Zaviralnih miR-24 zadržuje v želodcu napredovanje raka, ki ga downregulating RegIV

Zaviralnih miR-24 zadržuje v želodcu napredovanje raka, ki ga downregulating RegIV
Abstract
Ozadje
so microRNAs majhne nekodirano RNA, ki uravnavajo različne celične procese, ki jih ureja več ciljev, ki lahko spodbujajo ali zavirajo razvoj malignih vedenja . Kopičijo dokazi kažejo miR-24 igra pomembno vlogo v človeški rakotvornost. Vendar pa je njegova natančna biološka vloga je še vedno v veliki meri nedosegljiva. Ta študija je preučila vlogo miR-24 v raka želodca (GC).
Metode
izraz miR-24 v GC tkiva v primerjavi z ujemanjem ne-tumorskih tkiv in GC celic je bilo mogoče zaznati s QRT-PCR. Sintetična kratki enojne ali dvojne RNA oligonukleotidi in lentivirusni vektorji so bili uporabljeni za urejanje miR-24 izraz v GC celicah raziskati svojo funkcijo in vitro
in vivo
.
Rezultati
miR-24 signifikantno navzdol reguliranih v GC tkivih primerjavi z izravnanih non-tumorskih tkiv in je povezan z diferenciacijo tumorja. Zunajmaternična izraz miR-24 v SGC-7901 GC celic zatreti celično proliferacijo, migracijo in invazijo in vitro
kot tudi tumorogenosti vivo
z indukcijo aretacijo celic cikla v G0 /G1 fazi in spodbujanje apoptozo celic. Poleg tega smo identificirane RegIV kot cilj miR-24 in dokazalo, da miR-24 urejeno RegIV izražanje preko vezave svoje 3 'neprevedeno regijo.
Sklepi
MIR 24-funkcij, kot novega zaviralnih v PK in anti -oncogenic dejavnost lahko vključuje njegovo zaviranje ciljnega gena RegIV. Te ugotovitve kažejo na možnost za pokoj-24 kot terapevtski cilj v PK.
Ključne besede
miR-24 RegIV Rak želodca orožja Invasion metastaze Ozadje
rak želodca (GC) je ena od najpogostejših človekovih raka. Čeprav sta se incidenca in umrljivost po svetu zmanjšala v zadnjih 20 letih, GC še vedno uvršča kot četrti najpogostejši in drugi rak najbolj smrtonosno svetu [1]. Čeprav je raziskava v GC naredila velik napredek, molekularne mehanizme, povezane z GC še vedno ni v celoti pojasnjen.
MicroRNAs (miRNAs) so majhne nekodirano, dvojno vijačnico RNA molekule, ki lahko uravnavajo izražanje tarčnih genov, ki vplivajo na post- transkripcijske postopki, ki urejajo izražanje genov. miRNAs prepoznati ciljnih mRNK, ki temeljijo na popoln ali nepopoln sekvenčno dopolnjevanja in preprečuje nastajanje proteina z vezavo na neprevedene regije 3 '(UTR) ali okvirja odprtega bralnega (ORF) ciljne mRNA [2, 3]. miRNAs so dokazali, da deluje v celičnih procesov orožja in diferenciacije, vključno s prehodom epitelijske-mezenhimskih [4] in diferenciacijo endodermal človeških embrionalnih matičnih celic [5]. Poleg splošnih celičnih funkcij miRNA te molekule prav tako igrajo pomembno vlogo v različnih bolezni pri ljudeh. Več študije so pokazale, da je misregulation od miRNAs povezanih z rakom [6, 7], v katerem deluje bodisi kot onkogenov ali tumorskih dušilne člene. miRNAs Poročali so, da se vključijo v akutne mieloične levkemije, raka dojke, nedrobnoceličnega karcinoma pljuč, hepatocelularni karcinom, rak debelega črevesa, GC in drugih rakov [8-13]. Prekomerno ali downregulation od miRNAs vodi k raznolikosti izražanja proteinov, ki tako prispevajo k tumorigeneze s spreminjanjem proliferacije, angiogenezo in invazijo. Raziskovalci so ugotovili, da lahko Mirne izraz profili lahko uporabijo za razvrstitev človeške raka, in to ugotovitev je bila pred uporabo sel RNA profilov za razvrščanje slabo diferenciranih tumorjev [14, 15].
