Suppresseur de tumeur miR-24 retient la progression du cancer gastrique par régulation négative RegIV

Suppresseur de tumeur miR-24 retient la progression du cancer gastrique par régulation négative RegIV
Résumé de l'arrière-plan
microARN sont de petits ARN non codantes qui modulent une variété de processus cellulaires en régulant plusieurs cibles, ce qui peut favoriser ou inhiber le développement de comportements malignes . L'accumulation des données suggère miR-24 joue un rôle important dans la carcinogenèse humaine. Cependant, son rôle biologique précis reste largement insaisissable. Cette étude a examiné le rôle de miR-24 dans le cancer gastrique (GC).
Méthodes
L'expression de miR-24 dans les tissus du GC par rapport aux tissus non tumoraux appariés et des cellules de GC a été détectée par qRT-PCR. Synthetic courts oligonucléotides d'ARN simple brin ou double et des vecteurs lentiviraux ont été utilisés pour réguler miR-24 expression dans des cellules de GC pour enquêter sur sa fonction in vitro
et les résultats in vivo
.
MiR-24 était significativement régulés à la baisse dans les tissus GC par rapport aux tissus non tumoraux appariés et a été associée à la différenciation de la tumeur. L'expression ectopique de miR-24 dans les cellules GC SGC-7901 a supprimé la prolifération cellulaire, la migration et l'invasion in vitro
ainsi que tumorigénicité in vivo
en induisant arrêt du cycle cellulaire en phase G0 /G1 et la promotion de l'apoptose des cellules. Conclusions de plus, nous avons identifié RegIV comme une cible de miR-24 et a démontré que miR-24 régulé expression RegIV via une liaison de sa région 3 'non traduite.
miR-24 fonctionne comme un suppresseur de tumeur roman en GC et anti l'activité -oncogenic peut impliquer son inhibition de l'RegIV du gène cible. Ces résultats suggèrent la possibilité pour miR-24 comme une cible thérapeutique dans GC.
Mots-clés
miR-24 RegIV cancer gastrique prolifération Invasion Metastasis Contexte
cancer gastrique (GC) est l'un des cancers humains les plus courants. Bien que l'incidence et la mortalité ont diminué dans le monde entier au cours des 20 dernières années, GC se classe toujours comme le quatrième le plus commun et le deuxième cancer le plus mortel dans le monde [1]. Bien que la recherche en GC a fait de grands progrès, les mécanismes moléculaires sous-jacents GC n'ont pas encore été entièrement élucidés.
MicroARN (miARN) sont de petite taille non codantes, des molécules d'ARN double brin qui peuvent moduler l'expression des gènes cibles en influençant le post les processus de transcription régulant l'expression des gènes. miARN reconnaissent ARNm cibles sur la base de la complémentarité complète ou incomplète séquence et d'empêcher la production de protéines par liaison à la région 3 'non traduite (UTR) ou du cadre de lecture ouvert (ORF) de la cible d'ARNm [2, 3]. miARN ont été démontrées pour fonctionner dans les processus de prolifération et de la différenciation cellulaires, y compris la transition épithélio-mésenchymateuse [4] et la différenciation des cellules endodermiques souches embryonnaires humaines [5]. En plus des fonctions cellulaires générales de miARN, ces molécules jouent également des rôles importants dans une variété de maladies humaines. De nombreuses études ont montré que la dérégulation des miARN est liée au cancer [6, 7], dans lequel ils fonctionnent soit comme des oncogenes ou des gènes suppresseurs de tumeur. miARN ont été rapportés être impliqués dans la leucémie myéloïde aiguë, le cancer du sein, le carcinome non à petites cellules du poumon, le carcinome hépatocellulaire, le cancer du côlon, GC et d'autres cancers [8-13]. La surexpression ou la régulation négative de miARN aboutit à la diversification de l'expression protéique, contribuant ainsi à la tumorigenèse par la modulation de la prolifération, l'angiogenèse et l'invasion. Les chercheurs ont constaté que les profils d'expression de miARN peuvent être utilisés pour classer les cancers humains, et cette constatation était avant l'utilisation de profils d'ARN messager pour la classification des tumeurs mal différenciées [14, 15]. Expression
Aberrant des miARN spécifiques dans GC a été précédemment et a été corrélée avec la progression et le pronostic du GC [16-18]. Nous avons précédemment découvert que miR-24, qui peut servir comme un suppresseur de tumeur par l'intermédiaire d'un site cible du polymorphisme [19], était significativement miARN régulés à la baisse dans les cellules et les tissus GC par rapport aux tissus non tumoraux. Dans cette étude, nous avons analysé miR-24 niveaux d'expression dans les tissus du GC par rapport aux tissus non tumoraux appariés, et évalué les corrélations entre miR-24 niveau et paramètres clinicopathologiques. Nous avons évalué l'effet de la surexpression de miR-24 sur la croissance et l'apoptose des cellules CGT-7901 GC fois in vitro et in vivo

. Nous avons également déterminé l'effet biologique de la régulation négative de l'expression de miR-24 sur des cellules GC. De plus, nous avons identifié RegIV (régénération de la famille des îlots de Langerhans dérivées, élément 4) comme l'un des gènes cibles de miR-24. Nous présumons que miR-24 peut réguler l'invasion et la métastase des cellules GC en ciblant directement le gène RegIV.
