В исследовании сравниваются методы выделения ДНК и амплификации, используемые для исследования микробиома.

Давайте посмотрим правде в глаза, мы - общество, ориентированное на результат. Слишком сосредоточен на результате, люди не часто задумываются о том, «как». Например, Вы думали о том, «как» вы добрались до работы сегодня утром, или вы только что приехали? В исследованиях микробиома результаты представляют собой графики и данные, но "как, "люблю ездить на работу, часто бывает просто частью рутины.

Тем не мение, фундаментальный аспект анализа микробиомов (независимо от хозяина) основан на методах выделения и амплификации ДНК. Десятки методов экстракции ДНК, представленные в настоящее время на рынке, способны извлекать ДНК и давать надежные результаты. но у каждого есть несколько разное «как». Лаборатории часто выбирают свои «готовые» комплекты, выбираемые руководителем лаборатории и передаваемые из поколения в поколение аспирантов. И как только вы выберете метод, лучше придерживаться этого метода просто потому, что все знают, что другой набор даст немного разные результаты. Но какой метод лучше? Как выбрать? Насколько "как" действительно влияет на результаты? А когда нужно переходить?

Планирование эксперимента и сбор образцов обычно подробно обсуждаются в начале любого проекта. тем не менее, методы выделения ДНК часто упускаются из виду. Эта нависшая предвзятость игнорирования важности метода извлечения ДНК стала центральным вопросом для исследователя Сесилии Джангакомо и ее советника Джейсона Г. Уоллеса в их последних исследованиях. Журнал фитобиомов публикация «Сравнение методов экстракции ДНК и амплификации гена 16S рРНК для бактериальных сообществ, ассоциированных с растениями». Уоллес заявляет:«Это исследование позволяет нам узнать о лучших / наиболее эффективных методах в будущем. Наша лаборатория выполняет большую работу по изучению микробиома растений, поэтому мы хотим убедиться, что мы правильно используем эти ресурсы. Я был действительно удивлен, что никто не делал этого раньше, так что мы надеемся, что другие лаборатории сочтут это полезным ".

Наборы для экстракции ДНК предназначены для широкого спектра действия как для микробов, так и для их хозяина. В большинстве проектов микробиома растений будет мизерное количество микробной ДНК по сравнению с хозяином. Таким образом, Самая большая проблема при секвенировании микробиома - оптимизация извлечения микробной ДНК из потока ДНК хозяина в образце.

После извлечения ДНК Исследователи часто усиливают один фрагмент ДНК всех организмов в образце. Этот фрагмент ДНК сохраняется у разных представляющих интерес видов, но достаточно различается между видами, чтобы характеризовать разнообразие в образце. Одна из наиболее распространенных целей для исследования бактерий - гена рибосомной РНК 16S - также присутствует в хлоропластах растений. Таким образом, хотя этот метод амплификации хорошо работает для отделения хозяина от микробов в образцах человека и окружающей среды, он все же вызывает заражение хозяина (посредством амплификации хлоропластов) в образцах растений.

Уоллес и его команда сравнили четыре распространенных коммерчески доступных метода экстракции ДНК:DNeasy Plant (Qiagen), Быстрая ДНК (Zymo), Экстракт-N-Amp (Sigma-Aldrich), и комплект Power Soil (Qiagen). Они также рассмотрели четыре различных метода амплификации, нацеленных на определенные области гена рибосомной РНК 16S, чтобы определить, какой метод лучше всего исключает ДНК хозяина при сохранении микробной ДНК.

Один из способов, которым исследователи могут выбирать ДНК хозяина, - это модифицировать процесс амплификации. Уоллес и его коллеги рассматривали возможность добавления молекулярных зажимов, которые зажимали бы хлоропластную и митохондриальную ДНК. по существу блокирует амплификацию нежелательной ДНК. Они также попытались амплифицировать другую область гена 16S, которая будет отличать хлоропласты и митохондрии, что приведет к большей амплификации ДНК микробиома. В их последнем методе оптимизации процесса амплификации использовались последовательности, которые «отравляют» нежелательную ДНК, поэтому ее нельзя амплифицировать дальше.

Этот процесс аналогичен выбору нескольких маршрутов по дороге на работу. У каждого может быть несколько перекрывающихся пейзажей, но также и уникальные атрибуты; можно быть более живописным, один быстрее, другой более напряженный. В исследовании Уоллеса они могли использовать различные способы извлечения и амплификации, чтобы сравнить, как «как» методов влияет на общие результаты. Хотя большинство исследователей знают, что их методы имеют предвзятость, это было прямое параллельное сравнение, показывающее, как каждый метод дает разные результаты и изменяет общий состав образца.

<цитата>

Это исследование должно помочь людям сделать лучший выбор с точки зрения того, как тратить свое время и деньги на исследования микробиома ".

Джейсон Дж. Уоллес

Уоллес подчеркнул, что не существует «идеального метода», и даже в рамках их исследования некоторые методы работали лучше для одних типов выборок, но не для других. Эти данные позволяют исследователям принимать более обоснованные решения в отношении своих методов. Даже лучший метод здесь может оказаться не лучшим для конкретных проектов. образцы, типы, или бюджеты. Компании постоянно пытаются оптимизировать свои продукты, Надеемся, что по мере продвижения вперед исследователям станет легче решать эту задачу.

Самое главное, Это исследование показывает, что существуют различия между методами, которые могут повлиять на результаты. Не существует «идеального метода». Задача исследователей - понять нюансы своих образцов и выбрать лучший метод для научного вопроса, который они надеются решить. Итак, хотя все дороги могут привести к результату, Эксперименты с «как» могут стоить усилий, чтобы найти лучший способ исследования микробиома. "Это не смена парадигмы, но это один из маленьких, инкрементальные изменения, которые помогают нам проводить исследования чуть лучше, и со временем это приводит к довольно большим улучшениям, "объясняет Уоллес.

• Социально-экономический статус семьи может влиять на состав кишечного микробиома детей
• Эмоциональная поддержка и устойчивость могут помочь смягчить психологические последствия пандемии.