Aberrant ekspresijo specifičnih miRNAs v GC je bila smo že poročali, in je povezana z napredovanjem in prognozo GC [16-18]. Smo prej ugotovili, da miR-24, ki lahko služi kot tumorski supresorski skozi ciljnem mestu polimorfizma [19], je bil občutno navzdol reguliranih Mirne v GC celic in tkiv v primerjavi z ne-tumorskih tkiv. V tej študiji smo analizirali miR-24 stopenj izražanja v GC tkiva v primerjavi z ujemanjem non-tumorskih tkivih, in ocenil korelacije med stopnjo miR-24 in clinicopathologic parametrov. smo ovrednotili vpliv prekomerno miR-24 na rast in apoptozo SGC-7901 GC celice tako in vitro
in vivo
. Ugotavljali smo tudi biološki učinek downregulation Mir-24 izražanja na GC celic. Poleg tega smo ugotovili RegIV (regeneracijo-otočkov izvira družina, član 4) kot enega ciljnih genov miR-24. Mi hipotezo, da lahko miR-24 uredil invazijo in metastaze GC celic, ki jih neposredno ciljanje gen RegIV.
Rezultati
Čezmerno miR-24 zavira GC celično proliferacijo
Raziskovanje izraz miR-24 v GC, smo izvedli kvantitativno realnem času RT-PCR (QRT-PCR). Izražanje miR-24 je bila na splošno navzdol reguliranih v devetih GC celičnih linijah v primerjavi z imortaliziranih običajnih želodčne sluznice epitelijskih celic GES-1 (slika 1A). Izražanje miR-24 je dodatno preučiti QRT-PCR v tumorskih tkivih poveže in ne-tumorske tkiva od 63 bolnikov GC (slika 1B). Povprečna stopnja izraz miR-24 signifikantno navzdol reguliranih v tumorskih tkiv v primerjavi z izravnanih non-tumorskih tkiv (slika 1C). Skupaj ti rezultati zagotovil trdne dokaze, da je bila miR-24 precej navzdol reguliranih v GC. Slika 1 miR-24 je občutno navzdol reguliranih v GC in zaviral rast SGC-7901 celic. (A) Relativna izraz miR-24 v devetih celičnih linijah GC primerjavi z GES-1 s QRT-PCR treh neodvisnih poskusov določena (** p < 0,01, *** P < 0,001). (B) Relativna izraz miR-24 pri kirurških primerki 63 GC s QRT-PCR določena. Vse eksperimente smo izvedli v treh izvodih. Podatki so prikazani kot -ΔΔCT vrednot, S.D. niso prikazani. (C) Srednja vrednost in standardni odklon miR-24 stopnjah izražanja pri kirurških osebkov 63 GC tkiv in izravnanih non-tumorskih tkivih so prikazani. Podatki so predstavljeni kot vrednosti, 2-ΔCT (** P < 0,05). U6 snRNA je bila uporabljena za normalizacijo. (D) miR-24 inhibira rast SGC-7901 celice, ki jih WST zazna, medtem ko je anti-miR-24 povečana rast celic (* P < 0,05). Podatki so prikazani kot povprečje ± S.D. treh neodvisnih poskusov.
smo poleg pregleda korelacije med stopnjo ekspresije miR-24 in clinicopathologic dejavnikov v človeškem GC. Klinični in patološki značilnosti 63 bolnikov GC so navedeni v tabeli 1. Na relativnih razmerij izražanjem miR-24 /U6 = 1, so primeri razdeljeni v dve skupini: miR-24 visoko ekspresijo skupina (n = 29) in miR-24 nizko izraz skupina (n = 34). MIR-24 nizko izražanje skupine razstavljene bistveno manjše diferenciacije tumorja (P = 0,021). Vendar pa je stopnja izražanja miR-24 niso pokazali kakršne koli povezave z starost, spol, tumorja mestu, globine lokalne invazije, bezgavk metastaz, ali TNM stage.Table 1 Povezava med miR-24, raven izražanja in clinicopathologic spremenljivk 63 GC bolniki
Clinicopathologic parametri
miR-24 izraz
P vrednost
Visoko (n = 29)
Low (n = 34)

Spol

Male
17
21
0.799
Moški
12
13
Starost (leta)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
Tumor lokacija
Distalno tretji
8
8
0,310
Bližnji tretji
6
13
Proksimalni tretji
15
13
WHO razvrstitev
Adenokarcinom
25
28
0,155 karcinom
Signet obroč celic
1
5
mucinozni adenokarcinom
3
1
Diferenciacija
No, zmerno
15
8
0.021
Slabo
14.
