Tumor szuppresszor miR-24 korlátozza gyomorrák progresszió mTOR gátlása miatt csökken RegIV

Tumor szuppresszor miR-24 korlátozza gyomorrák progresszió mTOR gátlása miatt csökken RegIV
Abstract
alapon
mikroRNS kis nem kódoló RNS-ek, amelyek modulálják a különböző celluláris folyamatok szabályozása által többszörös célokat, amelyek elősegítik vagy gátolják a malignus viselkedés. Egyre több bizonyíték utal, miR-24 fontos szerepet játszik a humán kialakulásában. Azonban a pontos biológiai szerepe nagyrészt bizonytalan. A tanulmány a szerepe a miR-24 gyomorrákban (GC). Katalógusa Módszerek
kifejezése miR-24 GC szövetekben képest kiegyenlített, nem daganatos szövetek és sejtek GC detektáltuk qRT-PCR-rel. Szintetikus rövid egyszeres vagy kettős szálú RNS oligonukleotidok és lentivírus vektorok szabályozására használt miR-24 expresszió GC sejtek vizsgálatára a funkcióját in vitro
és in vivo
.
Eredmények
miR-24 szignifikánsan downregulált GC szövetekben képest kiegyenlített, nem tumoros szövetek és társult tumor differenciálás. Méhen kívüli kifejezése miR-24 SGC-7901 GC sejtek elfojtott sejtburjánzást, migrációs és behatolás in vitro katalógusa valamint tumorgenézisre in vivo katalógusa indukálva sejtciklus G0 /G1 fázisban és elősegíti a sejtek apoptózis. Továbbá, mi azonosított RegIV célként a miR-24, és bizonyította, hogy a miR-24 szabályozza RegIV kifejezés keresztül kötelező a 3 'le nem fordított terület. Katalógusa Következtetések katalógusa miR-24 működik, mint egy új tumor szupresszor GC és az anti -oncogenic aktivitás járhat annak gátlása a cél gén RegIV. Ezek az eredmények arra utalnak, a miR-24, mint terápiás célpont a GC. Katalógusa Kulcsszavak katalógusa miR-24 RegIV Gyomorrák proliferációs Invasion Metastasis Háttér katalógusa Gyomorrák (GC) az egyik leggyakoribb humán rák. Bár az előfordulási és halálozási csökkent világszerte az elmúlt 20 évben, a GC még a rangsorban a negyedik leggyakoribb, és a második legtöbb halálos daganat világszerte [1]. Bár a kutatás GC jelentős előrehaladást ért el, a molekuláris mechanizmusok mögöttes GC még nem teljesen tisztázott. Katalógusa mikroRNS (miRNS) kicsi kódoló kettős szálú RNS-molekulák, amelyek módosíthatják a célgének expresszióját befolyásolásával utáni transzkripciós szabályozó folyamatok génexpressziót. miRNS-ek felismerik cél mRNS-ek alapján teljes vagy nem teljes szekvencia komplementaritás és megakadályozzák a fehérje előállításában történő kötődés révén a 3 'nem transzlálódó régiót (UTR) vagy a nyitott leolvasási keret (ORF) cél-mRNS [2, 3]. miRNS kimutatták, hogy működnek a sejtproliferáció és differenciálódás folyamatokat, beleértve az epiteliális-mezenchimális átmenet [4] és endodermális differenciálódását emberi embrionális őssejtek [5]. Amellett, hogy általános celluláris funkcióit miRNS, ezek a molekulák is fontos szerepet játszanak a különböző emberi betegségek. Több tanulmány kimutatta, hogy a misregulation a miRNS kapcsolódik a rák [6, 7], amelyben működnek, mint akár onkogének vagy tumorszuppresszorok. miRNS leírták, hogy szerepet játszanak az akut mieloid leukémia, mellrák, nem kissejtes tüdőkarcinóma, hepatocelluláris karcinóma, a vastagbél rák, a GC és egyéb rákok [8-13]. Expressziót vagy downregulációját miRNS vezet diverzifikálása fehérje expresszió, hozzájárulva ezáltal a tumorigenezis modulálja proliferáció, angiogenezis és invázió. A kutatók azt találták, hogy a miRNS expressziós profilok használhatók osztályozására humán rákok, és ez a megállapítás az volt, mielőtt a használatát hírvivő RNS profilok osztályozása rosszul differenciált tumorok [14, 15].
