Kasvain vaimennin miR-24 hillitsee mahasyövän etenemisen vähen- tämisessä RegIV

Tuumorisuppressori miR-24 pidättää mahasyövän etenemisen vähen- tämisessä RegIV
Abstract
tausta
MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavaa RNA: ita, jotka moduloivat erilaisia ​​soluprosesseja säätelemällä useita tavoitteita, jotka voivat edistää tai estää kehitystä pahanlaatuisia käyttäytymistä . Kertyvät todisteet osoittavat miR-24 on merkittäviä rooleja ihmisen syövän synnyn. Kuitenkin sen tarkka biologinen rooli jää suurelta osin hämäräksi. Tutkimuksessa selvitettiin roolia miR-24 mahasyövän (GC). Tool Menetelmät
ilmentyminen miR-24 GC kudoksissa verrattuna sovitetun kuin kasvain kudosten ja GC solujen havaittiin qRT-PCR. Synteettisiä lyhyitä yksi- tai kaksijuosteisia RNA-oligonukleotidien ja lentivirusvektoreita käytettiin säädellä miR-24 ilmentyminen GC-soluissa tutkia sen toiminnon in vitro
ja in vivo
.
Tulokset
miR-24 oli merkitsevästi vaimentua GC kudoksissa verrattuna sovitetun kuin kasvain kudosten ja liittyi kasvaimen erilaistumiseen. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-24 SGC-7901 GC solujen tukahdutetaan solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota in vitro
sekä kasvainten muodostumiseen in vivo
indusoimalla solusyklin pysähtymisen G0 /G1 vaihe ja edistää solujen apoptoosin. Lisäksi tunnistimme RegIV kuin tavoitteeksi miR-24 ja osoitti, että miR-24 säädellään RegIV ilmentymisen sitoutumalla sen 3'-transloimaton alue.
Päätelmät
miR-24 toimii uutena tuumorisuppressori GC ja anti -oncogenic aktiivisuus voi liittyä sen esto kohdegeenin RegIV. Nämä havainnot viittaavat siihen mahdollisuuden miR-24 terapeuttisena kohteena GC.
Avainsanat
miR-24 RegIV Mahasyöpää leviämisen Invasion Metastasis tausta
Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä ihmisen syöpien. Vaikka ilmaantuvuus ja kuolleisuus ovat vähentyneet maailmanlaajuisesti viimeisten 20 vuoden aikana, GC yltää neljänneksi yleisin ja toiseksi eniten tappava syöpä maailmassa [1]. Vaikka tutkimus GC on edistynyt suuresti, molekyylitason mekanismeista GC vieläkään ei ole täysin selvitetty.
MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaava kaksijuosteinen RNA-molekyylejä, jotka voivat moduloida ilmentymistä kohdegeenien vaikuttamalla post transkription prosessit geenin ilmentymisen säätelemiseksi. miRNA tunnistaa kohde-mRNA: perustuu täydellisen tai epätäydellisen sekvenssikomplementaarisuutta ja tuotannon estämiseksi proteiinin sitoutumalla 3'alue (UTR) tai avoimen lukukehyksen (ORF) kohde-mRNA [2, 3]. miRNA on osoitettu toimivan solujen lisääntymisen ja erilaistumisen prosesseihin, mukaan lukien epiteeli- mesenkymaalitransitioon [4] ja endodermaalinen erilaistumista ihmisen alkion kantasolujen [5]. Lisäksi yleisesti solun toimintoja miRNA nämä molekyylit myös tärkeä rooli erilaisissa ihmisen sairauksia. Monet tutkimukset ovat osoittaneet, että misregulation on miRNA liittyy syöpään [6, 7], joissa ne toimivat joko onkogeenien tai tuumorisuppressorit. miRNA on raportoitu olevan mukana akuutti myelooinen leukemia, rintasyöpä, ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, hepatosellulaarinen karsinooma, paksusuolen syöpä, GC ja muiden syöpien [8-13]. Yliekspressio tai alisäätely miRNA johtaa monipuolistaminen proteiinin ilmentymisen, mikä edistää kasvaimien syntyyn moduloimalla lisääntymistä, angiogeneesin ja hyökkäystä. Tutkijat havaitsivat, että miRNA ekspressioprofiileja voidaan luokitella ihmisen syöpien, ja tämä havainto oli ennen käyttöä lähetti-RNA profiilien luokittelu huonosti eriytetty kasvaimia [14, 15].