26
uvrstitev BORRMANN
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
Lokalni invazija
T1 /T2
1
7
0,098
T3 /T4
28
27
limfnega vozla metastaze
št
6
4
0,535
Da
23
30
Distant metastaze
št
28
31
0,724
Da
1
3
fazi TNM

I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
Da bi raziskali biološko funkcijo miR-24 v razvoj in napredovanje GC smo transfektirali SGC-7901 celic z miR-24 posnema (SGC-7901 /miR-24) ali miR-24 inhibitor (SGC-7901 /anti-miR-24). Kot je prikazano v dodatni datoteki 1: Slika S1A in S1B, smo izbrali 100 nm kot primerni koncentraciji v nadaljnjih poskusih. Ektopična ekspresija miR-24 v SGC-7901 celic smo potrdili QRT-PCR. Dostavo, smo pregledali proliferacijo celic za WST testu. Čezmernim miR-24 inhibira stopnjo rasti SGC-7901 celic v primerjavi z miR nadzora transfekciji celic (P < 0,05), medtem ko anti-miR-24 povečala aktivnosti za rast celic (P < 0,05, slika 1D).
Čezmerno miR-24 zavira migracije in vdor GC celic
Nato smo ocenjevali učinek miR-24 na celični migraciji in invazije v PK. Cell migracije in invazijo testi so pokazali, da prekomerno miR-24 zatreti celične migracije (SGC-7901 /MIR-24 skupina, 63.0 ± 3,6 celic na polje; nadzor skupine, 126,3 ± 7,0 celic na polje; P < 0,05) in napad ( SGC-7901 /miR-24 skupina, 34,7 ± 2,1 celic na tem področju; kontrolna skupina, 63,7 ± 3,5 celic na polje; P < 0,05) (slika 2A, B). V nasprotju s tem, rasklapanje miR-24 znatno povečano migracijo celic (SGC-7901 /anti-miR-24 skupina, 182.3 ± 5,0 celic na tem področju; kontrolna skupina, 105,3 ± 3,8 celic na polje; P < 0,01) in invasion (SGC -7901 /anti-miR-24 skupino, 124,3 ± 3,8 celic na področju; kontrolna skupina, 62,7 ± 2,5 na področju P < 0,01) (slika 2A, C). Slika 2 miR-24 zaviral migracije in invazijo SGC-7901 celic. (A) Reprezentativni polja SGC-7901 celic v transwell testih. (B, C) Reprezentativni področja SGC-7901 celic v migracije in invazijo testov, oz. Povprečno število migracij in invazijo celic na polje iz treh neodvisnih poskusov (* P < 0,05, ** p < 0,01).
Čezmernim miR-24 spodbuja apoptozo GC celic in sproži ustavitev celičnega cikla v G0 /G1 faza
Glede na to, da je opaziti celično rast, lahko vplivajo na stopnjo apoptoze in napredovanju celičnega ciklusa, smo preučili učinke miR-24 na apoptozo in celični cikel in vivo
s pretočno citometrijo. Ugotovili smo, da je približno 12-15% od SGC-7901 /miR-24 celice razstavljeni morfološke značilnosti, značilne za apoptozo, vključno kondenziranega kromatina in jedrske razdrobljenosti ga Hoechst33342 barvanjem za vsebine DNK. V nasprotju s tem, ko predstavlja redko spontano apoptoze v SGC-7901 celic je SGC-7901 /anti-miR-24 skupina ni pokazala bistvenih sprememb, ki jih Hoechst33342 barvanja (slika 3A). Pretočna citometrija je pokazala, da je bila apoptotske mera /miR-24 celice SGC-7901 znatno povečal v primerjavi s kontrolnimi celicami (13,62% ± 1,25% v primerjavi z 6,15% ± 0,95%, oziroma; P < 0,01) in bistveno zmanjšal v SGC -7901 /anti-miR-24 v primerjavi s kontrolno skupino (3,92% ± 0,52% v primerjavi z 6,35% ± 0,83%, oziroma; P < 0,05). (slika 3B, D)