Namika specifikus miRNS-ek GC már korábban bejelentett és korrelált progresszió és a prognózis GC [16-18]. Korábban megállapították, hogy a miR-24, amely alapul szolgálhat a tumorszuppresszor keresztül egy célterületre polimorfizmus [19], szignifikánsan downregulált miRNS GC sejtekben és szövetekben, mint a nem-tumoros szövetekben. Ebben a vizsgálatban elemeztük miR-24 expressziós szinteket GC szövetekben képest kiegyenlített, nem tumoros szövetben, és értékelni közötti korrelációk miR-24 szint és klinikai és patológiai paraméterek. Értékeltük a befolyása a overexpressziója miR-24 a növekedés és apoptózisát SGC-7901 GC sejteket mind in vitro
és in vivo katalógusa. Azt is megállapítottuk, a biológiai hatását downregulációját miR-24 expresszióját GC sejteket. Továbbá, mi azonosított RegIV (regeneráló szigetsejt-eredetű család tagja, 4), mint az egyik célgének miR-24. Feltételezzük, hogy a miR-24 képes szabályozni az invázió és metasztázis GC sejtek közvetlenül megcélzó RegIV gént. Katalógusa eredményei katalógusa túltermelése a miR-24 gátolja a GC sejtburjánzást katalógusa feltárása expressziójának miR-24 GC, kvantitatív valós idejű RT-PCR (qRT-PCR) végeztünk. Expression miR-24 általában downregulált kilenc GC sejtvonalak képest a halhatatlanná normál gyomornyálkahártya-hámsejt GES-1 (1A). Expression miR-24 vizsgáltuk tovább qRT-PCR tumorszövetmintákból kiegyenlített a nem daganatos szövetekben a 63 GC betegek (1B). Az átlagos expressziós szintje a miR-24 szignifikánsan csökkent expressziót a tumor szövetekben, mint a párosított nem tumoros szövetekben (1C). Együttesen ezek az eredmények meggyőzően bizonyította, hogy a miR-24 szignifikánsan downregulált GC. 1. ábra miR-24 szignifikánsan downregulált GC és gátolja SGC-7901 sejtek növekedését. (A) relatív expresszióját miR-24 kilenc GC sejtvonalak összehasonlítva GES-1 által meghatározott QRT-PCR három független kísérlet (** P < 0,01; *** p < 0,001). (B) relatív expresszióját miR-24 sebészeti mintákban 63 GC által meghatározott qRT-PCR-rel. Minden kísérletet három párhuzamosban végeztük. Az adatok jelennek -ΔΔCT értékek S.D. nem látható. (C) Az átlag és a szórás a miR-24 expressziós szintek műtéti mintából 63 GC szövetek és kiegyenlített a nem daganatos szövetek jelennek meg. Az adatokat 2-ΔCT értékek (** P < 0,05). U6 snRNS használták normalizálás. (D) a miR-24 gátolta a SGC-7901 sejtek által észlelt WST, míg az anti-miR-24 sejtek fokozott növekedést (* P < 0,05). Az adatokat mutatjuk átlag ± S.D. három független kísérlet. katalógusa Mi mellett vizsgálta összefüggéseinek expressziós szintje miR-24 és klinikopatológiai faktorok humán GC. A klinikai és patológiai jellemzői 63 GC betegek az 1. táblázat alapján relatív expressziós arányai miR-24 /U6 = 1, az esetek két csoportra oszthatók: A miR-24 magas expressziós csoport (n = 29) és a mIR-24 alacsony expressziós csoport (n = 34). A miR-24 alacsony expressziós csoport állatkísérletekben szignifikánsan kisebb tumor differenciálás (P = 0,021). Azonban a miR-24 expressziós szintje nem mutatott összefüggést az életkorral, nemmel, daganat helyén, a mélység, a helyi invázió, nyirokcsomó áttét, vagy TNM stage.Table 1 közötti kapcsolat miR-24 expressziós szint és a klinikopatológiai változók 63 GC betegek klinikai és katalógusa paraméterek
miR-24 expresszióját Matton P érték Matton Nagy (n = 29) Matton Low (n = 34)
katalógusa Gender Matton Férfi katalógusa 17 katalógusa 21 katalógusa 0.799 fiatal női katalógusa 12 katalógusa 13 katalógusa Életkor (év) Matton <60 katalógusa 15 katalógusa 18 katalógusa 0.923 katalógusa ≥60 katalógusa 14 katalógusa 16
tumor helyét Matton distalis harmadában katalógusa 8 katalógusa 8
0,310 katalógusa Közel harmadik katalógusa 6 katalógusa 13 katalógusa Proximal harmadik katalógusa 15 katalógusa 13
