Tumor supressor de miR-24 impede a progressão do cancro gástrico por downregulating RegIV

tumor supressor de miR-24 impede a progressão do cancro gástrico por downregulating RegIV da arte abstracta
Fundo
microRNAs são pequenos RNAs não-codificantes que modulam uma variedade de processos celulares, regulando múltipla metas, que podem promover ou inibir o desenvolvimento de comportamentos malignos. O acúmulo de evidências sugere miR-24 desempenha um papel importante na carcinogênese humana. No entanto, seu papel biológico preciso permanece difícil. Este estudo examinou o papel de miR-24 em cancro gástrico (GC).
Métodos
A expressão de miR-24 em tecidos de GC em comparação com os tecidos não tumorais e células correspondentes GC foi detectada por qRT-PCR. Sintético oligonucleótidos de ARN curtos cadeia simples ou dupla e os vectores lentivirais foram usadas para regular o miR-24 de expressão em células de GC para investigar a sua função in vitro e in vivo

.
Resultados
miR-24 foi significativamente regulada negativamente nos tecidos GC em comparação com os tecidos não tumorais combinados e foi associada com a diferenciação do tumor. A expressão ectópica de miR-24 em células GC SGC-7901 suprimiu a proliferação celular, migração e invasão in vitro
, bem como tumorigenicidade in vivo
através da indução de parada do ciclo celular na fase G0 /G1 e promover a apoptose celular. Além disso, foram identificados RegIV como alvo de miR-24 e demonstraram que o miR-24 regulada expressão RegIV via ligação a região 3 'não traduzida.
Conclusões
miR-24 funciona como um romance supressor de tumor em GC eo anti actividade -oncogenic pode envolver a inibição da RegIV gene alvo. Estes resultados sugerem a possibilidade de miR-24 como um alvo terapêutico no GC.
Palavras-chave
miR-24 RegIV gástrica câncer Proliferação Invasion Metástase fundo
câncer gástrico (CG) é um dos cancros humanos mais comuns. Embora a incidência e mortalidade tenham diminuído em todo o mundo ao longo dos últimos 20 anos, GC ainda classifica como a quarta mais comum e o segundo câncer mais letal em todo o mundo [1]. Embora a pesquisa em GC tem feito grandes progressos, os mecanismos moleculares subjacentes GC ainda não foram completamente elucidados.
MicroRNAs (miRNAs) são pequenos não-codificantes, moléculas de cadeia dupla de RNA que podem modular a expressão de genes-alvo, influenciando a pós- processos de transcrição que regulam a expressão do gene. miARNs reconhecer mRNAs alvo com base no completo ou incompleto complementaridade de sequência e prevenir a produção de proteínas por ligação à região 3 'não traduzida (UTR) ou o enquadramento de leitura aberto (ORF) de ARNm alvo [2, 3]. miARNs demonstraram funcionar em processos de proliferação e diferenciação celular, incluindo a transição epitelial-mesenquimal [4] e a diferenciação endodérmica de células estaminais embrionárias humanas [5]. Além das funções celulares gerais de miARN, estas moléculas também desempenham papéis importantes numa variedade de doenças humanas. Vários estudos têm mostrado que a desregulação de miARNs está relacionada com o cancro [6, 7], em que funcionam quer como oncogenes ou supressores de tumores. miARNs ter sido referida como estando envolvida na leucemia mielóide aguda, cancro da mama, carcinoma do pulmão de células não pequenas, carcinoma hepatocelular, cancro do cólon, GC e de outros cancros [8-13]. Superexpressão ou downregulation dos miRNAs leva à diversificação da expressão da proteína, contribuindo para tumorigênese modulando a proliferação, angiogênese e invasão. Os pesquisadores descobriram que os perfis de expressão de miRNA pode ser usada para classificar os cânceres humanos, e este achado foi antes do uso de perfis de RNA mensageiro para classificação de tumores pouco diferenciados [14, 15]. Expressão
aberrante de miRNAs específicos em GC tem sido relatado anteriormente e foi correlacionada com a progressão e prognóstico de GC [16-18]. Nós encontramos anteriormente que o miR-24, que pode servir como um supressor de tumor, através de um local alvo polimorfismo [19], foi um miARN significativamente regulada negativamente em células e tecidos de GC em comparação com os tecidos não tumorais. Neste estudo, analisou-se o miR-24 os níveis de expressão em tecidos de GC em comparação com os tecidos não tumorais correspondentes, e avaliada correlações entre o miR-24 e os parâmetros de nível clinicopatológicas. Foi avaliada a influência da superexpressão de miR-24 sobre o crescimento e apoptose de SGC-7901 células GC tanto in vitro como in vivo

. Nós também determinado o efeito biológico de regulação negativa da expressão de miR-24 em células de GC. Além disso, identificou-se RegIV (regenerar família derivado de ilhota, membro 4) na forma de um dos genes alvo de miR-24. Nossa hipótese é que miR-24 pode regular a invasão e metástase de células GC diretamente pela segmentação do gene RegIV.