Za nadaljnjo pojasnitev mehanizma miR- 24-posredovano zaviranje rasti GC celic smo analize celičnega ciklusa izvedemo (slika 3C, E). Ob uravnavanjem miR-24, odstotek celic G0 /G1 fazi povečal s 40.51% ± 3,15% pri kontrolah na 72,24% ± 3,65% (P < 0,01), medtem ko rasklapanje miR-24 zmanjšala odstotek celic v G0 /G1 faza od 42.35% ± 2,78%, pri kontrolah na 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Slika 3 miR-24 inducirano celično apoptozo in G0 /G1 celičnega ciklusa zastoj. (A) Reprezentativni histogrami, ki prikazujejo jedrsko morfologijo SGC-7901 celic prehodno transfekcirajo s 100 Nm miR-24 posnema ali zaviralec in njihove kontrole (Hoechst33342 obarvanje, izvirna povečava 400 x). (B) Reprezentativni histogrami, ki prikazujejo apoptozo SGC-7901 celic prehodno transfekciji s 100 Nm miR-24 posnema ali zavira in njihovih kontrol. (C) Reprezentativni histogrami, ki prikazujejo celic cikel SGC-7901 celic prehodno transfekcirajo s 100 Nm miR-24 posnema ali inhibitor in njihove kontrole. (D, E) odstotek apoptotskih in G0 /G1 celic v fazi treh neodvisnih poskusov, povprečje ± SD (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV je ciljni gen miR-24
Za bolj natančno preučiti mehanizme miR-24 v GC, smo iskali ciljne kandidata genov, ki jih bioinformatika. TargetScan, miRBase Tatget in StarBase so bili uporabljeni za iskanje potencialnih tarč Mir-24. Med napovedanih ciljev, je RegIV opredeljena kot ena od ciljnih genov miR-24, in smo ugotovili eno potencialno miR-24 vezavno mesto v svoji 3'UTR (slika 4A). Dalje, smo pregledali izražanje RegIV v devetih GC celic in GES-1. Ugotovili smo, da je RegIV prekomerno v devetih GC celic v primerjavi z GES-1 in razstavljene inverzno ekspresijski vzorec v primerjavi z miR-24 (Dodatni spisu 2: Slika S2A in S2). Da bi raziskali, ali je 3'UTR RegIV mRNA funkcionalna cilj miR-24, so bile izvedene luciferazne novinar genske teste. Najprej smo ocenili aktivnost miR-24 (ali miR-nadzorni) co-transfektirali v SGC-7901 celic z Luc-RegIV plazmida ali Luc-RegIV-Mut plazmida (v katerem je mutiral domnevni miR-24 vezavno mesto), skupaj z PRL-TK plazmida, ki vsebuje Renilla luciferazno gen kot notranje kontrole (slika 4B). Celice co-transficirane z miR-24 pokazalo znatno zmanjšanje luciferazno aktivnost v primerjavi z miR-kontrolno skupino (P < 0,05). Vendar miR-24 co-transfektirana z Luc-RegIV-Mut plazmida ni pokazala pomembne razlike v reporter dejavnosti v primerjavi s celicami co-transfekciji s pokoj-kontrolo. Podobno, anti-miR-24 povečala luciferazno aktivnost divjega tipa Luc-RegIV, vendar ni imel nobenega vpliva na Luc-RegIV-Mut plazmida (slika 4C P < 0,05). Prav tako smo izvedli luciferaza reporterski gen testov v snu-16, da se zmanjša vpliv endogenega miR-24. Sprva je ektopična ekspresija miR-24 v snu-16 celic potrjena s QRT-PCR. Izraz miR-24 transfektirana z miR-24 posnema je približno 50-krat višja od tiste, miR-kontrolne skupine v snu-16 (P < 0,01), medtem ko so statistično značilne razlike pri transfekciji anti-miR-24 (Dodatne datoteke 3: Slika S3A). Celice co-transfektirane s pokoj-24 je pokazala znatno zmanjšanje luciferazne aktivnosti v primerjavi z miR-kontrolni skupini (P < 0,001), medtem ko statistično značilne razlike z anti-pokoj-24 transfekciji (Dodatna datoteka 3: Slika S3B in S3C) . Ti rezultati