Résultats de surexpression de miR-24 inhibe la prolifération des cellules GC
Pour explorer l'expression de miR-24 GC quantitative en temps réel RT-PCR (qRT-PCR) a été réalisée. L'expression de miR-24 est régulée vers le bas généralement dans neuf lignées cellulaires GC par rapport aux muqueuses gastriques GES-1 normale immortalisée de cellules épithéliales (figure 1A). L'expression de miR-24 a été examinée plus avant avec qRT-PCR dans les tissus tumoraux et les tissus non adapté à une tumeur à partir de 63 patients atteints de GC (figure 1B). Le niveau moyen d'expression de miR-24 est significativement régulée à la baisse dans les tissus tumoraux par rapport aux tissus non tumoraux appariés (figure 1c). Ensemble, ces résultats ont fourni des preuves solides que miR-24 était significativement downregulated en GC. Figure 1 miR-24 est significativement downregulated en GC et inhibe la croissance des cellules SGC-7901. (A) Expression relative de miR-24 dans neuf lignées cellulaires GC par rapport aux GES-1 déterminée par la qRT-PCR de trois expériences indépendantes (** p < 0,01, *** p < 0,001). (B) d'expression relative de miR-24 dans les échantillons chirurgicaux de 63 GC déterminée par qRT-PCR. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. Les données sont présentées en tant que valeurs -ΔΔCT, E.T. pas montré. (C) La moyenne et l'écart type de miR-24 niveaux d'expression dans les échantillons chirurgicaux de 63 tissus GC et les tissus non tumoraux appariés sont présentés. Les données sont présentées en tant que valeurs 2-ACt (** P < 0,05). ARNsn U6 a été utilisée pour la normalisation. (D) miR-24 inhibe la croissance des cellules CGT-7901 telle que détectée par WST, tandis que l'anti-miR-24 a augmenté la croissance cellulaire (* p < 0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T. de trois expériences indépendantes.
Nous avons ensuite examiné les corrélations entre le niveau d'expression de miR-24 et les facteurs clinicopathologiques dans GC humaine. Les caractéristiques cliniques et pathologiques de 63 patients du GC sont fournis dans le tableau 1. Sur la base des rapports d'expression relatifs de miR-24 /U6 = 1, les cas ont été divisés en deux groupes: le groupe miR-24 haute expression (n = 29) et le groupe miR-24 à faible expression (n = 34). Le groupe miR-24 faible expression exposée différenciation tumorale significativement plus faible (P = 0,021). Cependant, le niveau d'expression de miR-24 n'a montré aucune relation avec l'âge, le sexe, site de la tumeur, la profondeur de l'invasion locale, métastase ganglionnaire ou TNM stage.Table 1 Relation entre miR-24 niveau d'expression et les variables clinicopathologiques dans 63 GC patients
__gVirt_NP_NNS_NNPS<__ paramètres clinicopathologiques
miR-24 expression
Haute
valeur P
(n = 29)
Bas (n = 34)
Homme
17
21
0,799
Femme
Sexe
12
13
âge (années)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
emplacement de la tumeur
distal troisième 8
8
0.310
troisième
Moyen 6
13
proximal troisième
15
13
classification OMS
adénocarcinome
25
28
0,155
chevalière carcinome 1
5
adénocarcinome mucineux 3
1
Différenciation
Eh bien, modérément
15
8
0,021
mal
14
26
Borrmann classification
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
invasion locale
T1 /T2 1
7
0,098
T3 /T4
28
27
métastase ganglionnaire
No
6 4
0,535
Oui
23
30 métastase
Distant
No
28
31
0,724
Oui
1 3
stade TNM
I /II
7 8
0,955
III /IV
22
26
Pour étudier la fonction biologique de miR-24 dans le développement et la progression du GC, nous avons transfecté des cellules SGC-7901 avec miR-24 imite (SGC-7901 /miR-24) ou miR-24 inhibiteur (SGC-7901 /anti-miR-24). Comme le montre le fichier supplémentaire 1: Figure S1A et S1B, nous avons sélectionné 100 nM que la concentration appropriée dans les expériences suivantes. L'expression ectopique de miR-24 dans les cellules SGC-7901 a été confirmée par qRT-PCR. Ensuite, nous avons examiné la prolifération cellulaire par dosage WST. La surexpression de miR-24 a inhibé le taux de croissance du SGC-7901 cellules par rapport aux cellules transfectées miR-contrôle (P < 0,05), alors que l'anti-miR-24 a augmenté les activités de croissance cellulaire (P < 0,05, figure 1D).