Resultados da sobre-expressão de miR-24 inibe a proliferação celular GC
Para explorar a expressão de miR-24 em GC, foi realizada quantitativo em tempo real de RT-PCR (qRT-PCR). Expressão de miR-24 foi geralmente regulada negativamente em nove linhas celulares de GC em comparação com os GES-1 normais imortalizadas de células epiteliais da mucosa gástrica (Figura 1A). Expressão de miR-24 foi examinada com mais qRT-PCR em tecidos tumorais e combinados tecidos não tumorais a partir de 63 pacientes GC (Figura 1B). O nível de expressão média de miR-24 foi significativamente regulada negativamente nos tecidos tumorais em comparação com tecidos não tumorais correspondentes (Figura 1C). Juntos, estes resultados forneceram evidência forte de que o miR-24 foi significativamente regulada negativamente em GC. Figura 1 miR-24 é significativamente regulada negativamente em GC e inibiu o crescimento celular SGC-7901. (A) Expressão relativa de miR-24 em nove linhas celulares de GC em comparação com GES-1 determinado por qRT-PCR de três experiências independentes (** p < 0,01, *** P < 0,001). (B) A expressão relativa de miR-24 em amostras cirúrgicas de 63 GC determinada por qRT-PCR. Todas as experiências foram realizadas em triplicado. Os dados são apresentados como valores -ΔΔCT, S.D. não mostrado. (C) A média eo desvio-padrão de miR-24 níveis de expressão em espécimes cirúrgicos de 63 tecidos GC e tecidos não tumorais combinadas são mostrados. Os dados são apresentados como valores 2-ΔCT (** P < 0,05). U6 snRNA foi utilizado para normalização. (D) o miR-24 inibiu o crescimento de células SGC-7901 conforme detectado por WST, enquanto o anti-miR-24 aumentou o crescimento das células (* P < 0,05). Os dados são apresentados como média ± S.D. de três experiências independentes.