jasno pokazala, da 3'UTR RegIV vsebuje neposredne vezavna mesta za pokoj-24. Slika 4 miR-24 ciljni gen 3'UTR RegIV in imunskim barvanjem RegIV v želodčnih tkivih. (A) Shematski graf domnevnih vezavnih mest za miR-24 v RegIV 3'UTR. RegIV-mut kaže RegIV-3'UTR z mutacijo v MIR-24-vezavna mesta. (B) miR-24 posnema navzdol reguliranih aktivnost luciferaze reporterja vsebuje divjega tipa RegIV 3'UTR (* P &0.05), ne pa tudi reporterski z mutiranim RegIV 3'UTR. (C) Anti-miR-24 povečala luciferazno aktivnost divjega tipa Luc-RegIV (* P &0.05), vendar ni imel nobenega vpliva na mutant. (D) oseminštirideset ur po miR-24 posnemajo in nadzora transfekciji SGC-7901 celic, raven beljakovin RegIV je bistveno zmanjšala v primerjavi s pokoj-nadzora, kot je določeno z ELISA. Anti-miR-24 povečala ekspresijo RegIV primerjavi z anti-miR-kontrolo (* P &0.05, ** P < 0,01). (E) Štiriindvajset ur po miR-24 posnemajo ali zaviralci in določeni kontrolni transfekciji v SGC-7901 celic, ni bilo razlike v ravni mRNA za RegIV v primerjavi z MIR-nadzora, kot je določeno s QRT-PCR (P >0,05). Podatki so prikazani kot povprečje ± S.D. treh neodvisnih eksperimentov. (F) št izraz RegIV je bila odkrita v normalnem želodčne sluznice. (G) RegIV bila izražena v intestinalno metaplazijo želodca. (H) Močna izraz RegIV opazili pri karcinomu želodca pečat obroč celic.
Naprej smo preučili ureditev RegIV mRNA in koncentracije proteina miR-24 v transfekciji SGC-7901 celic. ELISA analiza je pokazala, da so bile ravni RegIV beljakovin močno zatreti v SGC-7901 MIR 24 celic /, medtem ko so vrednosti RegIV beljakovin povečana pri anti-24 MIR celice SGC-7901 /(slika 4D; * P < 0,05, ** P < 0,01). Analiza QRT-PCR navedla nobene razlike v stopnji RegIV mRNA v vseh transfekciji celic skupine (slika 4E; p > 0,05). Medtem smo zaznali izražanje c-myc v GC celicah kot pozitivno kontrolo transfektirana z miR-24 [20]. Ugotovili smo, da miR-24 navzdol reguliranih RegIV in c-myc (Dodatne datoteko 4: Slika S4A in S4B).
Prejšnje študije so pokazale, da je bila RegIV povezana s širjenjem in metastazami GC. Mi Naslednja uporablja imunohistokemičnim analizo za oceno izražanje RegIV v GC. Naše ugotovitve potrdili čezmerno RegIV v GC. Raven beljakovin RegIV v normalnem želodčne sluznice je bila nižja od intestinalno metaplazijo želodca in pečat obroč karcinomom želodca (Slika 4F-H). Za oceno kliničnega pomena te ugotovitve, smo proučevali povezavo med prijavo RegIV in pokoj-24 v GC tkivih. Ugotovili smo, da RegIV in miR-24 razstavljena v obratnem izražanja vzorec, GC tkiva (tabela 2). Ti rezultati podpirajo idejo, da downregulation miR-24 povzročil zvišane ravni beljakovin RegIV v GC.Table 2 RegIV in miR-24 kažejo obratno izražanja vzorec v PK
miR-24 izraz
P vrednost
Low

Visoka
Reg IV (IHC)
Negative
9
16
0,038 *
pozitivno
25
13
* P
< 0.05 smo imeli statistično značilno
Čezmerno miR-24 zavira pojav tumorjev in vivo
Glede na to, da miR-24 izboljšala. širjenje GC celic in vitro
, smo pregledali, ali bi miR-24 vpliva na pojav tumorjev pri vivo