WHO besorolás Matton Adenocarcinoma katalógusa 25 katalógusa 28
0,155 katalógusa pecsétgyûrûsejtes sejtes carcinoma
1 katalógusa 5 katalógusa Mucinosus adenokarcinóma katalógusa 3 katalógusa 1 katalógusa differenciálás Matton Nos, mérsékelten katalógusa 15
8 katalógusa 0.021 katalógusa rosszul katalógusa 14 katalógusa 26 katalógusa Borrmann besorolás Matton I /II
11 katalógusa 12 katalógusa 0,828 katalógusa III /IV katalógusa 18 katalógusa 22 katalógusa Helyi invázió Matton T1 /T2 katalógusa 1 katalógusa 7 katalógusa 0.098 katalógusa T3 /T4
28 katalógusa 27
nyirokcsomó áttétek
Nem katalógusa 6 katalógusa 4 katalógusa 0,535 katalógusa Igen
23 katalógusa 30 katalógusa távoli áttét
Nem katalógusa 28 katalógusa 31 katalógusa 0,724 katalógusa Igen
1 katalógusa 3 katalógusa TNM Matton I /II
7 katalógusa 8 katalógusa 0.955 katalógusa III /IV katalógusa 22 katalógusa 26 katalógusa Vizsgálni biológiai funkciójának miR-24 kialakulásának és progressziójának GC, mi transzfektált SGC-7901 sejtek miR-24 utánzók (SGC-7901 /miR-24) vagy miR-24-inhibitor (SGC-7901 /anti-miR-24). Amint az Extra fájl 1: Ábra S1A és S1B kiválasztottunk 100 nM megfelelő koncentrációban a további kísérletekben. Méhen kívüli kifejezése miR-24 SGC-7901 sejtek igazoltuk qRT-PCR-rel. Ezután megvizsgáltuk a sejtproliferáció által WST vizsgálattal. Túlexpressziója miR-24 gátolja a növekedési ütem SGC-7901 sejtek képest miR-kontroll transzfektált sejtekben (P < 0,05), míg az anti-miR-24 sejtek fokozott növekedést tevékenységek (P < 0,05, 1D ábra).
túltermelése miR-24 gátolja a migrációt és inváziót GC sejtek katalógusa Következő értékeltük hatását miR-24 sejtek migrációját és invázióját a GC. Sejtvándorlásban és invázióban vizsgálatokban azt mutatta, hogy overexpressziója miR-24 elnyomott sejtmigrációt (SGC-7901 /miR-24 csoport, 63,0 ± 3,6 sejt per területen; kontrollcsoport, 126,3 ± 7,0 sejt per mező; p < 0,05) és invázió ( SGC-7901 /miR-24 csoport, 34,7 ± 2,1 sejt per téren; kontrollcsoportban 63,7 ± 3,5 sejt per területén; P < 0,05) (2A ábra, B). Ezzel szemben a kiütése miR-24 szignifikánsan növelte a sejtek migrációját (SGC-7901 /anti-miR-24 csoport, 182,3 ± 5,0 sejt per téren; kontrollcsoportban 105,3 ± 3,8 sejt per területén; P < 0,01) és inváziós (SGC -7901 /anti-miR-24 csoport, 124,3 ± 3,8 sejt per területen; kontrollcsoportban 62,7 ± 2,5 mezőnként; p < 0,01) (2A ábra, C). 2. ábra miR-24 gátolja a migráció és invázió SGC-7901 sejtek. (A) Reprezentatív területein SGC-7901 sejtek a transwell vizsgálatokban. (B, C) Képviselő területein SGC-7901 sejtek a migrációs és behatolás vizsgálatokban, ill. Átlagos száma migrációs és behatolás sejt per mező három független kísérletből származó (* P < 0,05, ** P < 0,01).
Túlexpressziója miR-24 elősegíti a apoptózisát GC sejtek és indukál sejtciklus G0 /G1 fázisban
Tekintettel arra, hogy megfigyelt celluláris növekedési hatással lehet az aránya az apoptózis és a sejtciklus progressziójában, hatását vizsgáltuk a miR-24 az apoptózisra és sejtciklus in vivo
áramlási citometriával. Azt találták, hogy mintegy 12-15% -a SGC-7901 /miR-24 sejtek mutattak morfológiai jellemzője, apoptózis, beleértve kondenzált kromatin és a nukleáris töredékes Hoechst33342 festéssel a DNS-tartalomra. Ezzel szemben, miután a számviteli ritka spontán apoptózist SGC-7901 sejtek, az SGC-7901 /anti-miR-24 csoport nem mutatott jelentős változást a Hoechst33342 festéssel (3A). Áramlási citometria mutatta, hogy az apoptotikus arány szignifikánsan emelkedett SGC-7901 /miR-24 sejteket, mint a kontroll sejtek (13,62% ± 1,25% vs. 6,15% ± 0,95% volt; p < 0,01), és szignifikánsan csökkent SGC -7901 /anti-miR-24 a kontrollokhoz képest (3,92% ± 0,52% vs. 6,35% ± 0,83% -kal; p < 0,05) (3B, D).