Nós próxima examinou as correlações entre o nível de expressão de miR-24 e fatores clínico-patológicas em GC humano. As características clínicas e patológicas de 63 pacientes do GC são apresentados na Tabela 1. Com base nos rácios de expressão relativa de miR-24 /U6 = 1, os casos foram divididos em dois grupos: o grupo de alta expressão de miR-24 (n = 29) e o grupo de baixa expressão de miR-24 (n = 34). O grupo de baixo-expressão de miR-24 exibiu diferenciação tumoral significativamente menor (P = 0,021). No entanto, o nível de expressão de miR-24 não mostrou qualquer relação com a idade, sexo, local do tumor, a profundidade da invasão local, metástase linfonodal, ou TNM stage.Table 1 Relação entre nível de expressão de miR-24 e variáveis ​​clínico-patológicas em 63 GC pacientes
parâmetros clinicopatológicos
miR-24 expressão
valor P
alta (n = 29)
Low (n = 34)

Sexo
Masculino
17
21
0,799
Feminino
12
13
Idade (anos)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
localização do tumor
terço distal
8
8
0,310
Oriente terceira
6
13
terço proximal
15
13
OMS classificação
Adenocarcinoma
25
28
0,155 carcinoma
do anel de sinete
1 | 5
mucinoso adenocarcinoma Sims 3
1 | Diferenciação
Bem, moderadamente
15
8
0,021
mal
14
26
classificação de Borrmann
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
invasão local
T1 /T2
1 | 7
0,098
T3 /T4
28
27
Linfonodo metástase
Sem
6 4
0,535
Sim
23
30 metástase
Distante
Sem
28
31
0,724
Sim
1 | 3
estágio TNM
I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
Para investigar a função biológica do miR-24 em desenvolvimento e progressão da GC, nós transfectadas células SGC-7901 com miR-24 imita (SGC-7901 /miR-24) ou miR-24 inibidor (SGC-7901 /anti-miR-24). Como mostrado no arquivo adicionais 1: Figura S1A e S1B, foram selecionados 100 nm como concentração adequada em experiências posteriores. A expressão ectópica de miR-24 em células SGC-7901 foi confirmada por qRT-PCR. Em seguida, examinámos a proliferação celular por ensaio de WST. A sobre-expressão de miR-24 inibiu a taxa de crescimento de SGC-7901 células em comparação com células transfectadas miR-controlo (P < 0,05), enquanto que anti-miR-24 aumentou actividades de crescimento celular (p < 0,05, Figura 1D).
a superexpressão de miR-24 inibe a migração e invasão de células GC
em seguida, avaliaram o efeito de miR-24 na migração e invasão celular em GC. A migração celular e ensaios de invasão mostrou que a sobre-expressão de miR-24 suprimida migração celular (SGC-7901 /grupo miR-24, 63,0 ± 3,6 células por campo; grupo de controlo, 126,3 ± 7,0 células por campo; p < 0,05) e invasão ( SGC-7901 /miR-24 grupo, 34,7 ± 2,1 células por cada campo; grupo controle, 63,7 ± 3,5 células por cada campo; p < 0,05) (Figura 2A, B). Em contraste, o knockdown de miR 24 aumentou significativamente a migração de células (SGC-7901 /anti miR 24-grupo, 182,3 ± 5.0 células por cada campo; grupo controle, 105,3 ± 3,8 células por cada campo; p < 0,01) e de invasão (SGC -7901 /grupo anti-miR-24, 124,3 ± 3,8 células por campo; grupo de controlo, 62,7 ± 2,5 por campo; P < 0,01) (Figura 2A, C). Figura 2 miR-24 inibiu a migração e a invasão de células SGC-7901. (A) campos representativos de células SGC-7901 nos ensaios transpo�. (B, C) campos representativos de células SGC-7901 nos ensaios de migração e invasão, respectivamente. Número de células migração e invasão por campo a partir de três experiências independentes (* P < 0,05, ** P < 0,01).
