Studie vergleicht DNA-Extraktions- und Amplifikationsmethoden für die Mikrobiomforschung

Seien wir ehrlich, Wir sind eine ergebnisorientierte Gesellschaft. Zu konzentriert auf das Ergebnis, Menschen denken nicht oft über das "Wie" nach. Zum Beispiel, hast du dir überlegt, "wie" du heute morgen zur arbeit gekommen bist oder bist du gerade erst gekommen? In Mikrobiomstudien sind die Ergebnisse die Grafiken und die Daten, aber das "Wie, "wie Pendeln, gehört oft nur zur Routine.

Jedoch, Ein grundlegender Aspekt der Analyse von Mikrobiomen (unabhängig vom Wirt) beruht auf DNA-Extraktions- und -Amplifikationsmethoden. Dutzende von DNA-Extraktionsmethoden, die derzeit auf dem Markt sind, sind jeweils in der Lage, DNA zu extrahieren und seriöse Ergebnisse zu erzielen. aber jeder hat ein etwas anderes "wie". Labore haben oft ihr "Go-to"-Kit, das vom Laborleiter ausgewählt und von Generation zu Generation von Doktoranden weitergegeben wird. Und wenn Sie sich einmal für eine Methode entschieden haben, ist es am besten, bei dieser Methode zu bleiben, einfach weil jeder weiß, dass ein anderes Kit etwas andere Ergebnisse liefert. Aber welche Methode ist die beste? Wie wählen Sie? Wie stark beeinflusst das „Wie“ die Ergebnisse wirklich? Und wann sollte man wechseln?

Experimentelles Design und Probensammlung werden in der Regel zu Beginn eines jeden Projekts ausführlich besprochen. dennoch werden DNA-Extraktionsmethoden oft übersehen. Diese drohende Tendenz, die Bedeutung der DNA-Extraktionsmethode zu ignorieren, wurde zur zentralen Frage der Forscherin Cecelia Giangacomo und ihres Beraters Jason G. Wallace in ihrem neuesten Phytobiomes Journal Veröffentlichung, "Vergleich von DNA-Extraktion und 16S rRNA-Genamplifikationsmethoden für pflanzenassoziierte Bakteriengemeinschaften." Wallace sagt, "Diese Forschung zeigt uns die besten/effektivsten Methoden für die Zukunft. Unser Labor arbeitet viel an Pflanzenmikrobiom, Daher möchten wir sicherstellen, dass wir diese Ressourcen gut nutzen. Ich war tatsächlich überrascht, dass das noch niemand getan hatte, Wir hoffen daher, dass andere Labore es nützlich finden."

DNA-Extraktionskits sind so konzipiert, dass sie ein breites Spektrum aufweisen, um sowohl für Mikroben als auch für ihren Wirt zu arbeiten. In den meisten Pflanzen-Mikrobiom-Projekten wird eine winzige Menge mikrobieller DNA im Vergleich zum Wirt vorhanden sein. Daher, Die größte Herausforderung bei der Mikrobiom-Sequenzierung besteht darin, die Extraktion der mikrobiellen DNA in der Flut von Wirts-DNA innerhalb einer Probe zu optimieren.

Sobald die DNA extrahiert wurde, Forscher amplifizieren oft ein einzelnes DNA-Stück von allen Organismen in der Probe. Dieses DNA-Stück ist bei verschiedenen interessierenden Arten konserviert, unterscheidet sich jedoch zwischen den Arten genug, um die Diversität innerhalb der Probe zu charakterisieren. Eines der häufigsten Ziele zur Untersuchung von Bakterien – das 16S ribosomale RNA-Gen – ist auch in Pflanzenchloroplasten vorhanden. Während also diese Amplifikationsmethode bei der Trennung von Wirt und Mikroben in menschlichen und Umweltproben gut funktioniert, erzeugt sie in Pflanzenproben immer noch eine Wirtskontamination (durch Amplifikation von Chloroplasten).