. -Retrovirusni posredovano SGC-7901 /MIR-24 in SGC-7901 /miR-kontrolni stabilne celične linije smo dobili, kot je opisano v poglavju Metode. SGC-7901 /RV-miR-24 in SGC-7901 /RV-miR-kontrolni celice so subkutano injicirali v štirih tednov starih moških golih miših in nastanek tumorja je spremljala. Tumorji rasla počasneje v SGC-7901 /RV-miR-24 skupini, razen tistih v skupini SGC-7901 /RV-miR kontrolo (slika 5A). Povprečni volumen tumorja pri miših, cepljenih z SGC-7901 /RV-miR-24 celic na 28. dan je bil bistveno manjši v primerjavi z miši, cepljenih z SGC-7901 /RV-miR-kontrolnih celic (397.45 ± 93,07 mm 3 vs. 1083.56 ± 101,56 mm 3, v tem zaporedju) (slika 5B in C; P < 0,05). Slika 5 miR-24 zaviral tumorogenosti in razmnoževanje in vivo. (A) Fotografija tumorjev, ki izhajajo iz RV-miR-24 ali RV-miR-kontrolnih celic v golih miših. kinetika (B) rasti tumorjev pri golih miših. premeri tumorja smo izmerili vsakih 7 dni. Je obseg golih miši s palicami, Š.D. navedena (* P < 0,05). (C) Povprečna teža tumorjev pri golih miših. Podatki so prikazani kot sredstvo ± SD (* P < 0,05). (D) Reprezentativni fotografije imunohistokemičnim analize Ki-67 antigena v tumorjih golih miškah (originalni povečavi, 200 ×). (E) predstavnik proliferacije indeks tumorjev v RV-miR-24 in RV-miR nadzora golih miših. Podatki so prikazani kot sredstvo ± SD (** P < 0,05). (F) raven izražanja RegIV v tumorskih tkivih golih miših. Podatki so prikazani kot sredstvo ± SD (* P < 0,05). (G) raven izražanja RegIV mRNA v tumorskih tkivih golih miškah (P > 0,05). Podatki so prikazani kot povprečje ± S.D. treh neodvisnih poskusov.
Za oceno, ali je zaviranje rasti tumorja v SGC-7901 /RV-miR-24 celic, deloma zaradi zatiranja orožja, imunohistokemični analize tumorskih tkivih niso bile izvedene. Kot je razvidno s Ki-67 antigena barvanja, lahko zmanjšala rast tumorja pri miših vbrizgali SGC-7901 /RV-miR-24 celic, delno zaradi manjšega orožja, ki jih prekomerno miR-24 povzročil. Odstotek Ki-67-antigen-pozitivnih celic, je bilo manjše v tumorju, ki izhaja iz SGC-7901 RV-MIR 24 celic /od tumorja, ki izhaja iz SGC-7901 /RV-miR-kontrolnih celic (37,1% ± 3,6% v primerjavi s . 79,5% ± 5,2%, soodvetno) (Slika 5D in E; P < 0,01). Nivo izražanja RegIV kot z ELISA določena je bila nižja v tumorju, pridobljenih iz celic, da nosi povečano izražen miR-24 kot tumorja, pridobljenih iz kontrolnih celic (1,77 ± 0,15 ng /ml v SGC-7901 /RV-miR-24 v primerjavi z 3,13 ± 0,25 ng /ml v SGC-7901 /RV-miR-upravljanje) (slika 5F P < 0,05). Vendar ni bilo nobene statistično značilne razlike v relativnem izražanju RegIV mRNA (slika 5G). Zato je bila tumorogenosti iz SGC-7901-miR-24 RV celic /in vivo
bistveno zmanjšalo.
Razprava
kopičijo dokazi podpira pomembno vlogo za miRNAs, ki delujejo bodisi kot tumorskih razbijal ali onkogeni, v GC [21-23]. Poleg tega so bili številni miRNAs izkazalo, da pokažejo terapevtski potencial. Zaradi svoje funkcije kot master regulatorji genoma in novega mehanizma delovanja se miRNAs velja za obetavno tehnologijo za terapevtsko razvoj [24]. miR-26a je antitumorigenic lastnosti in potencialno terapevtski pripomoček za raka na jetrih in vitro
in vivo
, in je povezana s hitro in trajno zaviranja širjenja rakavih celic in zelo specifično indukcijo tumorske celične smrti [25]. Poseben mehanizem vlog dysregulated miRNAs v želodcu rakotvornost še vedno nedosegljiva.
