zijn voor de toekomst. Ons laboratorium doet veel werk aan het plantenmicrobioom, dus we willen ervoor zorgen dat we die middelen goed gebruiken. Ik was eigenlijk verbaasd dat niemand dit eerder had gedaan, dus we hopen dat andere laboratoria het nuttig vinden."

DNA-extractiekits zijn ontworpen om breed spectrum te zijn om te werken voor zowel microben als hun gastheer. In de meeste plant-microbioomprojecten zal er een minieme hoeveelheid microbieel DNA zijn in vergelijking met de gastheer. Dus, de grootste uitdaging bij microbioomsequencing is het optimaliseren van de extractie van het microbiële DNA in de stortvloed van gastheer-DNA in een monster.

Zodra het DNA is geëxtraheerd, onderzoekers zullen vaak een enkel stuk DNA van alle organismen in het monster versterken. Dit stukje DNA is geconserveerd over verschillende soorten van belang, maar is verschillend genoeg tussen soorten om de diversiteit binnen het monster te karakteriseren. Een van de meest voorkomende doelen om bacteriën te onderzoeken - het 16S ribosomale RNA-gen - is ook aanwezig in chloroplasten van planten. Dus hoewel deze methode van amplificatie goed werkt bij het scheiden van gastheer en microbe in menselijke en omgevingsmonsters, produceert het nog steeds gastheerverontreiniging (door amplificatie van chloroplast) in plantenmonsters.

Wallace en zijn team vergeleken vier gangbare commercieel beschikbare DNA-extractiemethoden:DNeasy Plant (Qiagen), Snel DNA (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), en Power Soil Kit (Qiagen). Ze keken ook naar vier verschillende amplificatiemethoden die gericht zijn op specifieke regio's van het 16S-ribosomale RNA-gen om te bepalen welke methode het beste het gastheer-DNA uitsluit met behoud van het microbiële DNA.

Een manier waarop onderzoekers tegen gastheer-DNA kunnen selecteren, is door het amplificatieproces aan te passen. Wallace en zijn collega's keken naar het toevoegen van moleculaire klemmen die chloroplast en mitochondriaal DNA zouden vastklemmen, blokkeert in wezen de amplificatie van ongewenst DNA. Ze probeerden ook een ander gebied van het 16S-gen te versterken dat onderscheid zou maken tussen chloroplasten en mitochondriën, wat zou leiden tot meer versterkt DNA van het microbioom. Hun laatste methode om het amplificatieproces te optimaliseren, gebruikte sequenties die ongewenst DNA "vergiftigen", zodat het niet verder kan worden geamplificeerd.

Dit proces is analoog aan het nemen van meerdere routes tijdens uw woon-werkverkeer. Elk kan een overlappend landschap hebben, maar ook unieke attributen; de ene is misschien meer schilderachtig, een sneller, een ander meer stressvol. In het onderzoek van Wallace konden ze de verschillende extractie- en amplificatieroutes gebruiken om te vergelijken hoe het 'hoe' van de methoden de algemene resultaten beïnvloedt. Hoewel de meeste onderzoekers weten dat hun methoden vooringenomen zijn, dit was een directe zij-aan-zij vergelijking die liet zien hoe elke methode verschillende resultaten opleverde en de algehele samenstelling van het monster veranderde.

Deze studie moet mensen helpen de beste keuzes te maken als het gaat om het besteden van hun tijd en geld aan microbioomonderzoek."

Jason G. Wallace

Wallace benadrukte dat er geen "perfecte methode" is, en zelfs binnen hun onderzoek werkten sommige methoden beter voor sommige soorten monsters, maar niet voor andere. Deze gegevens bieden onderzoekers de kennis om beter geïnformeerde beslissingen te nemen over hun methoden. Zelfs de beste methode hier is misschien niet de beste methode voor specifieke projecten, monsters, types, of budgetten. Bedrijven proberen voortdurend hun producten te optimaliseren, dus naarmate we verder komen, zal deze uitdaging hopelijk gemakkelijker worden voor onderzoekers.

Het belangrijkste is, dit onderzoek maakt duidelijk dat er verschillen zijn tussen methoden die de resultaten kunnen beïnvloeden. Er is geen 'perfecte methode'. Het is aan de onderzoekers om de nuances van hun monsters te begrijpen en de beste methode te kiezen voor de wetenschappelijke vraag die ze hopen te beantwoorden. Dus hoewel alle wegen tot een resultaat kunnen leiden, experimenteren met het 'hoe' kan de moeite waard zijn om de beste route voor microbioomonderzoek te vinden. "Dit is geen paradigmaverschuiving, maar het is een van de kleine, incrementele veranderingen die ons helpen om net iets beter onderzoek te doen, en na verloop van tijd vormen die samen behoorlijk grote verbeteringen, " legt Wallace uit.

• De sociaaleconomische status van het gezin kan de samenstelling van het darmmicrobioom van kinderen beïnvloeden
• Emotionele steun en veerkracht kunnen de psychologische effecten van de pandemie helpen verzachten