Wallace und sein Team verglichen vier gängige kommerziell erhältliche DNA-Extraktionsmethoden:DNeasy Plant (Qiagen), Schnelle DNA (Zymo), Extract-N-Amp (Sigma-Aldrich), und Power Soil Kit (Qiagen). Sie untersuchten auch vier verschiedene Amplifikationsmethoden, die auf bestimmte Regionen des 16S-ribosomalen RNA-Gens abzielen, um festzustellen, welche Methode die Wirts-DNA am besten ausschließt und gleichzeitig die mikrobielle DNA bewahrt.

Eine Möglichkeit, wie Forscher gegen Wirts-DNA selektieren können, besteht darin, den Amplifikationsprozess zu modifizieren. Wallace und seine Kollegen untersuchten das Hinzufügen von molekularen Klammern, die die Chloroplasten- und mitochondriale DNA festhalten würden. blockiert im Wesentlichen die Amplifikation unerwünschter DNA. Sie versuchten auch, eine andere Region des 16S-Gens zu amplifizieren, die Chloroplasten und Mitochondrien diskriminieren würde, was zu einer stärker amplifizierten DNA des Mikrobioms führte. Ihre letzte Methode zur Optimierung des Amplifikationsprozesses verwendet Sequenzen, die unerwünschte DNA "vergiften", damit sie nicht weiter amplifiziert werden kann.

Dieser Vorgang ist analog zum Nehmen mehrerer Routen auf Ihrem Weg zur Arbeit. Jeder kann einige überlappende Landschaften haben, aber auch einzigartige Attribute; man kann landschaftlich schöner sein, einer schneller, ein anderer stressiger. In Wallaces Forschung konnten sie die verschiedenen Extraktions- und Amplifikationswege nutzen, um zu vergleichen, wie sich das „Wie“ der Methoden auf die Gesamtergebnisse auswirkt. Während die meisten Forscher wissen, dass ihre Methoden voreingenommen sind, Dies war ein direkter Vergleich, der zeigte, wie jede Methode zu unterschiedlichen Ergebnissen führte und die Gesamtzusammensetzung der Probe veränderte.

Diese Studie soll den Menschen helfen, die besten Entscheidungen zu treffen, wie sie ihre Zeit und ihr Geld für die Mikrobiomforschung einsetzen."

Jason G. Wallace

Wallace betonte, dass es keine "perfekte Methode" gibt, und sogar innerhalb ihrer Studie funktionierten einige Methoden bei einigen Probentypen besser, bei anderen jedoch nicht. Diese Daten liefern Forschern das Wissen, um fundiertere Entscheidungen bezüglich ihrer Methoden zu treffen. Auch die beste Methode hier ist möglicherweise nicht die beste Methode für bestimmte Projekte, Proben, Typen, oder Budgets. Unternehmen versuchen ständig, ihre Produkte zu optimieren, Wenn wir also vorankommen, wird diese Herausforderung für die Forscher hoffentlich einfacher.

Am wichtigsten, Diese Forschung macht deutlich, dass es Unterschiede zwischen den Methoden gibt, die sich auf die Ergebnisse auswirken können. Es gibt keine "perfekte Methode". Es liegt an den Forschern, die Nuancen ihrer Proben zu verstehen und die beste Methode für die wissenschaftliche Fragestellung auszuwählen, die sie beantworten möchten. Während also alle Wege zu einem Ergebnis führen können, Das Experimentieren mit dem „Wie“ kann sich lohnen, um den besten Weg für die Mikrobiomforschung zu finden. „Das ist kein Paradigmenwechsel, aber es ist einer der kleinen, inkrementelle Änderungen, die uns helfen, die Forschung ein bisschen besser zu machen, und im Laufe der Zeit summieren sich diese zu ziemlich großen Verbesserungen, “ erklärt Wallace.

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