Ahhoz hogy tovább vizsgálhassuk a mechanizmus a miR 24 által közvetített növekedésgátlás GC sejtek sejtciklus analízist végeztünk (3C, ábra, E). Upon upreguláció miR-24, a sejtek százalékos arányát a G0 /G1 fázisban emelkedett 40,51% ± 3,15% a kontroll, hogy 72,24% ± 3,65% (P < 0,01), míg a knockdown miR-24 csökkentette a sejtek százalékos arányát a G0 /G1 fázisban 42,35% ± 2,78% a kontroll, hogy 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). 3. ábra miR-24 által indukált apoptózis és G0 /G1 sejtciklusmegállás. (A) Reprezentatív hisztogram ábrázoló nukleáris morfológiai SGC-7901 sejtek átmenetileg transzfektált 100 nM miR-24 utánozza, vagy inhibitorral, és az illető ellenőrzések (Hoechst33342 festés, eredeti nagyítás 400 ×). (B) Reprezentatív hisztogram ábrázoló apoptózist SGC-7901 sejtek átmenetileg transzfektált 100 nM miR-24 utánozza, vagy gátló és azok ellenőrzése. (C) Képviselő hisztogramok ábrázoló sejtciklus SGC-7901 sejteket tranziensen transzfektált 100 nM miR-24 utánozza, vagy inhibitorral, és az illető ellenőrzéseket. (D, E) A százalékos apoptotikus és G0 /G1-fázisban levő sejteket három független kísérlet, átlag ± S.D. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV egy cél gén miR-24 katalógusa hogy jobban megvizsgálja azokat a mechanizmusokat a miR-24 GC kerestünk kiszemelt gének bioinformatika. TargetScan, miRBase Tatget és STARBASE vittük keresni a potenciális célpontjai miR-24. Között a megjósolt célokat, RegIV azonosították, mint az egyik célgének miR-24, és azonosítottunk egy potenciális miR-24 kötőhely belül 3'UTR (4a ábra). Ezután megvizsgáltuk a kifejezés RegIV kilenc GC sejtek és GES-1. Azt találtuk, hogy RegIV volt overexpresszált kilenc GC sejtekben összehasonlítva GES-1, és a mutatott inverz expressziós mintázat összehasonlítva miR-24 (Kiegészítő fájl 2: ábra S2A és S2B). Annak vizsgálatára, hogy a 3'UTR a RegIV mRNS funkcionális célt a miR-24, luciferáz vizsgálatokat végeztünk. Először értékeltük aktivitásának miR-24 (vagy miR-vezérlés) kotranszfektáljuk SGC-7901 sejtek Luc-RegIV plazmidot vagy a Luc-RegIV-mut plazmidot (amely a feltételezett miR-24 kötőhely mutált), együtt PRL-TK tartalmazó plazmidot a Renilla luciferáz gén, mint belső kontroll (4b ábra). A sejteket kotranszfektáltuk miR-24 bizonyította jelentős csökkenést a luciferáz aktivitás összehasonlítva a miR-kontrollcsoport (P < 0,05). Azonban miR-24 co-transzfektált Luc-RegIV-mut plazmid nem mutatott szignifikáns különbséget a riporter aktivitás képest sejtekkel kotranszfektáltuk miR-ellenőrzés. Hasonlóképpen, az anti-miR-24 növelte a luciferáz aktivitás a vad típusú Luc-RegIV, de nem volt hatással a Luc-RegIV-mut plazmid (4C; p < 0,05). Mi is végeztünk luciferáz riporter gén vizsgálatokban SNU-16, hogy minimalizálja a hatása az endogén miR-24. Eleinte ectopiás expresszióját miR-24 SNU-16 sejteket igazoltuk qRT-PCR-rel. Expression miR-24 transzfektált miR-24 utánozza körülbelül 50-szer magasabb, mint a miR-kontrollcsoport SNU-16 (P < 0,01), míg a statisztikai különbség nem volt a transzfekciós anti-miR-24 (Plusz fájl 3. ábra: S3A). A sejteket kotranszfektáltuk miR-24 bizonyította jelentős csökkenést a luciferáz aktivitás összehasonlítva a miR-kontrollcsoport (P < 0,001), míg a statisztikai különbség nem volt anti-miR-24 transzfekció (Plusz fájl 3: ábra S3B és S3C) . Ezek az eredmények azt mutatták, hogy erősen 3'UTR a RegIV tartalmaz közvetlen kötőhelyek miR-24. 