Poikkeava spesifisten miRNA GC on ollut aiemmin raportoitu ja korreloi etenemisen ja ennusteen GC [16-18]. Olemme aiemmin havainneet, että miR-24, joka voi toimia tuumorisuppressorina läpi kohdepaikkaan polymorfia [19], oli merkittävästi vaimentua miRNA GC soluissa ja kudoksissa verrattuna ei-kasvainkudoksia. Tässä tutkimuksessa kartoitettiin miR-24 ekspressiotasot GC kudoksissa verrattuna sovitetun kuin kasvain kudosten ja arvioidaan korrelaatioita miR-24 tason ja ennusteeseen viittaavia parametreja. Arvioimme vaikutus yli-ilmentymisen miR-24 kasvuun ja apoptoosin SGC-7901 GC soluissa sekä in vitro
ja in vivo
. Olemme myös päättäneet, biologisten vaikutusten downregulation miR-24 ilme GC soluissa. Lisäksi tunnistimme RegIV (Uudistava saarekesolujen johdettuja perhe, osa 4) yhtenä kohdegeenien miR-24. Oletamme, että miR-24 voi säädellä hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden GC solujen suoraan kohdistaminen RegIV geeni.
Tulokset
yliekspressio miR-24 inhiboi GC soluproliferaatiota
Tutkiakseen ilmentymisen miR-24 GC, kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (qRT-PCR) suoritettiin. Expression of miR-24 yleisesti vaimentua yhdeksällä GC solulinjoissa verrattuna kuolemattomaksi normaali mahan limakalvon epiteelisolujen GES-1 (kuvio 1A). Expression of miR-24 tutkittiin pidemmälle qRT-PCR kasvainkudoksissa ja sovitettu ei-tuumorikudoksista 63 GC potilaista (kuvio 1 B). Keskimääräinen ekspressiotaso miR-24 oli merkittävästi vaimentua kasvainkudoksissa verrattuna sovitetun kuin tuumorikudoksista (kuvio 1 C). Yhdessä nämä tulokset esiin vahvaa näyttöä siitä, että miR-24 oli merkittävästi vaimentua GC. Kuva 1 miR-24 on merkittävästi vaimentua GC ja esti SGC-7901 solujen kasvua. (A) Suhteellinen ilmentyminen miR-24 yhdeksässä GC solulinjoissa verrattuna GES-1 määritetään qRT-PCR kolmen erillisen kokeen (** P < 0,01, *** P < 0,001). (B) Suhteellinen ilmentyminen miR-24 kirurgisista näytteistä 63 GC määräytyy qRT-PCR. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena. Data näytetään -ΔΔCT arvoja, S.D. ei näytetty. (C) keskiarvo ja keskihajonta miR-24 ekspressiotasot kirurgisista näytteistä 63 GC kudosten ja sovitettu ei-tuumorikudoksissa näkyvät. Tiedot esitetään 2-ACt-arvot (** P < 0,05). U6 snRNA käytettiin normalisointia. (D) miR-24 esti kasvua SGC-7901-soluissa havaittuna WST, kun taas anti-miR-24 lisäsi solujen kasvua (* P < 0,05). Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.
Seuraavaksi me tarkasteltiin korrelaatioita ilmentymistaso miR-24 ja ennusteeseen viittaavia tekijöitä ihmisen GC. Kliiniset ja patologinen ominaisuudet 63 GC potilaille annetaan taulukossa 1. Perustuen suhteelliseen ilmentymisen suhde miR-24 /U6 = 1, tapaukset jaettiin kahteen ryhmään: miR-24 korkean ilmentymisen ryhmässä (n = 29) ja miR-24 matalan ilmentymisen ryhmässä (n = 34). MIR-24 matalan ilmaisu ryhmä osoitti merkittävästi alhaisempi kasvaimen erilaistumiseen (P = 0,021). Kuitenkin miR-24 ilmentymistaso ei osoittanut mitään suhdetta iän, sukupuolen, kasvain sivusto, syvyys paikallisen invaasion, imusolmuke etäpesäke tai TNM stage.Table 1 suhde miR-24 ekspressiotason ja ennusteeseen viittaavia muuttujien 63 GC potilaat
ennusteeseen viittaavia parametreja
miR-24 ilmentyminen
P arvo
korkea (n = 29)
matala (n = 34)

Sukupuoli
Mies
17
21
0,799
Female
12
13
Ikä (vuosia)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
Kasvain sijainti
Distal kolmas
8
8
0,310
Lähi kolmas
6
13
noin kolmanneksen
15
13
WHO: n luokituksen
Adenokarsinooma
25
28
0,155
Signet-rengas karsinooma
1
5
mucinous adenokarsinooma
3
1
erilaistuminen
No, kohtalaisen
15
8
0,021
Huonosti
14
26
Borrmann luokitus
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
Paikallinen invaasio
T1 /T2
1
7
0,098
T3 /T4
28
27
Imuneste etäpesäke
Ei
6
4
0,535
Kyllä
23
30
etäpesäkkeiden
Ei
28
31
0,724
Kyllä
1
3
TNM
I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
tutkimiseksi biologisen toiminnan miR-24 kehittymistä ja etenemistä GC, transfektoimme SGC-7901-solujen miR-24 jäljittelee (SGC-7901 /miR-24) tai miR-24-estäjä (SGC-7901 /anti-miR-24). Kuten esitetään Additional tiedosto 1: Kuva S1A ja S1B, valitsimme 100 nM sopiva pitoisuus seuraavissa kokeissa. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-24 SGC-7901-soluissa varmistettiin qRT-PCR. Seuraavaksi tutkimme soluproliferaatiota WST määrityksessä. Yli-ilmentymisen miR-24 esti kasvuvauhti SGC-7901-soluissa verrattuna miR-ohjaus transfektoiduissa soluissa (P < 0,05), kun taas anti-miR-24 lisäsi solujen kasvua toimintaa (P < 0,05, kuvio 1 D).