la surexpression de miR-24 inhibe la migration et l'invasion des cellules du GC
suivante, nous avons évalué l'effet de miR-24 sur la migration et l'invasion cellulaire en GC. La migration des cellules et des essais d'invasion ont montré que la surexpression de miR-24 supprime la migration cellulaire (SGC-7901 /miR-24 groupe, 63,0 ± 3,6 cellules par ch& groupe témoin, 126,3 ± 7,0 cellules par ch& P < 0,05) et de l'invasion ( SGC-7901 /miR-24 groupe, 34,7 ± 2,1 cellules par ch& groupe témoin, 63,7 ± 3,5 cellules par ch& P < 0,05) (figure 2A, B). En revanche, knockdown de miR-24 a augmenté de manière significative la migration des cellules (SGC-7901 /anti-miR-24 groupe, 182,3 ± 5,0 cellules par ch& groupe témoin, 105,3 ± 3,8 cellules par ch& P < 0,01) et invasion (SGC -7901 /anti-miR-24 groupe, 124,3 ± 3,8 cellules par ch& groupe témoin, 62,7 ± 2,5 par ch& P < 0,01) (figure 2A, C). Figure 2 miR-24 migration inhibée et l'invasion des cellules SGC-7901. (A) Les champs représentatifs de cellules CGT-7901 dans les dosages transwell. (B, C) Les champs représentatifs de cellules SGC-7901 dans les essais de migration et d'invasion, respectivement. Nombre moyen de migration et l'invasion de cellules par champ à partir de trois expériences indépendantes (* p < 0,05, ** p < 0,01). de la surexpression de miR-24 favorise l'apoptose des cellules GC et induit un arrêt du cycle cellulaire G0 /la phase G1
Étant donné que l'on observe la croissance cellulaire peut être affectée par les taux d'apoptose et de la progression du cycle cellulaire, nous avons examiné les effets de miR-24 sur l'apoptose et le cycle cellulaire in vivo
par cytométrie en flux. Nous avons constaté que environ 12-15% du SGC-7901 /miR-24 cellules exposées caractéristiques morphologiques typiques de l'apoptose, y compris la chromatine condensée et la fragmentation nucléaire par Hoechst33342 coloration pour la teneur en ADN. En revanche, après avoir tenu compte de l'apoptose spontanée rare dans les cellules SGC-7901, le /anti-miR-24 groupe SGC-7901 n'a pas montré de changements significatifs par Hoechst33342 coloration (figure 3A). Cytométrie de flux a montré que le taux apoptotique a été significativement augmentée chez SGC-7901 /miR-24 cellules par rapport aux cellules de contrôle (13,62% ± 1,25% contre 6,15% ± 0,95%, respectivement; P < 0,01), et diminué de manière significative dans le SGC -7901 /anti-miR-24 par rapport aux témoins (3,92% ± 0,52% contre 6,35% ± 0,83%, respectivement; P < 0,05). (figure 3B, D)
Pour élucider le mécanisme de Mir- 24 inhibition de la croissance induite par des cellules GC, l'analyse du cycle cellulaire a été réalisée (figure 3C, E). Lors de la régulation positive de miR-24, le pourcentage de cellules en phase G0 /G1 est passée de 40,51% ± 3,15% dans le contrôle de 72,24% ± 3,65% (p < 0,01), tandis que knockdown miR-24 a réduit le pourcentage de cellules en G0 /phase de G1 de 42,35% ± 2,78% dans les contrôles à 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). La figure 3 miR-24 induit l'apoptose des cellules et G0 /G1 arrêt du cycle cellulaire. (A) histogrammes représentatifs illustrant la morphologie nucléaire des cellules SGC-7901 transitoirement transfectées avec 100 nM miR-24 imite ou inhibiteur et leurs témoins respectifs (Hoechst33342 coloration, original grossissement 400 ×). (B) histogrammes représentatifs illustrant l'apoptose des cellules SGC-7901 transfectées transitoirement avec 100 nM miR-24 imite ou inhibiteur et leurs témoins respectifs. (C) des histogrammes représentatifs illustrant le cycle cellulaire des cellules CGT-7901 transitoirement transfectées avec 100 nM miR-24 mimétiques ou d'un inhibiteur et leurs contrôles respectifs. (D, E) Le pourcentage de cellules apoptotiques et G0 /G1 en phase de trois expériences indépendantes, moyenne ± E.T. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV est un gène cible de miR-24
