El estudio compara los métodos de amplificación y extracción de ADN utilizados para la investigación del microbioma

Seamos sinceros, somos una sociedad impulsada por los resultados. Demasiado concentrado en el resultado, la gente no suele pensar en el "cómo". Por ejemplo, ¿Pensaste en "cómo" llegaste al trabajo esta mañana o simplemente llegaste allí? En los estudios de microbioma, los resultados son los gráficos y los datos, pero el "cómo, "como ir al trabajo, a menudo es solo parte de una rutina.

Sin embargo, Un aspecto fundamental del análisis de microbiomas (independientemente del anfitrión) se basa en los métodos de extracción y amplificación de ADN. Docenas de métodos de extracción de ADN actualmente en el mercado son capaces de extraer ADN y producir resultados confiables. pero cada uno tiene un "cómo" ligeramente diferente. Los laboratorios a menudo tienen su kit "de referencia" seleccionado por el líder del laboratorio y transmitido de generación en generación de estudiantes graduados. Y una vez que elija un método, es mejor ceñirse a ese método simplemente porque todos saben que un kit diferente producirá resultados ligeramente diferentes. ¿Pero cuál es el mejor método? ¿Cómo eliges? ¿Cuánto afecta realmente el "cómo" a los resultados? ¿Y cuándo deberías cambiar?

El diseño experimental y la recolección de muestras generalmente se discuten extensamente al comienzo de cualquier proyecto, sin embargo, los métodos de extracción de ADN a menudo se pasan por alto. Este sesgo inminente de ignorar la importancia del método de extracción de ADN se convirtió en la pregunta central para la investigadora Cecelia Giangacomo y su asesor Jason G. Wallace en su último Diario de fitobiomas publicación, "Comparación de métodos de amplificación de genes de ARNr 16S y extracción de ADN para comunidades bacterianas asociadas a plantas". Wallace afirma, "Esta investigación nos permite conocer los métodos mejores y más efectivos en el futuro. Nuestro laboratorio realiza una gran cantidad de trabajo sobre microbiomas vegetales, por lo que queremos asegurarnos de que estamos utilizando bien esos recursos. De hecho, me sorprendió que nadie hubiera hecho esto antes, por lo que esperamos que otros laboratorios lo encuentren útil ".

Los kits de extracción de ADN están diseñados para ser de amplio espectro para funcionar tanto con microbios como con su anfitrión. En la mayoría de los proyectos de microbiomas vegetales, habrá una cantidad mínima de ADN microbiano en comparación con el huésped. Por lo tanto, el mayor desafío en la secuenciación del microbioma es optimizar la extracción del ADN microbiano en el diluvio de ADN del huésped dentro de una muestra.

Una vez que se extrae el ADN, Los investigadores a menudo amplifican una sola pieza de ADN de todos los organismos de la muestra. Este fragmento de ADN se conserva en varias especies de interés, pero es lo suficientemente diferente entre las especies para caracterizar la diversidad dentro de la muestra. Uno de los objetivos más comunes para estudiar las bacterias, el gen del ARN ribosómico 16S, también está presente en los cloroplastos de las plantas. Entonces, si bien este método de amplificación funciona bien para separar el huésped del microbio en muestras humanas y ambientales, todavía produce contaminación del huésped (a través de la amplificación del cloroplasto) en muestras de plantas.

Wallace y su equipo compararon cuatro métodos comunes de extracción de ADN disponibles comercialmente:DNeasy Plant (Qiagen), ADN rápido (Zymo), Extracto-N-Amp (Sigma-Aldrich), y Power Soil Kit (Qiagen). También analizaron cuatro métodos de amplificación diferentes que se dirigen a regiones específicas del gen del ARN ribosómico 16S para determinar qué método hizo el mejor trabajo para excluir el ADN del huésped y preservar el ADN microbiano.

Una forma en que los investigadores pueden seleccionar contra el ADN del huésped es modificando el proceso de amplificación. Wallace y sus colegas buscaron agregar abrazaderas moleculares que frenarían el cloroplasto y el ADN mitocondrial, esencialmente bloqueando la amplificación de ADN no deseado. También intentaron amplificar una región diferente del gen 16S que discriminaría contra el cloroplasto y las mitocondrias, lo que conduciría a un ADN más amplificado del microbioma. Su método final para optimizar el proceso de amplificación utilizó secuencias que "envenenan" el ADN no deseado para que no pueda amplificarse más.

Este proceso es análogo a tomar varias rutas en su viaje. Cada uno puede tener algunos escenarios superpuestos pero también atributos únicos; uno puede ser más pintoresco, uno más rápido, otro más estresante. En la investigación de Wallace, podrían usar las diversas rutas de extracción y amplificación para comparar cómo el "cómo" de los métodos afecta los resultados generales. Si bien la mayoría de los investigadores saben que sus métodos tienen sesgos, se trataba de una comparación directa en paralelo que mostraba cómo cada método producía resultados diferentes y cambiaba la composición general de la muestra.

Este estudio debería ayudar a las personas a tomar las mejores decisiones en términos de cómo gastar su tiempo y dinero en la investigación del microbioma ".

Jason G. Wallace

Wallace enfatizó que no existe un "método perfecto", e incluso dentro de su estudio, algunos métodos funcionaron mejor para algunos tipos de muestras pero no para otros. Estos datos proporcionan a los investigadores el conocimiento para tomar decisiones mejor informadas con respecto a sus métodos. Incluso el mejor método aquí puede no ser el mejor método para proyectos específicos, muestras, tipos, o presupuestos. Las empresas intentan constantemente optimizar sus productos, de modo que, a medida que avancemos, este desafío será más fácil para los investigadores.

Más importante, esta investigación lleva a casa que existen diferencias entre los métodos que pueden afectar los resultados. No existe un "método perfecto". Depende de los investigadores comprender los matices de sus muestras y elegir el mejor método para la pregunta científica que esperan abordar. Entonces, si bien todos los caminos pueden conducir a un resultado, experimentar con el "cómo" puede valer la pena el esfuerzo para encontrar la mejor ruta para la investigación del microbioma. "Este no es un cambio de paradigma, pero es uno de los pequeños cambios incrementales que nos ayudan a investigar un poco mejor, y, con el tiempo, se suman a mejoras bastante importantes, "explica Wallace.

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