4. ábra miR-24 célzott 3'UTR a RegIV gén immunfestésével RegIV a gyomor szövetekben. (A) sematikus ábra a feltételezett kötőhelyek miR-24 az RegIV 3'UTR. RegIV-mut jelzi RegIV-3'UTR a mutáció miR-24-kötőhelyek. (B) a miR-24 utánozza downregulált aktivitását egy luciferáz riporter tartalmazó vad típusú RegIV 3'UTR (* P < 0,05), de nem a riporter mutáns RegIV 3'UTR. (C) Anti-miR-24 növelte a luciferáz aktivitás a vad típusú Luc-RegIV (* P < 0,05), de nem volt hatással a mutáns. (D) Negyvennyolc óra elteltével a miR-24 utánozzák és ellenőrzési transzfekciója SGC-7901 sejteket, a fehérje szintje RegIV szignifikánsan csökkent összehasonlítva a miR-vezérlés által meghatározott ELISA-val. Anti-miR-24 fokozott expressziója RegIV összehasonlítva az anti-miR-vezérlés (* P < 0,05, ** P < 0,01). (E) Huszonnégy óra után a miR-24 utánozzák vagy inhibitor, és a vonatkozó ellenőrzés transzfekció SGC-7901 sejtek, nem volt különbség a mRNS szintjén RegIV összehasonlítva a miR-vezérlés által meghatározott QRT-PCR (P >0,05). Az adatokat mutatjuk átlag ± S.D. három független kísérlet. (F) nem expresszióját RegIV kimutatható volt a normál gyomor nyálkahártyáját. (G) RegIV fejeztük intestinalis metaplasia a gyomorban. (H) Erős kifejezése RegIV volt megfigyelhető gyomor pecsétgyűrű sejtes carcinoma.
Hátralévő megvizsgáltuk miR-24 szabályozása RegIV mRNS és fehérje szint transzfektált SGC-7901 sejtek. ELISA analízis azt mutatta, hogy RegIV fehérje szintje nagymértékben elnyomják SGC-7901 /miR-24-sejtek, mivel RegIV protein szinteket felülszabályozott SGC-7901 /anti-miR-24 sejtek (ábra 4D; * P 0,05, ** P < 0,01). QRT-PCR elemzés azt mutatta, nincs különbség a szint RegIV mRNS valamennyi transzfektált sejt csoportok (ábra 4E; p > 0,05). Közben, detektált expressziója a c-Myc GC sejtekben pozitív kontrollként transzfektált miR-24 [20]. Azt találtuk, hogy a miR-24 downregulált RegIV és c-myc (Plusz fájl 4: ábra S4A és S4B).
Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a RegIV társult proliferációját és metasztázis GC. Mi a következő használt immunhisztokémiai vizsgálatok értékelésére kifejezése RegIV GC. Eredményeink megerősítik túltermelése RegIV GC. A fehérje szintje RegIV normál gyomornyálkahártya alacsonyabb volt, mint a bél metaplázia a gyomor és a gyomor pecsétgyûrûsejtes sejt karcinóma (4F-H). Annak megállapítására, klinikai jelentősége ezeknek az eredményeknek, megvizsgáltuk a korrelációt kifejezései RegIV és miR-24 GC szövetekben. Azt találtuk, hogy RegIV és miR-24 mutatott inverz expressziós mintázatot GC szövetekben (2. táblázat). Ezek az eredmények alátámasztják az elképzelést, hogy downregulációját miR-24 eredményeztek fehérje szint RegIV a GC.Table 2 RegIV és miR-24 kiállítás inverz expressziós mintázatot GC
miR-24 expresszióját Matton P érték