Pour examiner de plus près les mécanismes de miR-24 en GC, nous avons cherché des gènes cibles de candidat par bioinformatique. TargetScan, miRBase Tatget et StarBase ont été appliquées à la recherche de cibles potentielles de miR-24. Parmi les cibles prédites, RegIV a été identifiée comme l'un des gènes cibles de miR-24 et on a identifié un site potentiel de liaison miR-24 au sein de son 3'UTR (figure 4A). Ensuite, nous avons examiné l'expression de RegIV dans neuf cellules GC et GES-1. Nous avons constaté que RegIV était surexprimé dans neuf cellules GC par rapport aux GES-1, et présentait un motif d'expression inverse par rapport à miR-24 (fichier supplémentaire 2: Figure S2A et S2B). Afin de déterminer si la 3'UTR de l'ARNm RegIV était une cible fonctionnelle de miR-24, des essais de gène rapporteur luciférase ont été réalisées. Nous avons d'abord évalué l'activité de miR-24 (ou miR-témoin) cotransfectés dans des cellules CGT-7901 avec Luc-RegIV plasmide ou un plasmide Luc-RegIV-mut (dans lequel le site de liaison miR-24 putatif a été muté), en même temps que le plasmide pRL-TK contenant le gène de la luciférase de Renilla en tant que contrôle interne (figure 4B). Les cellules cotransfectées avec miR-24 ont montré une diminution significative de l'activité luciférase par rapport au groupe miR-témoin (p < 0,05). Cependant, miR-24 cotransfectées avec le plasmide Luc-RegIV-mut n'a montré aucune différence significative dans l'activité du rapporteur en comparaison avec des cellules cotransfectées avec miR-contrôle. De même, anti-miR-24 a augmenté l'activité luciférase de type sauvage Luc-RegIV, mais n'a eu aucun effet sur le plasmide Luc-RegIV-mut (figure 4C; P < 0,05). Nous avons également effectué des tests de gène rapporteur de luciférase dans SNU-16 afin de minimiser l'influence de miR-24 endogène. Dans un premier temps, l'expression ectopique de miR-24 dans SNU-16 cellules a été confirmée par qRT-PCR. L'expression de miR-24 transfectées avec miR-24 imite était environ 50 fois supérieure à celle du groupe miR-contrôle dans SNU-16 (P < 0,01), alors qu'aucune différence statistique avec la transfection d'anti-miR-24 (fichier supplémentaire 3: Figure S3A). Les cellules co-transfectées avec miR-24 ont montré une diminution significative de l'activité luciférase par rapport au groupe miR-contrôle (P < 0,001), alors qu'aucune différence statistique avec anti-miR-24 transfection (fichier supplémentaire 3: Figure S3B et S3C) . Ces résultats indiquent fortement que le 3'UTR de RegIV contient des sites de liaison directe pour miR-24. Figure 4 miR-24 cible le gène 3'UTR de RegIV et immunocoloration de RegIV dans les tissus gastriques. (A) Représentation schématique graphique des sites de liaison putatifs de miR-24 dans le RegIV 3'UTR. RegIV-mut indique le RegIV-3'UTR avec mutation dans miR-24 sites de liaison. (B) miR-24 imite l'activité d'un rapporteur de la luciférase contenant de type sauvage RegIV 3'UTR downregulated (* P < 0,05), mais pas le journaliste mutant RegIV 3'UTR. (C) Anti-miR-24 a augmenté l'activité luciférase de type sauvage Luc-RegIV (* P < 