yli-ilmentyminen miR-24 estää migraation ja invaasion GC solujen
Seuraavaksi arvioitiin vaikutuksen miR-24 solumigraatio ja hyökkäyksen GC. Solujen migraation ja invaasion määritykset osoittivat, että yli-ilmentyminen miR-24 tukahdutetaan solumigraation (SGC-7901 /miR-24 ryhmä, 63,0 ± 3,6 solua alalla kontrolliryhmään, 126,3 ± 7,0 solua kenttä; P < 0,05) ja invaasio ( SGC-7901 /miR-24 ryhmä, 34,7 ± 2,1 solua alalla kontrolliryhmään, 63,7 ± 3,5 solua kenttä; P < 0,05) (kuvio 2A, B). Sen sijaan knockdovvn miR-24 lisäsi merkittävästi solujen vaeltamiseen (SGC-7901 /anti-miR-24 ryhmä, 182,3 ± 5,0 solua alalla kontrolliryhmään, 105,3 ± 3,8 solua kenttä; P < 0,01) ja invaasio (SGC -7901 /anti-miR-24 ryhmä, 124,3 ± 3,8 solua alalla kontrolliryhmään, 62,7 ± 2,5 per kenttä; P < 0,01) (kuvio 2A, C). Kuvio 2 miR-24 esti muuttoliike ja hyökkäys SGC-7901-soluissa. (A) edustaja aloilla SGC-7901-solujen Transvvell- määrityksissä. (B, C) edustaja aloilla SGC-7901-solujen migraation ja invaasion määrityksissä, vastaavasti. Keskimäärin muuttoliikkeen ja invaasion solua kentän kolmesta itsenäisestä kokeesta (* P < 0,05, ** P < 0,01).
Yliekspressio miR-24 edistää apoptoosia GC solujen ja indusoi solukierron pidätyksen G0 /G1 vaihe
Koska havaittu solujen kasvu voi vaikuttaa hinnat apoptoosin ja solusyklin etenemisen, tutkimme vaikutuksia miR-24 apoptoosiin ja solusyklin in vivo
virtaussytometrialla. Olemme havainneet, että noin 12-15% of SGC-7901 /miR-24-solut osoittivat morfologisia tyypillisiä piirteitä apoptoosin, mukaan lukien kondensoidaan chromatin ja ydinvoiman pirstoutumista Hoechst33342 värjäämällä DNA sisällöstä. Sen sijaan, kun osuus harvinainen spontaanin apoptoosin SGC-7901-soluissa, SGC-7901 /anti-miR-24 ryhmä ei osoittanut mitään merkittäviä muutokset Hoechst33342 värjäytymistä (kuvio 3A). Virtaussytometria osoitti, että apoptoottinen nopeus lisääntyi merkitsevästi SGC-7901 /miR-24-soluissa verrattuna säätökennoja (13,62% ± 1,25% vs. 6,15% ± 0,95%, vastaavasti; P < 0,01), ja merkitsevästi väheni SGC -7901 /anti-miR-24 verrattuna kontrolleihin (3,92% ± 0,52% vs. 6,35% ± 0,83%, vastaavasti, P < 0,05) (kuvio 3B, D).