superexpressão de miR-24 promove a apoptose de células de GC e induz a paragem do ciclo celular em G0 /fase G1
Dado que observado o crescimento celular pode ser afectada pelas taxas de apoptose e na progressão do ciclo celular, foram examinados os efeitos de miR-24 sobre a apoptose e o ciclo celular in vivo
por citometria de fluxo. Descobrimos que cerca de 12-15% do SGC-7901 /miR-24 células exibiram características morfológicas típicas de apoptose, incluindo cromatina condensada e fragmentação nuclear por coloração Hoechst33342 para conteúdo de DNA. Em contraste, após a contabilização para a apoptose espontânea rara em células SGC-7901, o /grupo SGC-7901 anti-miR-24 não apresentaram quaisquer alterações significativas por Hoechst33342 coloração (Figura 3A). A citometria de fluxo mostrou que a taxa de apoptose foi significativamente aumentada em /células SGC-7901 miR-24 em comparação com células de controlo (13,62% ± 1,25% vs 6,15% ± 0,95%, respectivamente, P < 0,01), e diminuiu significativamente em SCG -7901 /anti-miR-24 em comparação com os controlos (3,92% ± 0,52% vs 6,35% ± 0,83%, respectivamente, P < 0,05). (Figura 3B, D)
Para melhor elucidar o mecanismo de miR- inibição de crescimento de 24-mediada de células GC, análise do ciclo celular foi realizada (Figura 3C, E). Após a regulação positiva de miR-24, a percentagem de células na fase G0 /G1 aumentou de 40,51% ± 3,15% nos controlos de 72,24% ± 3,65% (P < 0,01), enquanto knockdown miR-24 reduziu a percentagem de células em G0 /fase G1 de 42,35% ± 2,78% nos controlos para 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Figura 3 miR-24 induzida a apoptose das células e G0 /G1 do ciclo celular de detenção. (A) histogramas representativos que descrevem a morfologia nuclear de células SGC-7901 transitoriamente transfectadas com 100 Nm miR-24 imita ou inibidor e seus respectivos controles (coloração Hoechst33342, magnificação original × 400). (B) histogramas representativos que descrevem a apoptose de células SGC-7901 transientemente transfectadas com 100 nM de miR-24 imita ou inibidor e os seus respectivos controlos. (C) descrevem histogramas representativos do ciclo celular de células SGC-7901 transientemente transfectadas com 100 nM de miR-24 imita ou inibidor e os seus respectivos controlos. (D, E) A percentagem de células apoptóticas e fase G0 /G1 de três experiências independentes, média ± S.D. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV é um gene alvo de miR-24
Para examinar mais de perto os mecanismos de miR-24 em GC, temos procurado por genes alvo candidato por bioinformática. TargetScan, miRBase Tatget e Base Estelar foram aplicados para procurar potenciais alvos de miR-24. Entre os objectivos previstos, RegIV foi identificada como um dos genes alvo de miR-24, e identificou-se um potencial local de ligação de miR-24 no seu 3'UTR (Figura 4A). Em seguida, examinámos a expressão de RegIV em nove células GC e GES-1. Descobrimos que RegIV foi sobre-expresso em nove células GC em comparação com GES-1, e exibiu um padrão de expressão inversa em comparação com o miR-24 (arquivo adicionais 2: Figura S2A e S2B). Para investigar se o 3 'UTR do mRNA RegIV era um alvo funcional de miR-24, foram realizados ensaios de gene repórter de luciferase. O primeiro avaliada a actividade de miR-24 (ou o miR-controlo) co-transfectado para células SGC-7901 com o plasmídeo Luc-RegIV ou o plasmídeo Luc-RegIV-mut (em que o sítio de ligação putativo do miR-24 foi mutado), juntamente com o plasmídeo pRL-TK contendo o gene da luciferase de Renilla como controlo interno (Figura 4B). As células co-transfectadas com o miR-24 mostraram uma redução significativa da actividade de luciferase em comparação com o grupo de miR-controlo (P < 0,05). No entanto, o miR-24 co-transfectadas com o plasmídeo Luc-RegIV-mut não mostrou nenhuma diferença significativa na actividade repórter em comparação com as células co-transfectadas com o miR-controlo. Do mesmo modo, o anti-miR-24 aumentaram a actividade da