0,05), mais n'a eu aucun effet sur le mutant. (D) Quarante-huit heures après miR-24 transfection mimique et le contrôle des cellules SGC-7901, le niveau de RegIV de protéine a été significativement diminué par rapport à la miR-commande tel que déterminé par ELISA. Anti-miR-24 a augmenté l'expression de RegIV par rapport aux anti-miR-commande (* P < 0,05, ** P < 0,01). (E) Vingt-quatre heures après miR-24 mimétique ou un inhibiteur et la transfection de commande respective dans les cellules CGS-7901, il n'y avait pas de différence dans le niveau de RegIV d'ARNm par rapport à la miR-commande tel que déterminé par la qRT-PCR (P >0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T. de trois expériences indépendantes. (F) Aucune expression de RegIV a été détectée dans la muqueuse gastrique normale. (G) RegIV a été exprimé dans la métaplasie intestinale de l'estomac. (H) Une forte expression de RegIV a été observée dans le carcinome chevalière gastrique.
Suivant nous avons examiné miR-24 régulation des niveaux de protéines RegIV ARNm et dans les cellules SGC-7901 transfectées. analyse ELISA a montré que les niveaux de protéine RegIV ont été fortement réprimées dans SGC-7901 /miR 24 cellules, alors que les niveaux de protéine RegIV étaient surexprimés dans SGC-7901 /anti-miR-24 cellules (Figure 4D; * P < 0,05, ** P < 0,01). analyse qRT-PCR n'a révélé aucune différence dans le niveau d'ARNm RegIV dans tous les groupes de cellules transfectées (Figure 4E; P > 0,05). Pendant ce temps, nous avons détecté l'expression de c-MYC dans les cellules du GC comme témoin positif transfectées avec miR-24 [20]. Nous avons constaté que miR-24 downregulated RegIV et c-MYC (fichier complémentaire 4: Figure S4A et S4B).
Des études antérieures ont démontré que RegIV était associée à la prolifération et la métastase de GC. Nous avons ensuite utilisé l'analyse immunohistochimique pour évaluer l'expression de RegIV en GC. Nos résultats ont confirmé la surexpression de RegIV en GC. Le niveau de protéine de RegIV dans la muqueuse gastrique normale était inférieure à la métaplasie intestinale de l'estomac et de l'estomac carcinome chevalière en anneau (Figure 4F-H). Pour évaluer la pertinence clinique de ces résultats, nous avons examiné la corrélation entre les expressions de RegIV et miR-24 dans les tissus du GC. Nous avons constaté que RegIV et miR-24 ont présenté un schéma d'expression inverse dans les tissus GC (voir le tableau 2). Ces résultats soutiennent l'idée que la régulation négative de miR-24 a entraîné une augmentation des taux de protéines de RegIV dans GC.Table 2 RegIV et miR-24 exposition inverse modèle d'expression en GC
miR-24 expression
P valeur
Haute
Reg IV (IHC) Low
de
négatif 9
16
0,038 * 25
13 de

positive * P
< 0,05 a été considérée comme statistiquement significative
surexpression de miR-24 inhibe la tumorigénicité in vivo
Étant donné que miR-24 a amélioré la. prolifération des cellules in vitro GC
, nous avons examiné si miR-24 pourrait affecter tumorigénicité in vivo