Alacsony Matton Nagy
Reg IV (IHC) hotelben Negatív katalógusa 9 katalógusa 16 katalógusa 0,038 *
Pozitív katalógusa 25 katalógusa 13 katalógusa * P katalógusa < 0,05 értéket tekintettük statisztikailag szignifikánsnak. katalógusa túltermelése miR-24 gátolja tumorgenézisre in vivo katalógusa Tekintettel arra, hogy a miR-24 javított a elterjedése GC sejtek in vitro katalógusa azt vizsgáltuk, hogy a miR-24 érintheti tumorgenézisre in vivo katalógusa. Retrovírus-közvetítette SGC-7901 /miR-24 és SGC-7901 /miR-vezérlés stabil sejtvonalakat leírtak szerint kapott, a Módszerek részben. SGC-7901 /RV-miR-24 és SGC-7901 /RV-miR-kontroll sejtet injektáltunk szubkután négy-hetes hím csupasz egerek, és a tumor kialakulását követtük. Tumorok növekedése lassabb az SGC-7901 /RV-miR-24 csoport, mint az SGC-7901 /RV-miR-kontrollcsoportban (5A ábra). Az átlagos tumor térfogat beoltott egerek SGC-7901 /RV-miR-24 sejteket a 28. napon szignifikánsan kisebb volt, mint a beoltott egerek SGC-7901 /RV-miR-kontroll sejtek (397,45 ± 93,07 mm 3 vs. 1083,56 ± 101,56 mm 3, sorrendben) (5B, ábra és a C; p < 0,05). 5. ábra miR-24 gátolja tumorgenézisre és szaporodását in vivo. (A) A fényképek daganatok származó RV-miR-24 vagy RV-miR-kontroll sejtek csupasz egerekben. (B) A növekedés kinetikáját tumorok csupasz egerekben. A tumor átmérőjét mértük minden 7. napon. A kötet a csupasz egerek sáv jelöli, S.D. (* P < 0,05). (C) Az átlagos tömege tumorok csupasz egerekben. Az adatokat mutatjuk átlag ± S.D. (* P < 0,05). (D) képviselője fényképeket immunhisztokémiai elemzése Ki-67 antigén tumor nude egerek (eredeti nagyítás, 200 ×). (E) képviselője proliferatív index daganatok RV-miR-24 és RV-miR-szabályozás csupasz egerekben. Az adatokat mutatjuk átlag ± S.D. (** P < 0,05). (F) expressziós szintjét a RegIV tumor szövetekben csupasz egerekben. Az adatokat mutatjuk átlag ± S.D. (* P < 0,05). (G) expressziós szintjét a RegIV mRNS tumorszövetekben nude egerek (P 0,05). Az adatokat mutatjuk átlag ± S.D. három független kísérlet.
Annak megállapítására, hogy a tumor növekedés gátlását SGC-7901 /RV-miR-24 sejtek részben annak volt köszönhető, hogy a elnyomása proliferáció, immunhisztokémiai elemzések tumorszövetekben végeztünk. Amint látható a Ki-67 antigén festés, a csökkent a tumor növekedését egerekben injektáltunk SGC-7901 /RV-miR-24 sejtek lehetnek részlegesen, mert az alacsonyabb proliferáció által okozott overexpressziója miR-24. A százalékos a Ki-67-antigén-pozitív sejtek alacsonyabb volt a tumor származik SGC-7901 /RV-miR-24 sejtekben, mint a tumor származik, SGC-7901 /RV-miR-kontroll sejtek (37,1% ± 3,6% vs . 79,5% ± 5,2% -kal) (5D ábra, E, P < 0,01). Az expressziós szintjének RegIV ELISA-val meghatározva alacsonyabb volt a tumor sejtekből származó overexpresszáló miR-24, mint a tumor származik, kontroll sejtek (1,77 ± 0,15 ng /ml SGC-7901 /RV-miR-24 vs. 3,13 ± 0,25 ng /ml SGC-7901 /RV-miR-vezérlés) (ábra 5F; P < 0,05). Azonban nem volt statisztikai különbség a relatív expresszióját RegIV mRNS (Figure 5 g). Ezért a tumorképző SGC-7901 /RV-miR-24 sejtek szignifikánsan csökkent az in vivo katalógusa.