luciferase de tipo selvagem Luc-RegIV, mas não teve efeito sobre plasmídeo Luc-RegIV-mut (Figura 4C; P < 0,05). Também foram realizados ensaios de gene repórter de luciferase em SNU-16 para minimizar a influência de endógena miR-24. Em primeiro lugar, a expressão ectópica de miR-24 em células SNU-16 foi confirmada por qRT-PCR. Expressão de miR-24 transfectadas com o miR-24 imita foi cerca de 50 vezes mais elevada do que a do grupo de miR-controlo em SNU-16 (P < 0,01), enquanto que não houve diferença estatística com a transfecção de miR-24 anti-(arquivo adicional 3: Figura S3A). Células co-transfectadas com miR-24 demonstraram uma diminuição significativa da actividade da luciferase comparado com o grupo miR-controle (P < 0,001), enquanto não houve diferença estatística com anti miR-24 transfecção (arquivo adicionais 3: Figura S3B e S3C) . Estes resultados indicam fortemente que o 3'UTR de RegIV contém sítios de ligação direta para miR-24. Figura 4 miR-24 como alvo o gene da 3 'UTR de RegIV e imunocoloração de RegIV nos tecidos gástricos. (A) Representação esquemática gráfico dos sítios de ligação putativos de miR-24 no RegIV 3'UTR. RegIV-mut indica o RegIV-3'UTR com mutação no miR-vinculativo 24 sites. (B) o miR-24 imita a actividade de um repórter da luciferase contendo o tipo selvagem RegIV 3'UTR regulados negativamente (* P < 0,05), mas não com o repórter mutante RegIV 3'UTR. (C) anti-miR-24 aumentaram a actividade da luciferase de tipo selvagem Luc-RegIV (* P < 0,05), mas não teve efeito sobre o mutante. (D) Quarenta e oito horas após a transfecção o miR-24 mímica e de controlo das células SGC-7901, o nível de proteína de RegIV foi significativamente diminuída em comparação com o miR-controlo, tal como determinado por ELISA. Anti-miR-24 aumentou a expressão de RegIV em comparação com o anticorpo anti-miR-controlo (* P < 0,05, ** P < 0,01). (E) Vinte e quatro horas após o miR-24 mímica ou inibidor e o respectivo transfecção controlo em células SGC-7901, não houve diferença no nível de ARNm de RegIV em comparação com o miR-controlo, tal como determinado por qRT-PCR (P > 0,05). Os dados são apresentados como média ± S.D. de três experiências independentes. (F) Nenhuma expressão de RegIV foi detectado na mucosa gástrica normal. (L) RegIV foi expressa em metaplasia intestinal do estômago. (H) foi observada expressão forte de RegIV no carcinoma de células em anel de sinete gástrico.
Em seguida, examinou miR-24 regulação do mRNA RegIV e os níveis de proteína em células SGC-7901 transfectadas. A análise ELISA revelou que os níveis de proteína RegIV foram grandemente suprimida na /miR-24 células SGC-7901, ao passo que os níveis de proteína RegIV foram regulados positivamente no /miR anti-24-células SGC-7901 (Figura 4D; * P < 0,05, ** P < 0,01). análise de qRT-PCR indicaram nenhuma diferença no nível de ARNm RegIV em todos os grupos de células transfectadas (Figura 4E; P > 0,05). Enquanto isso, foi detectada a expressão de c-myc em células de GC como controlo positivo transfectadas com miR-24 [20]. Descobrimos que miR-24 subregulado RegIV e c-MYC (arquivo adicionais 4: Figura S4A e S4B).
Estudos anteriores demonstraram que RegIV foi associada com a proliferação e metástase de GC. A seguir, usou a análise imuno-histoquímica para avaliar a expressão de RegIV no GC. Nossos achados confirmam superexpressão de RegIV no GC. O nível de proteína de RegIV na mucosa gástrica normal, foi menor do que a metaplasia intestinal do estômago e carcinoma de células em anel de sinete gástrica (Figura 4F-H). Para avaliar a relevância clínica destes resultados, examinamos a correlação entre as expressões de RegIV e miR-24 em tecidos de GC. Descobrimos que RegIV e miR-24 exibiram um padrão de expressão nos tecidos inversa GC (Tabela 2). Estes resultados suportam a noção de que a regulação baixa de miR-24 resultou em aumento dos níveis de proteína de RegIV em GC.Table 2 RegIV e miR-24 padrão de expressão exposição inversa em GC
miR-24 expressão
valor P
Baixa
alta