. Retrovirus CGT-7901 /miR-24 et les lignées cellulaires stables SGC-7901 /miR-témoins ont été obtenus comme décrit dans la section Méthodes. SGC-7901 /RV-miR-24 et les cellules SGC-7901 /RV-miR-contrôle ont été injectés sous-cutanée dans quatre semaines vieilles souris nues mâles, et la formation de tumeurs a été surveillée. Tumeurs a progressé plus lentement dans le SGC-7901 /RV-miR-24 groupe que ceux du groupe SGC-7901 /RV-miR-commande (figure 5A). Le volume moyen des tumeurs chez les souris inoculées avec SGC-7901 /RV-miR-24 cellules au jour 28 était significativement plus faible par rapport aux souris inoculées avec des cellules CGT-7901 /RV-miR-commande (397.45 ± 93,07 mm 3 vs. 1083.56 ± 101.56 mm 3, respectivement) (figure 5B et C; P < 0,05). Figure 5 miR-24 a inhibé la tumorigénicité et la prolifération in vivo. (A) Photographie de tumeurs dérivées de RV-miR-24 ou RV-miR-contrôle des cellules chez des souris nues. cinétique (B) de croissance des tumeurs chez la souris nude. diamètres de la tumeur ont été mesurés tous les 7 jours. Le volume des souris nude indiqué par des barres, S.D. (* P < 0,05). (C) Le poids moyen des tumeurs chez la souris nude. Les données sont présentées comme moyenne ± E.T. (* P < 0,05). (D) des photographies représentatives de l'analyse immunohistochimique de Ki-67 antigène dans les tumeurs de souris nues (grossissement, 200 ×). (E) de l'indice prolifératif représentant des tumeurs chez RV-miR-24 et RV-miR-contrôle des souris nues. Les données sont présentées comme moyenne ± E.T. (** P < 0,05). (F) les niveaux d'expression de RegIV dans les tissus tumoraux de souris nude. Les données sont présentées comme moyenne ± E.T. (* P < 0,05). (G) les niveaux d'expression de l'ARNm RegIV dans les tissus tumoraux de souris nude (P > 0,05). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± E.T. de trois expériences indépendantes.
Pour évaluer si l'inhibition de la croissance tumorale dans SGC-7901 /RV-miR-24 cellules était en partie due à la suppression de la prolifération, immunohistochimique analyse des tissus tumoraux ont été réalisées. Comme on le voit avec l'antigène Ki-67 coloration, la croissance de la tumeur a diminué chez les souris injectées avec SGC-7901 /RV-miR-24 cellules peuvent être en partie à cause d'une prolifération inférieure provoquée par la surexpression de miR-24. Le pourcentage de cellules Ki-67-antigène-positives était plus faible dans la tumeur dérivée de la CGT-7901 /RV-miR 24 cellules de la tumeur dérivée de cellules CGT-7901 /RV-miR-témoins (37,1% ± 3,6% versus . 79,5% ± 5,2%, respectivement) (figure 5D et E; P < 0,01). Le niveau d'expression de RegIV tel que déterminé par la méthode ELISA était plus faible dans les tumeurs dérivées de cellules surexprimant miR-24 de la tumeur provenant de cellules témoins (1,77 ± 0,15 ng /ml dans du CGS-7901 /RV-miR-24 vs 3,13 ± 0,25 ng /ml dans SGC-7901 /RV-miR-contrôle) (Figure 5F; P < 0,05). Cependant, il n'y avait pas de différence statistique dans l'expression relative de l'ARNm RegIV (figure 5G). Rapport de conséquence, la tumorigénicité du SGC-7901 /miR-24-RV cellules ont été significativement réduites in vivo
.
preuves Accumulation a soutenu des rôles importants pour miARN, qui agissent soit comme suppresseurs de tumeur ou oncogènes, en GC [21-23]. En outre, de nombreux miARN se sont révélés présenter un potentiel thérapeutique. En raison de leur fonction comme les principaux régulateurs du génome et nouveau mécanisme d'action, les miARN sont considérés comme une technologie prometteuse pour le développement thérapeutique [24]. miR-26a a des propriétés anti-tumorigène et l'utilité thérapeutique potentielle pour le cancer du foie in vitro
et in vivo
, et a été associée à une inhibition rapide et prolongée de la prolifération des cellules cancéreuses et l'induction hautement spécifique de la mort des cellules tumorales [25]. Le mécanisme spécifique du rôle des miARN dérégulés dans la carcinogenèse gastrique reste insaisissable.