V tej študiji smo dokazali inhibitorne učinke miR-24 na tumorja metastaz pri kliničnem, celični in molekularni ravni in v poskusni živalskem modelu. Zagotovili smo podrobno sistematično eksperimentalni dokaz za vlogo miR-24 v GC z odpravo izražanje RegIV. Študije so pokazale, da lahko miR-24 deluje kot onkogen v malignih izlivi [26], oralno karcinom [27, 28], raka prostate [3] in pljučnega raka [29, 30], lahko pa delujejo kot supresorski tumorju kolona raka [ ,,,0],19] in retinoblastom tumorji [31]. Lal sod. ugotovila, da miR-24 orožja zaviral celic in napredovanje celičnega ciklusa z odpravo izražanje E2F2, myc in drugih celičnega ciklusa regulatornih genov, ki se veže na "brez pečk" elementov 3'UTR miRNA priznanje [20]. Wu J. et al. poročali, da transfekciji miR-24 v GC celic zmanjša ekspresijo AE1 beljakovin, kar je povzročilo inhibicijo celične proliferacije [32]. Vendar popolne osnovne mehanizme za pokoj-24 v GC še vedno ni jasno.
Naše poročilo označene miR-24 kot supresorski kandidat tumorja v PK. Našli smo downregulation Mir-24 izražanja tako v GC tkiv in celičnih linij. Čezmernim miR-24 v SGC-7901 GC celic bistveno zmanjša proliferacijo in invazija tako in vitro
in vivo
, ki razkrivajo potencialni terapevtski učinek miR-24 v GC. Nasprotno Rezultat je bil pridobljen ko je izraz miR-24 inhibira anti-miR-24. Skupaj ti rezultati kažejo, da lahko miR-24 deluje kot supresorski tumorja v človeški GC.
MiRNAs veže izpopolniti ali nepopolne dopolnilne "seme" sekvence v ciljnih mRNA, kar vodi do cepitve tarčnih mRNA ali inhibicijo prevajanjem [33] . V tej študiji smo identificirali RegIV kot ciljnega gena miR-24. miR-24 veže z nepopolnim dopolnjevanje do RegIV mRNA, ki izhajajo neposredno translacijskih inhibicijo RegIV mRNA, vendar brez učinka na splošno stabilnost mRNA. Kot različne načine akcijske miRNA, miR-24 ne vplivajo na raven mRNA za RegIV pa translacijsko zaviranje. RegIV je član človeške Reg družini genov, ki deli sekvenčno podobnost z domeno ogljikovih hidratov-vezavo C-tipa lektine, je najprej izoliramo in označen v človeškem vnetne črevesne bolezni [34]. RegIV je ena vrsta izločajo proteine, in ima biološko vlogo glede na ekstracelularnih izločajo proteine, tako da je ELISA kot metodo odkrivanja prednostni. Western blot smo izvedli tudi za potrditev raven beljakovin RegIV, in smo dobili podobne rezultate. Prejšnje študije so poročali, da je gen RegIV pogosto izraženi pri GC in je lahko vključena v invazijo, metastaz in karcinogenosti GC. RegIV izraz je bil ozko omejena noncancerous tkiva [35, 36]. RegIV izražanje je bistveno višja pri bolnikih z peritonealni metastaze v primerjavi s tistimi brez peritonealno metastaz. RegIV lahko pospeši peritonealno metastaze v GC in ravni v izpiralne tekočine bi lahko služil kot dober pokazatelj za peritonealno metastaz [37-39]. RegIV lahko deluje kot serumu biomarkerja za bolnike GC in zavira 5-FU-inducirano apoptozo z indukcijo Bcl-2 in dihidropirimidin dehidrogenaze [40].
V trenutni študiji smo identificirali MIR-24 kot potencialni toku regulator RegIV. Prvič, čezmernim miR-24 zmanjšala aktivnost luciferaze reporter gena, ki vsebuje 3'UTR RegIV, medtem ko je mutacija na "seme regije" strani v 3'UTR RegIV odpravila regulatorni učinek miR-24. Drugačna je bila dosežena, ko smo uporabili anti-miR-24. Drugič, človekove GC tkiva, izražena bistveno nižje ravni miR-24 kot ne-tumorskih tkivih, medtem ko so GC tkiva vsebujejo bistveno višje vrednosti RegIV beljakovin kot ne-tumorskih tkivih. Tretjič, čezmernim miR-24 navzdol reguliranih RegIV na ravni proteina, medtem ko downregulation miR-24 povečala raven RegIV beljakovin. Četrtič, je prekomerno miR-24 bistveno povezana s širjenjem in metastaz, kar kaže na funkcionalno prekrivanje z RegIV. Vsi ti rezultati kažejo, da bi lahko RegIV neposreden cilj gen miR-24 v GC.