Vita katalógusa Egyre több bizonyíték támogatta fontos szerepe miRNS, melyek vagy a tumor szupresszor vagy onkogének, a GC [21-23]. Emellett számos miRNS kimutatták, hogy mutatnak terápiás potenciálját. Mivel a függvény master szabályozók a genom és új hatásmechanizmusú, miRNS tekintik ígéretes technológia terápiás fejlesztés [24]. miR-26a van daganatellenes tulajdonságok és potenciális terápiás segédprogram májrák in vitro
és in vivo katalógusa, és társult gyors és tartós gátlását rákos sejtek szaporodását, és igen specifikus indukcióját tumorsejt halál [25]. Az a specifikus mechanizmus szerepét szabályozatlan miRNS a gyomor karcinogenezis megfoghatatlan marad. Katalógusa Ebben a tanulmányban bemutattuk gátló hatását miR-24 tumor áttét a klinikai, celluláris és molekuláris szinten, és egy kísérleti állat modell. Mi részletes mechanisztikus kísérleti bizonyíték a szerepe a miR-24 GC elnyomásával kifejezése RegIV. Tanulmányok azt mutatták, hogy a miR-24 működhetnek onkogén rosszindulatú folyadékgyülem [26], orális karcinóma [27, 28], prosztatarák [3] és a tüdőrák [29, 30], de működhet tumorszuppresszor vastagbélrákos [ ,,,0],19], és a retinoblasztóma tumor [31]. Lal A. és munkatársai. megállapították, hogy a miR-24 gátolta a sejtproliferációt, és a sejtciklus előrehaladását azáltal, hogy elnyomja az expressziója E2F2, MYC és más sejtciklust szabályozó géneket kötődve "mag nélküli" 3'UTR miRNS felismerő elemek [20]. Wu, J. és munkatársai. számolt be, hogy transzfekciója miR-24 be GC-sejtek csökkent expresszióját AE1 fehérje, amelynek eredményeként gátlására sejtproliferáció [32]. Ugyanakkor a teljes mögöttes mechanizmusait miR-24 GC még mindig nem egyértelmű.
A jelentés megállapította miR-24, mint a jelölt tumor szupresszor GC. Találtunk downregulációját miR-24-expresszió in GC szövetekben és sejtvonalakban. Túlexpressziója miR-24 SGC-7901 GC sejtek szignifikánsan csökkentette proliferáció és invázió mind in vitro és in vivo katalógusa katalógusa, és felfedi a potenciális terápiás hatása miR-24 GC. Az ellenkező eredményt kapunk, ha a kifejezés a miR-24 gátolta a anti-miR-24. Együttesen ezek az eredmények azt sugallják, hogy a miR-24 működhet, mint egy tumorszuppresszor humán GC.
MiRNS kötődnek tökéletes vagy nem tökéletes komplementer "mag" szekvenciák a megcélzott mRNS-eket, ami a hasítása cél mRNS vagy gátlását fordítási [33] . Ebben a vizsgálatban, azonosítottunk RegIV mint egy célgén miR-24. miR-24 kötött hiányos komplementaritás RegIV mRNS, így a közvetlen transzlációs gátlás RegIV mRNS de nincs hatással a teljes mRNS stabilitását. Mivel a különböző cselekvési módok miRNS, a miR-24 nem befolyásolta a mRNS szintjén RegIV de a transzlációs gátlás. RegIV tagja az emberi Reg gén család, amely megosztja szekvencia-hasonlóságot mutat a szénhidrát-kötő doménjét a C-típusú lektinek, és először izoláljuk, és azzal jellemezve, humán gyulladásos bélbetegség [34]. RegIV egyik típusa a szekretált fehérjék, és játszik biológiai szerepe függően extracelluláris szekretált fehérjék, hogy mi volt az ELISA, mint egy előnyben részesített kimutatási módszer. Western blot is végeztünk, hogy érvényesítse a fehérje szintje RegIV, és megkaptuk a hasonló eredményt. A korábbi vizsgálatok azt jelentette, hogy a RegIV gén gyakran túlzott mértékben expresszálódik GC és potenciálisan részt vesznek invázió, metasztázis, és a karcinogenezis GC. RegIV kifejezést szűken behatárolt a rákos szövetekben [35, 36]. RegIV kifejezés lényegesen magasabb volt a betegek peritoneális áttétek azokhoz képest, anélkül hashártya áttét. RegIV felgyorsíthatja hashártya áttét GC és szintek folyadékban szolgálhat jó markere hashártya áttét [37-39]. RegIV működhet, mint egy szérum biomarker GC betegek, és gátolja az 5-FU által kiváltott apoptózis indukciója a Bcl-2 és a dihidropirimidin-dehidrogenáz [40].
A jelenlegi vizsgálatban azonosítottunk miR-24, mint egy potenciális upstream szabályozóját RegIV. Először is, túltermelése miR-24 csökkentette az aktivitást egy luciferáz riporter gént tartalmazó 3'UTR a RegIV, míg mutáció a "mag régió" helyek a 3'UTR a RegIV eltörölte a szabályozó hatását miR-24. Az ellenkező eredményt kaptuk, amikor használt anti-miR-24. Másodszor, a humán GC szövetekben expresszált szignifikánsan alacsonyabb miR-24, mint a nem tumoros szövetben, míg a GC szövetek tartalmaznak szignifikánsan magasabb RegIV fehérje, mint a nem tumoros szövetekben. Harmadszor, túltermelése miR-24 downregulált RegIV fehérje szinten, míg downregulációját miR-24 emelkedett RegIV fehérje szintje. Negyedszer, túltermelése miR-24 szignifikánsan összefügg proliferáció és metasztázis, jelezve a funkcionális átfedés RegIV. Mindezek az eredmények arra utalnak, hogy RegIV lehet egy közvetlen célgént miR-24 GC.