edelleen selvittämiseksi mekanismi asennuspalveli- 24-välitteistä kasvun inhibition GC soluja, solusyklin analyysi suoritettiin (kuvio 3C, E). Kun ylössäätely miR-24, prosenttiosuus solujen G0 /G1 faasi kasvoi 40,51% ± 3,15% kontrolleissa on 72,24% ± 3,65% (P < 0,01), kun taas pudotus miR-24 vähensi solujen prosenttiosuus on G0 /G1 vaihe välillä 42.35% ± 2,78% vuonna säätimet 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Kuva 3 miR-24 indusoi apoptoosia ja G0 /G1 solusyklin pysähtymiseen. (A) edustaja histogrammit esittävät ydinvoiman morfologia SGC-7901-solujen transfektoitiin väliaikaisesti 100 nM miR-24 jäljittelee tai -estäjä ja niiden valvonta (Hoechst33342 värjäys, alkuperäinen suurennos 400 x). (B) edustaja histogrammit esittävät apoptoosin SGC-7901-solujen transfektoitiin väliaikaisesti 100 nM miR-24 jäljittelee tai estäjä ja niiden valvontaa. (C) edustaja histogrammit esittävät solusyklin SGC-7901-solujen transfektoitiin väliaikaisesti 100 nM miR-24 jäljittelee tai -estäjä ja niiden valvontaa. (D, E) prosenttiosuus apoptoottisten ja G0 /G1 vaihe solujen kolmen erillisen kokeen, keskiarvo ± S.D. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV on tavoite geeni miR-24
To tarkemmin tutkia mekanismeja miR-24 GC, etsittiin ehdokasta tavoite geenien bioinformatiikka. TargetScan, miRBase Tatget ja STARBASE sovellettiin etsimään mahdollisia kohteita miR-24. Niistä ennustettu tavoitteet, RegIV tunnistettiin yhdeksi kohdegeenien miR-24, ja tunnistimme yhden mahdollisen miR-24 sitoutumiskohdan sen 3'UTR (kuvio 4A). Seuraavaksi tutkimme ilmaus RegIV yhdeksässä GC soluissa ja GES-1. Huomasimme, että RegIV yliekspressoitui yhdeksällä GC soluissa verrattuna GES-1, ja näytteillä käänteinen ekspressiokuviota verrattuna miR-24 (Additional tiedosto 2: Kuva S2A ja S2B). Sen tutkimiseksi, onko 3'UTR RegIV mRNA oli toiminnallinen kohde miR-24, lusiferaasireportterigeenianalyysissä suoritettiin. Ensin arvioitiin aktiivisuus miR-24 (tai miR-ohjattu) kotransfektoitiin SGC-7901-solujen Luc-RegIV plasmidin tai Luc-RegIV-mut plasmidi (jossa oletetun miR-24 sitoutumiskohta oli mutatoitu), yhdessä PRL-TK plasmidi, joka sisältää Renilla lusiferaasigeeni sisäisenä kontrollina (kuvio 4B). -Solut ko-transfektoitiin miR-24 osoitti merkittävää vähenemistä Lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna miR-kontrolliryhmän (P < 0,05). Kuitenkin miR-24 ko-transfektoitiin Luc-RegIV-mut plasmidi ei osoittanut mitään merkittävää eroa reportteri aktiivisuus verrattuna solujen ko-transfektoitiin miR-ohjaus. Samoin anti-miR-24 lisäsi lusiferaasiaktiivisuus villityypin Luc-RegIV, mutta sillä ei ollut vaikutusta Luc-RegIV-mut plasmidi (kuvio 4C; P < 0,05). Olemme myös suorittaa lusiferaasireportterigeenianalyysissä in SNU-16 minimoida vaikutus endogeenisen miR-24. Aluksi ektooppinen ilmentyminen miR-24 SNU-16-soluissa varmistettiin qRT-PCR. Expression of miR-24 transfektoitu miR-24 jäljittelee oli noin 50 kertaa suurempi kuin miR-kontrolliryhmään SNU-16 (P < 0,01), kun taas mitään tilastollista eroa kanssa transfektio anti-miR-24 (Additional tiedosto 3: Kuva S3A). Solut kotransfektoitiin