Reg IV (IHC)
negativo
9
16
0,038 *
positiva
25
13
* P Art < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo
sobre-expressão de miR-24 inibe a tumorigenicidade in vivo
Dado que miR-24 melhorou a. proliferação de células GC in vitro
, examinamos se miR-24 poderia afetar tumorigenicidade in vivo
. SGC-7901 /miR-24 e linhas celulares estáveis ​​/miR-controlo SGC-7901 foram obtidos como descrito na secção de Métodos mediada por retrovírus. células /RV-miR-controlo SGC-7901 SGC-7901 /VR-miR-24 e foram injectados subcutaneamente em ratinhos nus machos com quatro semanas de idade, e a formação do tumor foi monitorizado. Os tumores cresceram mais lentamente no SGC-7901 /VR-miR-24 grupo do que aqueles no grupo /RV-miR-controlo SGC-7901 (Figura 5A). O volume médio do tumor em ratos inoculados com SGC-7901 /RV-miR-24 células no dia 28 foi significativamente menor em comparação com camundongos inoculados com células /RV-miR-controle SGC-7901 (397.45 ± 93,07 milímetros 3 vs. 1083.56 ± 101,56 milímetros 3, respectivamente) (Figura 5B e C; p < 0,05). Figura 5 miR-24 inibiu a tumorigenicidade e proliferação in vivo. (A) A fotografia de tumores derivados de RV-miR-24 ou RV-miR-controle de células em ratinhos nus. cinética (B) crescimento de tumores em ratinhos nus. diâmetros de tumor foram medidos a cada 7 dias. O volume dos ratinhos nus indicado por barras, S.D. (* P < 0,05). (C) A massa média dos tumores em ratinhos nus. Os dados são apresentados como média ± S.D. (* P < 0,05). (D) fotografias representativas de análise imuno-histoquímica do antígeno Ki-67 em tumores de camundongos nus (ampliação original, 200 ×). (E) índice proliferativo Representante de tumores em RV-miR-24 e RV-miR-controle de ratos nus. Os dados são apresentados como média ± S.D. (** P < 0,05). (F) Os níveis de expressão de RegIV em tecidos de tumor de ratinhos nus. Os dados são apresentados como média ± S.D. (* P < 0,05). (G) Os níveis de expressão de mRNA em tecidos tumorais RegIV de ratinhos nus (P > 0,05). Os dados são apresentados como média ± S.D. de três experiências independentes.
Para avaliar se a inibição do crescimento do tumor em células SGC-7901 /VR-miR-24 foi parcialmente devido à supressão da proliferação, imuno-histoquímica de tecidos tumorais foram realizadas. Como mostrado com Ki-67 antigénio coloração, o crescimento do tumor diminuiu em ratinhos injectados com células SGC-7901 /VR-miR-24 pode ser parcialmente devido a proliferação inferior causada pela sobre-expressão de miR-24. A percentagem de células Ki-67-antigénio-positivas foi menor no tumor derivado de /RV-miR-24 células SGC-7901 do que o tumor derivado de células /RV-miR-controlo SGC-7901 (37,1% ± 3,6% vs . 79,5% ± 5,2%, respectivamente) (Figura 5D e e; P < 0,01). O nível de expressão de RegIV como determinado por ELISA foi menor no tumor derivado de células que sobre-expressam o miR-24 do que o tumor derivado de células de controlo (1,77 ± 0,15 ng /ml em SGC-7901 /VR-miR-24 vs 3,13 ± 0,25 ng /ml em SGC-7901 /VR-miR-controlo) (Figura 5F; P < 0,05). No entanto, não houve diferença estatística na expressão relativa de ARNm RegIV (Figura 5G). Portanto, a tumorigenicidade de /-miR-24 RV células SGC-7901 foram significativamente reduzidos in vivo
.
Discussão
Evidências acumuladas apoiou papéis importantes para miRNAs, que atuam tanto como supressores tumorais ou oncogenes, em GC [21-23]. Além disso, muitos miARNs ter sido demonstrado que exibem potencial terapêutico. Devido à sua função como reguladores mestre do genoma e novo mecanismo de acção, miARNs são considerados uma tecnologia promissora para o desenvolvimento terapêutico [24]. miR-26a tem propriedades anti-tumorigénica e potencial utilidade terapêutica para o cancro do fígado in vitro e in vivo

, e estava associada com a inibição rápida e sustida da proliferação de células de cancro e altamente específico de indução de morte de células tumorais [25]. O mecanismo específico dos papéis de miARNs desreguladas na carcinogénese gástrica permanece elusiva.