Carcinogenesis egy sor egymást követő események, beleértve leválás, a migráció, a helyi invázió, angiogenezis, intravasation, túlélés a keringési rendszerben, extravazáció és újulat különböző szervekben [41, 42]. Itt azt mutatta, hogy a miR-24 képes szabályozni a karcinogenezis GC keresztül modulációs szaporodása, migrációja és helyi invázió. Továbbá, a mi bizonyítékok azt sugallják annak lehetőségét, hogy a miR-24, mint terápiás célpont a GC. További vizsgálatok szükségesek, hogy teljes mértékben megértsék a részletes mechanizmusát miR-24 GC karcinogenitási és potenciális terápiás megközelítés. Katalógusa módszerek
Etikai nyilatkozat katalógusa írásos beleegyező nyilatkozatot gyűjtöttünk minden résztvevő, és vizsgálati protokollt jóváhagyta az etikai bizottság a Ruijin Kórház, Shanghai Jiaotong Orvostudományi Egyetem. Minden egér kísérleteket jóvá Animal Care (engedélyÉ20810) és Felhasználási Bizottság és összhangban végzik a hivatalos ajánlások a Care and Use of Laboratory Animals Ruijin Kórház, Shanghai Jiaotong Orvostudományi Egyetem. Katalógusa sejtvonalak
Az emberi GC sejtvonalak SNU-1, SNU-16, NCI-N87, és KATO III szereztük American Type Culture Collection (ATCC). A sejtvonalak SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, és AGS vásároltunk a Shanghai Institutes for Biological Sciences, a Kínai Tudományos Akadémia. A halhatatlanná normál gyomor nyálkahártya epithelialis sejtvonal (GES-1) ajándéka volt Prof. Feng Bi (Huaxi Orvostudományi Egyetem, Chengdu, Szecsuán tartomány, Kína). Az embrionális vese sejtvonal 293 T megőrződött laboratóriumunkban és Dulbecco-féle módosított Eagle-féle tápközegben (DMEM), amely 10% magzati borjúszérumot (FBS), 37 ° C-on nedvesített atmoszférában, 5% CO 2. Minden GC sejteket tenyésztettünk RPMI 1640, kiegészítve 10% FBS-sel, párásított inkubátorban, 5% CO 2 37 ° C-on.
Szövetmintákat
elsődleges daganat szövetekből és párosítva szomszédos, nem-daganatos szövetek gyűjtöttünk betegekből származó GC gyökeresen gastrectomián a Sebészeti Osztály, Ruijin Kórház, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. A szomszédos normális szövetekben kapunk több mint 5 cm-re a primer rák. Szöveti mintákat azonnal lefagyasztottuk folyékony nitrogénben, és hűtőszekrényben tároljuk -80 ° C-on. A szöveteket immunhisztokémiai fixáltuk 4% paraformaldehid és paraffinba ágyaztuk. Klinikopatológiai adatokat megvizsgálták, és a TNM stádium besorolás kritériumok alapján American Joint Committee on Cancer (AJCC, 6. kiadás). Az összes mintát igazoltuk patológiai vizsgálatát.
RNS izolálás és QRT-PCR
Az összes RNS-t izoláltunk a szöveti minták és sejtvonalak Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Az expressziós szintek miRNS értékeltünk a hajtű itTM miRNS qPCR mennyiségi Kit (GenePharma, Shanghai, Kína), a gyártó utasításai szerint. Az U6 kis nukleáris RNS (RNU6B; GenePharma) használtunk normalizálás. A relatív expressziós aránya miR-24 minden összekapcsolt tumor és a nem tumoros szövetet kiszámítása a 2 -ΔΔCT módszerrel. A miR-24 expressziós szint definiáltuk upregulált, amikor a viszonylagos expressziós arány 1-nél nagyobb, és a meghatározás szerint downregulált, amikor a viszonylagos expressziós arány < 1. Minden szerző elolvasta és jóváhagyta a végleges kéziratot. Katalógusa

• Gyomor- versus utáni pylorus etetés: rendszeres felülvizsgálatát
• Utility Az intranazális ketamin és Midazolam elvégzésére gyomor Leszívott gyermekek: egy kettős-vak, placebo-kontrollált, randomizált vizsgálatot