miR-24 osoitti merkittävää vähenemistä Lusiferaasiaktiivisuuden verrattuna miR-kontrolliryhmän (P < 0,001), kun taas mitään tilastollista eroa anti-miR-24 transfektio (Additional tiedosto 3: Kuva S3B ja S3C) . Nämä tulokset vahvasti osoitti, että 3'UTR RegIV sisältää suoran sitoutumiskohtia miR-24. Kuvio 4 miR-24 suunnattu 3'UTR RegIV geenin ja immunovärjäys RegIV mahalaukun kudoksissa. (A) Kaavamainen kuvaaja oletetun sitoutumiskohtien Mir-24 vuoden RegIV 3'UTR. RegIV-mut osoittaa RegIV-3'UTR kanssa mutaatio miR-24-sitoutumiskohtia. (B) miR-24 jäljittelee vaimentua aktiivisuus lusiferaasireport-, joka sisältää villin tyypin RegIV 3'UTR (* P < 0,05), mutta ei reportteri mutantti RegIV 3'UTR. (C) Anti-miR-24 lisäsi lusiferaasiaktiivisuus villityypin Luc-RegIV (* P < 0,05), mutta sillä ei ollut vaikutusta mutantti. (D) Neljäkymmentä kahdeksan tunnin kuluttua miR-24 matkivat ja valvonta transfektointi SGC-7901-soluissa, proteiini taso RegIV väheni huomattavasti verrattuna miR-ohjaus määritettynä ELISA: lla. Anti-miR-24 lisäsi ekspressiota RegIV verrattuna anti-miR-ohjaus (* P < 0,05, ** P < 0,01). (E) Kaksikymmentäneljä tuntia miR-24 matkivat tai estäjä ja vastaavat kontrolli- transfektio in SGC-7901-soluissa ei havaittu eroa mRNA taso RegIV verrattuna miR-ohjaus määritettynä qRT-PCR (P >0,05). Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. (F): n ilmentyminen ei RegIV havaittiin normaaleissa mahan limakalvoa. (G) RegIV ilmaistiin suoliston metaplasiaa mahan. (H) Vahva ilmentymistä RegIV havaittiin mahalaukun sinettisormus-rengas cell carcinoma.
Seuraavaksi tutkimme miR-24 sääntely RegIV mRNA ja proteiini tasoilla transfektoiduissa SGC-7901-soluissa. ELISA-analyysi osoitti, että RegIV proteiini tasot olivat hyvin tukahdutettiin SGC-7901 /miR-24 soluihin, kun taas RegIV proteiini tasot yläreguloituja SGC-7901 /anti-miR-24-solut (kuvio 4D; * P < 0,05, ** P < 0,01). qRT-PCR-analyysi osoitti eroa tason RegIV mRNA kaikissa transfektoiduissa solu- ryhmiä (kuvio 4E; P > 0,05). Samalla olemme havainneet ilmaus c-MYC GC-soluissa positiivisena kontrollina transfektoitu miR-24 [20]. Huomasimme, että miR-24 vaimentua RegIV ja c-MYC (Additional tiedosto 4: Kuva S4A ja S4b).
Aiemmat tutkimukset osoittivat, että RegIV liittyi leviämisen ja etäpesäke GC. Seuraavaksi me käytetään immunohistokemiallista analyysiä arvioimaan ilmentymistä RegIV GC. Meidän havainnot vahvistivat yliekspressio RegIV GC. Proteiini taso RegIV normaalissa mahan limakalvoa oli pienempi kuin suolen metaplasiaa mahan ja maha- sinettisormus-rengas cell carcinoma (kuvio 4F-H). Arvioida kliinistä merkitystä näiden havaintojen selvitimme korrelaatio ilmauksia RegIV ja miR-24 GC kudoksissa. Olemme havainneet, että RegIV ja miR-24 osoitti käänteistä ekspressiota GC kudoksissa (taulukko 2). Nämä tulokset tukevat käsitystä, että downregulation miR-24 lisännyt proteiinin tasot RegIV in GC.Table 2 RegIV ja miR-24 näytteille käänteinen ilmentämiskuviota GC
miR-24 ilme
P-arvo
matala
korkea
Reg IV (IHC) B Negatiivinen
9
16
0,038 *
Positiivinen
25
13
* P
< 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.