Kancerogeneze je serija zaporednih dogodkov, vključno snela, migracije, lokalna invazija, angiogenezo, intravazacijo, preživetje v obtočil, ekstravazacije in ponovno rast v različnih organih [41, 42]. Tukaj smo pokazali, da lahko miR-24 uredil karcinogenosti GC z modularno proliferacijo, migracijo in lokalne invazije. Poleg tega je naša dokazi kažejo na možnost pokoj-24 kot terapevtski cilj v GC. Nadaljnje raziskave so potrebne za popolno razumevanje natančne mehanizme miR-24 v GC rakotvornosti in kot potencialnega terapevtskega pristopa.
Metode
Etična izjavo
je Pisna privolitev zberejo od vseh udeležencev, in študija protokol je bil sprejet ki jih je odbor za etiko bolnišnice Ruijin, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Vse poskuse miške so bili potrjeni na Animal Care (PermitÉ20810) in uporabe odbora in izvaja v skladu z uradnimi priporočili laboratorijev za oskrbo in uporabo živali, ki Bolnišnica Ruijin, Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
Celičnih linij
V GC humane celične linije snu-1, snu-16, NCI-N87, in KATO III smo nabavili pri American Type Culture Collection (ATCC). V celične linije SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, in AGS so bili kupljeni od Shanghai inštituti za biološke vede, kitajske akademije znanosti. Imortalizirana normalno želodca sluznice epitelijskih celic linija (GES-1) je bil darilo od prof Feng Bi (Huaxi Medical University, Chengdu, v provinci Sečuan, PR Kitajska). Zarodka ledvični celični liniji 293 T je ohranjena v našem laboratoriju in vzdržuje v mediju Dulbeccovem modificiranem Eagle je (DMEM) z 10% fetalnega govejega seruma (FBS), pri 37 ° C v navlaženi atmosferi s 5% CO 2. Vse GC celice smo kultivirali v RPMI 1640 z dodatkom 10% FBS v navlaženem inkubatorju s 5% CO 2 pri 37 ° C.
Vzorce tkiva
bili zbrani primarni rak tkiva in paru sosednje non-tumor tkiva od bolnikov z GC doživelo korenito želodca na oddelku za kirurgijo, Bolnišnica Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Sosednji normalne tkiva Dobimo več kot 5 cm od primarnega raka. Vzorce tkiva smo takoj snap-zamrznemo v tekočem dušiku in shranimo v hladilniku pri -80 ° C. Robčki za imunohistokemijo so bile določene v 4% paraformaldehida in-parafin vgrajeni. Clinicopathological podatki so bili pregledani in klasifikacija TNM uprizoritev je temeljila na merilih skupnega odbora ameriškega raka (AJCC, 6. izdaja). Vsi vzorci so bili preverjeni s patološkim pregledom.
RNA izolacija in QRT-PCR
Total RNA smo izolirali iz vzorcev tkiv in celičnih linij z uporabo TRIzola reagenta (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. Ravni izraz za miRNAs so ovrednotili s Ostra-itTM miRNAs qPCR kvantifikacije Kit (GenePharma, Shanghai, PR Kitajska) po protokolu proizvajalca. U6 majhen jedrski RNA (RNU6B; GenePharma) smo uporabili za normalizacijo. Relativna izraz razmerje miR-24 v vsak seznanjem tumorja in ne-tumorskega tkiva je bila izračunana z 2 -ΔΔCT metodo. Nivo izražanja miR-24 je bil definiran kot molekul, ko je bila relativna razmerja izraz > 1 in definirane kot navzdol reguliranih ko je relativni delež izraz < 1. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Želodca v primerjavi s post-piloricne hranjenje: sistematični review
• Uporabnost intranazalno ketamin in Midazolam opravljati želodčne posrka pri otrocih: dvojno slepa, s placebom kontrolirana, randomizirana study