Dans cette étude, nous avons démontré les effets inhibiteurs de miR-24 sur les métastases de la tumeur au niveau clinique cellulaire et moléculaire et dans un modèle animal expérimental. Nous avons fourni des preuves expérimentales mécaniste détaillées sur le rôle de miR-24 dans GC en supprimant l'expression de RegIV. Des études ont montré que miR-24 peut agir comme un oncogene dans les épanchements malins [26], le carcinome buccal [27, 28], le cancer de la prostate [3] et le cancer du poumon [29, 30], mais il peut agir comme un suppresseur de tumeur dans le cancer du côlon [ ,,,0],19] et les tumeurs du rétinoblastome [31]. Lal A et al. découvert que miR-24 inhibent la prolifération cellulaire et la progression du cycle cellulaire en supprimant l'expression de E2F2, MYC et d'autres gènes de régulation du cycle cellulaire en se liant à 3'UTR miARN éléments de reconnaissance "graines" [20]. Wu J et al. a rapporté que la transfection de miR-24 dans des cellules GC a réduit l'expression de la protéine AE1, ce qui a entraîné l'inhibition de la prolifération cellulaire [32]. Cependant, les mécanismes sous-jacents complets pour miR-24 en GC sont toujours pas claires.
Notre rapport a identifié miR-24 comme un suppresseur de tumeur candidat en GC. Nous avons trouvé que la régulation négative de l'expression de miR-24 à la fois dans les tissus GC et des lignées cellulaires. La surexpression de miR-24 dans le SGC-7901 cellules GC réduit de manière significative la prolifération et l'invasion in vitro et in vivo

, révélant l'effet thérapeutique potentiel de miR-24 en GC. Le résultat inverse a été obtenu lorsque l'expression de miR-24 a été inhibée par anti-miR-24. Ensemble, ces résultats suggèrent que miR-24 peut fonctionner comme un suppresseur de tumeur dans GC humaine.
MiARN se lient à la perfection ou des séquences imparfaites complémentaires «semence» dans les ARNm cibles, conduisant à un clivage d'ARNm ou l'inhibition de leur traduction cible [33] . Dans cette étude, nous avons identifié RegIV comme un gène cible de miR-24. miR-24 liée à la complémentarité incomplète à RegIV ARNm, entraînant l'inhibition de la traduction directe de l'ARNm RegIV mais sans effet sur la stabilité globale de l'ARNm. Comme les différents modes de miARN d'action, miR-24 n'a pas affecté le niveau d'ARNm de RegIV mais l'inhibition de la traduction. RegIV est un membre de la famille du gène Reg humain, qui partage une similarité de séquence avec le domaine de liaison de glucide de lectines de type C, et a été isolé et caractérisé par une maladie inflammatoire de l'intestin humain [34]. RegIV est un type de protéines sécrétées, et joue un rôle biologique en fonction des protéines sécrétées extracellulaire, de sorte que nous avons ELISA comme une méthode de détection préférée. Western blot a également été effectuée pour valider le niveau de RegIV de protéine et on a obtenu des résultats similaires. Des études antérieures ont rapporté que le gène RegIV était fréquemment surexprimé dans GC et est potentiellement impliqué dans l'invasion, les métastases, et la carcinogenèse du GC. expression RegIV était étroitement limitée dans les tissus noncancerous [35, 36]. expression RegIV était nettement plus élevée chez les patients avec métastases péritonéales par rapport à ceux sans métastases péritonéales. RegIV pourrait accélérer métastases péritonéales en GC et les niveaux dans les fluides de lavage pourrait servir comme un bon marqueur pour métastases péritonéales [37-39]. RegIV peut fonctionner comme un biomarqueur de sérum pour les patients du GC et inhibe l'apoptose 5-FU-induite par induction de Bcl-2 et dihydropyrimidine déshydrogénase [40].
Dans l'étude actuelle, nous avons identifié miR-24 comme un régulateur amont potentiel RegIV. Tout d'abord, la surexpression de miR-24 ont diminué l'activité d'un gène rapporteur luciférase contenant le 3'UTR de RegIV, tandis que la mutation des sites de «région de la graine» dans le 3'UTR de RegIV a aboli l'effet régulateur de miR-24. Le résultat inverse a été obtenu lorsque nous avons utilisé anti-miR-24. Deuxièmement, les tissus GC humains ont exprimé des niveaux significativement plus faibles de miR-24 que les tissus non-tumorales, alors que les tissus du GC contiennent des niveaux significativement plus élevés de protéines RegIV que les tissus non tumoraux. En troisième lieu, la surexpression de miR-24 régulée à la baisse RegIV au niveau de la protéine, tandis que la régulation négative de miR-24 augmente la teneur en protéines RegIV. Quatrièmement, la surexpression de miR-24 était significativement liée à la prolifération et la métastase, ce qui indique un chevauchement fonctionnel avec RegIV. Tous ces résultats indiquent que RegIV pourrait être un gène cible directe de miR-24 en GC.