yliekspressio miR-24 estää kasvainten muodostumiseen in vivo
Koska miR-24 paransi leviämisen GC-solujen in vitro
, tutkimme onko miR-24 voi vaikuttaa kasvainten muodostumiseen in vivo
. Retrovirus-välitteinen SGC-7901 /miR-24 ja SGC-7901 /miR-ohjaus stabiileja solulinjoja saatiin, kuten on kuvattu menetelmät-osassa. SGC-7901 /RV-miR-24 ja SGC-7901 /RV-miR-ohjaus solua injektoitiin ihonalaisesti neljän viikon ikäisiä urospuolisia nude-hiirissä, ja kasvaimen muodostumista seurattiin. Kasvaimet kasvoivat hitaammin SGC-7901 /RV-miR-24 ryhmä kuin SGC-7901 /RV-miR-kontrolliryhmään (kuvio 5A). Keskimääräinen kasvaimen tilavuus hiirillä, jotka inokuloitiin SGC-7901 /RV-miR-24-soluja päivänä 28 oli merkitsevästi pienempi verrattuna hiiriin inokuloitiin SGC-7901 /RV-miR-kontrollisoluja (397,45 ± 93,07 mm 3 vs. 1083,56 ± 101,56 mm 3, vastaavasti) (kuvio 5B ja C; P < 0,05). Kuva 5 miR-24 inhiboi tuumorigeenisyyteen ja lisääntymistä in vivo. (A) valokuva kasvaimia peräisin RV-miR-24 tai RV-miR-ohjaus soluja nude-hiirissä. (B) kasvukinetiikka kasvaimia paljaissa hiirissä. Kasvaimen halkaisijat mitattiin 7 päivän välein. Tilavuus nude-hiirten merkitty baareja, S.D. (* P < 0,05). (C) keskipaino kasvainten nude-hiirissä. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.D. (* P < 0,05). (D) edustaja valokuvia immunohistokemiallinen analyysi Ki-67-antigeenin kasvaimissa nude-hiirten (alkuperäinen suurennos, 200 x). (E) edustaja proliferatiivinen indeksi kasvaimista RV-miR-24 ja RV-miR-ohjaus nude-hiiriin. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.D. (** P < 0,05). (F) Expression tasot RegIV kasvainkudoksissa nude-hiirten. Tiedot esitetään keskiarvoina ± S.D. (* P < 0,05). (G) Expression tasot RegIV mRNA tuumorikudoksissa nude-hiirten (P > 0,05). Data näytetään keskimääräisenä ± S.D. kolmen itsenäisen kokeen.
Sen arvioimiseksi, onko kasvaimen kasvun estäminen in SGC-7901 /RV-miR-24-solujen johtui osittain tukahduttaminen leviämisen immunohistokemiallinen analyysit kasvainkudosnäytteet tehtiin. Kuten on esitetty Ki-67-antigeenin värjäys, alentunut kasvaimen kasvua hiirissä, joihin injektoitiin SGC-7901 /RV-miR-24 solut voivat olla osittain, koska alemman leviämisen aiheuttama yliekspressio miR-24. Prosenttiosuus Ki-67-antigeeni-positiivisten solujen oli alempi kasvaimen peräisin SGC-7901 /RV-miR-24-soluissa kuin kasvain on peräisin SGC-7901 /RV-miR-ohjaus soluja (37,1% ± 3,6% vs. . 79,5% ± 5,2%, vastaavasti) (kuvio 5D ja E; P < 0,01). Ilmentymisen taso RegIV, kuten määritettiin ELISA: lla oli pienempi kasvaimen peräisin soluista, jotka yli-ilmentävät miR-24 kuin kasvain on peräisin kontrollisoluja (1,77 ± 0,15 ng /ml SGC-7901 /RV-miR-24 vs. 3,13 ± 0,25 ng /ml SGC-7901 /RV-miR-ohjaus) (Kuva 5F; P < 0,05). Kuitenkin, ei ollut tilastollista eroa suhteellisen ekspression RegIV mRNA: ta (kuvio 5G). Siksi tuumorigeenisyyteen on SGC-7901 /RV-miR-24-solut olivat vähentyneet huomattavasti in vivo
.
Keskustelu
Kertyvät näyttöä on tukenut tärkeitä rooleja miRNA, jotka toimivat joko tuumorisuppressorien tai onkogeenien, vuonna GC [21-23]. Lisäksi monet miRNA on osoitettu olevan terapeuttista potentiaalia. Koska niiden toiminta päällikön sääntelyviranomaisten genomin ja uusi vaikutusmekanismi, miRNA pidetään lupaava teknologia terapeuttista kehittämiseen [24]. miR-26a on antitumorigenic ominaisuuksia ja tehokkaan terapeuttisen hyödyn maksasyövän in vitro
ja in vivo
, ja liittyi nopeasti ja pysyvästi esto syöpäsolujen lisääntymistä ja erittäin spesifinen induktio kasvainsolun kuoleman [25]. Erityinen mekanismi roolien säädeltyyn miRNA vuonna mahasyövän edelleen heikko.