Neste estudo, foi demonstrado os efeitos inibidores de miR-24 sobre a metástase do tumor ao nível clínico, celular e molecular e num modelo animal experimental. Nós fornecida evidência experimental detalhada mecanicista para o papel do miR-24 em GC, suprimindo a expressão da RegIV. Estudos mostraram que o miR-24 pode actuar como oncogene em efusões malignas [26], carcinoma oral [27, 28], o cancro da próstata [3] e o cancro do pulmão [29, 30], mas pode actuar como um supressor tumoral no cancro do cólon [ ,,,0],19] e tumores retinoblastoma [31]. Lal A et al. verificaram que a proliferação de miR-24 inibiu a célula e a progressão do ciclo celular através da supressão da expressão de E2F2, myc e outros genes reguladores do ciclo celular através da ligação a elementos de reconhecimento de miARN 3'UTR "sem semente" [20]. Wu J et al. relataram que a transfecção de miR-24 em células de GC reduzida a expressão de proteína AE1, o que resultou na inibição da proliferação celular [32]. No entanto, os mecanismos subjacentes completas para miR-24 em GC ainda não são claros.
Nosso relatório identificou miR-24 como um supressor tumoral candidato no GC. Encontramos regulação negativa da expressão de miR-24, tanto em tecidos GC e linhas celulares. A sobre-expressão de miR-24 em células SCG-7901 GC reduziu significativamente a proliferação e invasão in vitro e in vivo

, revelando o efeito terapêutico potencial do miR-24 em GC. O resultado foi obtido quando oposto a expressão de miR-24 foi inibida por anticorpos anti-miR-24. Em conjunto, estes resultados sugerem que o miR-24 pode funcionar como um supressor do tumor em GC humana.
MiARNs ligam-se a aperfeiçoar ou complementares sequências de "semente" imperfeitas em mRNAs alvo, levando a clivagem do ARNm alvo ou inibição da sua tradução [33] . Neste estudo, identificaram-RegIV como um gene alvo de miR-24. miR-24 ligado com complementaridade incompleta ao ARNm RegIV, resultando em inibição da translação directa de ARNm RegIV mas sem efeito sobre a estabilidade global do mRNA. Dado que os diferentes modos de acção miARN, miR-24 não afectou o nível de ARNm de RegIV mas a inibição de translação. RegIV é um membro da família do gene Reg humano, que partilha a similaridade de sequência com o domínio de ligação ao hidrato de carbono de lectinas do tipo C, e foi isolado pela primeira vez e caracterizado por a doença inflamatória do intestino humana [34]. RegIV é um tipo de proteínas segregadas, e desempenha um papel biológico, dependendo das proteínas secretadas extracelulares, de modo que tomámos ELISA como método de detecção preferido. Western blot também foi realizado para avaliar o nível de proteína de RegIV, e foram obtidos os resultados semelhantes. Estudos anteriores relataram que o gene RegIV era frequentemente sobre-expressos em GC e é potencialmente envolvidos na invasão, metástase, e carcinogênese do GC. expressão RegIV foi estreitamente limitado em tecidos não cancerosos [35, 36]. expressão RegIV foi marcadamente maior em pacientes com metástase peritoneal em comparação com aqueles sem metástase peritoneal. RegIV pode acelerar a metástase peritoneal em GC e níveis de fluidos de lavagem poderia servir como um bom marcador para a metástase peritoneal [37-39]. RegIV pode funcionar como um biomarcador para doentes soro GC e inibe a apoptose induzida por 5-FU por indução de Bcl-2 e da di-hidropirimidina desidrogenase [40].