Carcinogenesis est une série d'événements successifs, y compris le détachement, la migration, l'invasion locale, l'angiogenèse, intravasculaire, la survie dans le système circulatoire, extravasation et repousse dans les différents organes [41, 42]. Ici, nous avons montré que miR-24 pourrait réguler la carcinogenèse du GC par modulation de la prolifération, la migration et l'invasion locale. En outre, notre preuve suggère la possibilité pour miR-24 comme une cible thérapeutique dans GC. D'autres études sont nécessaires pour comprendre les mécanismes détaillés de miR-24 en GC carcinogenèse et comme une approche thérapeutique potentielle.
Méthodes
déclaration éthique
consentement éclairé écrit a été recueilli à partir de tous les participants, et le protocole d'étude a été approuvé par le comité d'éthique de l'Hôpital Ruijin, Faculté de médecine de l'Université Jiaotong. Toutes les expériences de souris ont été approuvés par le soin des animaux (permis N ° 20120810) et l'utilisation Comité et menées en conformité avec les recommandations officielles des soins et l'utilisation des animaux de laboratoire de l'Hôpital Ruijin, Faculté de médecine de l'Université Jiaotong.
Lignées cellulaires
Les lignées de cellules humaines GC SNU-1, SNU-16, NCI-N87 et KATO III ont été achetés auprès de American type Culture Collection (ATCC). Les lignées de cellules SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, et AGS ont été achetés auprès des instituts de Shanghai pour les sciences biologiques, l'Académie chinoise des sciences. La ligne normale immortalisée de la muqueuse gastrique des cellules épithéliales (GES-1) était un cadeau du Professeur Feng Bi (Medical University Huaxi, Chengdu, province du Sichuan, République populaire de Chine). La lignée de cellules de rein embryonnaire 293 T a été conservée dans notre laboratoire et maintenue dans du milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2. Toutes les cellules de GC ont été cultivées dans du RPMI 1640 supplémenté avec 10% de FBS dans un incubateur humidifié avec 5% de CO 2 à 37 ° C. Des échantillons de tissus

tissus cancéreux primaires et les tissus non tumoraux adjacents par paires ont été collectées de patients atteints de GC ont subi une gastrectomie radicale au Département de chirurgie, Hôpital Ruijin, école de médecine de l'Université de Shanghai Jiao Tong. Les tissus adjacents normaux ont été obtenus sur 5 cm du cancer primaire. Des échantillons de tissus ont été immédiatement snap-congelées dans l'azote liquide et conservés dans un réfrigérateur à -80 ° C. Tissues pour immunohistochimie ont été fixées dans 4% de paraformaldehyde et de paraffine. les données clinicopathologiques ont été examinés, et la classification TNM était fondée sur des critères de American Joint Committee on Cancer (AJCC, 6e édition). Tous les échantillons ont été vérifiés par un examen pathologique. Isolement
de l'ARN et l'ARN total de qRT-PCR a été isolé à partir d'échantillons de tissus et des lignées cellulaires utilisant Trizol réactif (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) selon les instructions du fabricant. Les niveaux de miARN d'expression ont été évalués en utilisant le miARN Quantification Kit Hairpin-ITTM qPCR (GenePharma, Shanghai, Chine) suivant le protocole du fabricant. Le petit ARN nucléaire U6 (RNU6B; GenePharma) a été utilisée pour la normalisation. Le ratio d'expression relative de miR-24 dans chaque tissu tumoral et non tumoral apparié a été calculée en utilisant la 2 méthode -ΔΔCT. Le niveau d'expression de miR-24 a été définie comme étant une régulation positive lorsque le rapport relatif d'expression est > 1, et défini comme étant régulés à la baisse lorsque le taux relatif d'expression est < 1. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

• Gastric alimentation par rapport post-pylorique: un review
• Utilitaire de intranasale kétamine et Midazolam pour effectuer aspiration gastrique chez l'enfant: une double-aveugle, contrôlée versus placebo, randomisée Utility study