Tässä tutkimuksessa osoitimme estovaikutukset miR-24 tuumorietäpesäke kliinisen, solu- ja molekyylitason ja kokeellinen eläinmallissa. Annoimme yksityiskohtainen mekanistinen kokeellista näyttöä rooliin miR-24 GC tukahduttamalla ilmaus RegIV. Osoittivat, että miR-24 voi toimia onkogeenin pahanlaatuisten effusions [26], suun karsinooma [27, 28], eturauhassyöpä [3] ja keuhkosyöpä [29, 30], mutta se voi toimia tuumorisuppressori paksusuolensyöpä [ ,,,0],19] ja retinoblastoomakasvaimien [31]. Lal et al. havaitsi, että miR-24 esti solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen tukahduttamalla ilmaus E2F2, MYC ja muut solusykliä säätelygeenit sitoutumalla "siemenettömiä" 3'UTR miRNA tunnustamista elementtejä [20]. Wu J et al. raportoitu, että transfektio miR-24 osaksi GC soluihin vähensi ilmentyminen AE1 proteiinia, mikä johti inhiboimaan solujen proliferaatiota [32]. Kuitenkin täydellinen taustalla mekanismeja miR-24 GC eivät ole vielä selvillä.
Raporttimme tunnistettu miR-24 ehdokkaana tuumorisuppressori GC. Löysimme downregulation miR-24 ilmentyminen sekä GC kudoksissa ja solulinjoissa. Yli-ilmentymisen miR-24 SGC-7901 GC solujen vähensi lisääntymistä ja invaasio sekä in vitro
ja in vivo
, paljastaen mahdollista terapeuttista vaikutusta miR-24 GC. Päinvastainen tulos saatiin, kun ilmentymisen miR-24 estyi anti-miR-24. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että miR-24 voi toimia tuumorisuppressorina ihmisen GC.
MiRNA sitoutuvat täydellinen tai epätäydellinen täydentävä "siemen" sekvenssit kohde-mRNA: iden, mikä johtaa pilkkomalla kohde- mRNA: iden tai estämiseksi niiden käännös [33] . Tässä tutkimuksessa tunnistimme RegIV tavoitteeksi geeni miR-24. miR-24 sidottu puutteellisilla komplementaarisuudella RegIV mRNA, johtaen suoraan translaation esto RegIV mRNA mutta ilman vaikutusta yleiseen mRNA vakauteen. Koska eri toiminta liikennemuotojen miRNA, miR-24 ei vaikuttanut mRNA tasoon RegIV mutta translaation esto. RegIV on jäsen ihmisen Reg geeniperheen, joka jakaa sekvenssin samankaltaisuutta hiilihydraattia sitovan domeenin C-tyypin lektiinejä, ja eristettiin ensimmäisen kerran, ja tunnettu siitä, ihmisen tulehduksellinen suolistosairaus [34]. RegIV on yksi tyyppi eritettyjen proteiinien, ja sillä on biologinen rooli riippuen solunulkoista eritetyt proteiinit, niin että otimme ELISA edullisena havaitsemismenetelmä. Western blot suoritettiin myös vahvistaa proteiinin taso RegIV, ja saimme samanlaisia ​​tuloksia. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että RegIV geeni usein yli-ilmennetään GC ja on mahdollisesti osallisena invaasio, etäpesäkkeitä, ja syövän syntymistä GC. RegIV ilmentyminen oli niukasti rajoitettu noncancerous kudoksissa [35, 36]. RegIV ilme oli huomattavasti korkeampi potilailla, joilla oli vatsakalvon etäpesäkkeitä verrattuna ilman vatsakalvon etäpesäke. RegIV saattaa kiihdyttää vatsakalvon etäpesäke GC ja tasoilla huuhtelunäytteen voisi toimia hyvänä merkkiaine vatsakalvon etäpesäke [37-39]. RegIV voi toimia seerumin biomarkkeri GC potilaille ja estää 5-FU: n indusoiman apoptoosin induktion Bcl-2 ja dihydropyrimidiinidehydrogenaasin [40].
Nykyisessä tutkimuksessa olemme määritelleet miR-24 mahdollisena ylävirtaan säätelijä RegIV. Ensimmäinen, yliekspressio miR-24 vähensi aktiivisuutta lusiferaasireportterigeeniin sisälsi 3'UTR RegIV, kun mutaatio "siemen alueella" sivustoja 3'UTR RegIV poistetaan sääntelyn vaikutus miR-24. Vastakkainen tulos saatiin, kun käytimme anti-miR-24. Toiseksi, ihmisen GC kudosten ilmaistaan ​​huomattavasti vähemmän miR-24 kuin ei-tuumorikudoksissa, kun taas GC kudokset sisältävät merkittävästi korkeampia RegIV proteiinia kuin ei-kasvainkudoksia. Kolmanneksi, yliekspressio miR-24 vaimentua RegIV proteiinitasolla, kun taas downregulation miR-24 lisäsi RegIV proteiinin tasolla. Neljänneksi, yli-ilmentyminen miR-24 oli merkitsevästi liittyvät leviämisen ja etäpesäkkeiden, osoittaa toiminnallinen päällekkäisyys RegIV. Kaikki nämä tulokset osoittavat, että RegIV voisi olla välitön tavoite geenin miR-24 GC.