No presente estudo, nós identificada miR-24 como um regulador potencial a montante do RegIV. Em primeiro lugar, a sobre-expressão de miR-24 diminuiu a actividade de um gene repórter da luciferase contendo o 3 'UTR de RegIV, enquanto mutação dos locais de "semente" de região na 3'UTR de RegIV aboliu o efeito regulador de miR-24. O resultado oposto foi obtido quando usamos anti-miR-24. Em segundo lugar, os tecidos GC humanos expressaram níveis significativamente mais baixos de miR-24 do que os tecidos não tumorais, enquanto os tecidos de GC contêm níveis significativamente mais elevados de proteína do que RegIV tecidos não tumorais. Em terceiro lugar, a sobre-expressão de miR-24 regulada negativamente RegIV ao nível da proteína, enquanto que a regulação negativa de miR-24 aumentou o nível de proteína RegIV. Quarta, a superexpressão de miR-24 foi significativamente relacionada com a proliferação e metástase, indicando uma sobreposição funcional com RegIV. Todos estes resultados indicam que RegIV pode ser um gene alvo directo de miR-24 em GC.
Carcinogénese é uma série de eventos sequenciais, incluindo descolamento, migração, invasão local, angiogénese, intravasamento, sobrevivência no sistema circulatório, e o extravasamento rebrota em órgãos diferentes [41, 42]. Aqui nós mostramos que miR-24 poderia regular a carcinogénese da GC através da proliferação de modulação, migração e invasão local. Além disso, a evidência sugere a possibilidade de miR-24 como um alvo terapêutico em GC. Mais estudos são necessários para compreender totalmente os mecanismos detalhados de miR-24 na carcinogênese GC e como uma potencial abordagem terapêutica.
Métodos
Declaração ética
consentimento informado escrito foi obtido de todos os participantes, e protocolo de estudo foi aprovado pelo comitê de ética de Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Todas as experiências de rato foram aprovados pelo Animal Care (Permit.120.810) e Comitê de Uso e conduzida de acordo com as recomendações oficiais dos cuidados e da utilização Animais de Laboratório de Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. As linhas celulares

As linhas de células humanas SNU GC-1, SNU-16, NCI-N87, e KATO III foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC). As linhas celulares SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, e AGS foram adquiridos a partir de Xangai Institutos de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências. A linha imortalizada normal de mucosa gástrica células epiteliais (GES-1) foi um presente do Prof. Feng Bi (Huaxi Médico Universitário, Chengdu, província de Sichuan, PR China). A linha celular de rim embrionário 293 T foi preservada no nosso laboratório e mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 10% (FBS) a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO 2. Todas as células foram cultivadas GC em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% numa incubadora humidificada com 5% de CO 2 a 37 ° C. As amostras de tecido
tecidos cancro primário e tecidos não tumorais adjacentes emparelhados foram recolhidos de pacientes com GC foram submetidos a gastrectomia radical no Departamento de Cirurgia do Hospital Ruijin, Escola de Medicina da Universidade Shanghai Jiao Tong. Os tecidos normais adjacentes foram obtidos ao longo de 5 cm do cancro primário. As amostras de tecidos foram imediatamente congelados instantaneamente em azoto líquido e armazenadas num frigorífico a -80 ° C. Os tecidos para imuno-histoquímica foram fixadas em paraformaldeído a 4% e embebidos em parafina. dados clínico-patológicos foram revisados, e classificação TNM foi baseada nos critérios do Comité Misto Americana do Câncer (AJCC, 6ª edição). Todas as amostras foram verificadas por exame patológico.
Isolamento de ARN e qRT-PCR
ARN total foi isolado a partir de amostras de tecidos e linhas celulares utilizando Trizol reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Os níveis de expressão miARNs foram avaliados usando o Hairpin-ITTM miARNs qPCR Quantificação Kit (GenePharma, Shanghai, PR China) seguindo o protocolo do fabricante. O U6 ARN nuclear pequeno (RNU6B; GenePharma) foi utilizado para normalização. A proporção relativa de expressão de miR-24 em cada tecido tumoral e não tumoral emparelhado foi calculada usando o método -ΔΔCT 2 . O nível de expressão de miR-24 foi definido como supra-regulada quando a relação de expressão relativa foi > 1, e definido como regulada negativamente quando a relação de expressão relativa era < 1. de três experiências independentes. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

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