Karsinogeneesi on sarja peräkkäisiä tapahtumia, kuten irtoaminen, maahanmuutto, paikallinen invaasio, angiogeneesi, intravasation, selviytyminen verenkiertoelimistön, ekstravasaatio ja regrowth eri elimissä [41, 42]. Tässä osoitimme, että miR-24 voisi säädellä syövän synnyn GC moduloimalla solujen lisääntymisen, migraation ja paikallinen invaasio. Lisäksi tutkimus osoittaa mahdollisuuden miR-24 terapeuttisena kohteena GC. Lisätutkimuksia tarvitaan täysin ymmärtää yksityiskohtaisia ​​mekanismeja miR-24 GC syövän synnyn ja mahdollisena terapeuttinen lähestymistapa. Tool Menetelmät
Eettinen
kirjallinen suostumus kerättiin kaikille osallistujille, ja tutkimussuunnitelma hyväksyttiin eettinen komitea Ruijin sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston School of Medicine. Kaikki hiiri kokeet hyväksynyt Animal Care (PermitÉ20810) ja käyttää komiteaa ja suoritetaan noudattaen virallisten suositusten Hoito ja käyttö Laboratory Animals of Ruijin sairaala, Shanghai Jiaotong yliopiston School of Medicine.
Solulinjat
ihmisen GC solulinjat SNU-1, SNU-16, NCI-N87, ja KATO III hankittiin American Type Culture Collection (ATCC). Solulinjat SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, ja AGS ostettiin Shanghai Institutes for Biological Sciences, Kiinan tiedeakatemia. Immortalisoidut normaali mahan limakalvon epiteelisolujen linja (GES-1) oli lahja professori Feng Bi (Huaxi Medical University, Chengdu, Sichuanin maakunnassa, PR China). Alkion munuais- solulinja 293 T on säilynyt laboratoriossamme ja ylläpidetään Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa oli 5% CO 2. Kaikki GC-soluja viljeltiin RPMI 1640, johon oli lisätty 10% FBS: ää kosteutetussa inkubaattorissa 5% CO 2 37 ° C: ssa.
Kudosnäytteitä
Ensisijainen syöpäkudosten ja pariksi viereisen ei-kasvaimen kudokset kerättiin potilailta GC tehtiin radikaali gastrectomy laitoksella Kirurgian Ruijin sairaala, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Viereisen normaalit kudokset saatiin yli 5 cm: n päässä primaarisen syövän hoidossa. Kudosnäytteet välittömästi snap-pakastettiin nestetyppeen ja säilytettiin jääkaapissa -80 ° C: ssa. Kudosten immunohistokemia fiksoitiin 4% paraformaldehydi ja parafinoidut. Kliinis tiedot tarkistettiin, ja TNM lavastus luokittelu perustui kriteereihin American sekakomitean Cancer (AJCC, 6. painos). Kaikki näytteet varmistettiin patologinen tutkimus.
RNA: n eristys ja qRT-PCR
Kokonais-RNA eristettiin kudosnäytteistä ja solulinjoissa käyttämällä Trizol-reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ilmentymistasojen miRNA arvioitiin käyttäen Hiuspinni-itTM miRNA qPCR: n kvantitointi Kit (GenePharma, Shanghai, PR Kiina) seuraten valmistajan protokollaa. U6 pienet ydin-RNA (RNU6B; GenePharma) käytettiin normalisointi. Suhteellinen ilmentyminen suhde miR-24 kunkin parin kasvain- ja ei-kasvainkudoksessa laskettiin käyttäen 2 -ΔΔCT menetelmällä. MIR-24 ekspressiotaso määriteltiin voimistunut kun suhteellinen ilmaisu suhde oli > 1, ja määritellään vaimentua kun suhteellinen ilmaisu suhde oli < 1. Kaikki kirjoittajat luettu ja hyväksytty lopullinen käsikirjoitus.

• Mahalaukun versus post-pyloric ruokinta: järjestelmällinen review
• Utility intranasaalisen ketamiinia ja Midatsolaami suorittaa mahalaukun aspirates lapsilla: kaksoissokkotutkimuksessa, plasebokontrolloidussa, satunnaistetussa study