Naviko slopintuvas Pasaulis-24 sulaiko skrandžio vėžio progresavimą downregulating RegIV

auglio slopinamojo Pasaulis-24 sulaiko skrandžio vėžio progresavimą downregulating RegIV
tezės
Background
mikro RNR yra maži nekoduojamame RNR kad moduliuoja mobiliųjų procesų įvairovę, reguliuojant keletą tikslai, kurie gali skatinti arba slopinti piktybinių elgesio vystymąsi. Daugėja įrodymų, rodo Pasaulis-24 vaidina svarbų vaidmenį žmogaus kancerogenezėje. Tačiau, jo tikslus biologinis vaidmuo išlieka labai silpnas. Šis tyrimas nagrinėjo PPN-24 skrandžio vėžiu (GC) vaidmenį.
Metodai
PPN-24 raišką GC audinių palyginti su suderintų ne navikų audiniuose ir GC ląstelių buvo aptikta atliekant KRL-PGR. Sintetiniai trumpi viengubi arba dvigubi RNR oligonukleotidai ir lentiviruso vektoriai buvo naudojamas reguliuoti Pasaulis-24 raišką GC ląstelių ištirti savo funkciją in vitro, parsisiųsti ir rezultatai
miR-24 in vivo
.
Buvo reikšmingai downregulated GC audinių palyginti su suderintų ne navikų audiniuose, ir buvo susijęs su naviko diferenciacijos. Negimdinis išraiška miR-24 SGC-7901 GC ląstelių slopino ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazija in vitro
taip pat tumorogeniškumo in vivo
stimuliuoja ląstelių ciklo suimti G0 /G1 fazės ir skatinti ląstelių apoptozę. Be to, mes nustatyti RegIV kaip miR-24 tikslą ir įrodė, kad Pasaulis-24 reguliuojamos RegIV išraišką per privalomas jos 3 'neverstą regioną.
Išvados
MIR-24 funkcijų kaip naują naviko slopintuvas GC ir kovos -oncogenic veikla gali apimti savo slopina tikslinio geno RegIV. Šie rezultatai rodo, kad Mir-24 galimybės kaip terapinio tikslo GC.
Raktiniai žodžiai
Pasaulis-24 RegIV Skrandžio vėžio išplitimas invazija metastazių Background
Skrandžio vėžys (GC) yra vienas iš labiausiai paplitusių žmogaus vėžio. Nors sergamumas ir mirtingumas yra visame pasaulyje sumažėjo per pastaruosius 20 metų, GC dar yra vertinama kaip ketvirtoji dažniausia ir antra labiausiai mirtina vėžio visame pasaulyje [1]. Nors tyrimai GC padarė didelę pažangą, molekulinius mechanizmus pagrindinės GC dar nebuvo visiškai aiški.
Mikro RNR (miRNAs) yra mažos nekoduojamame, dvigubai RNR molekulės, kurios gali moduliuoti tikslinių genų ekspresiją įtaką atraminis transkripcijos procesų reglamentuojantys genų ekspresiją. miRNAs pripažinti tikslines mRNR remiantis visą ar ne sekos papildomumo ir išvengti baltymų gamybą privalomas iki 3 "neišverstas regione (UTR), arba atviras skaitymo rėmelis (ORF) tikslinės mRNR [2, 3]. buvo įrodytas miRNAs veikti ląstelių proliferacija ir diferenciacijos procesams, įskaitant epitelio-mezenchiminių perėjimo [4] ir endodermal diferenciacijos žmogaus embrioninių kamieninių ląstelių [5]. Be bendrų korinio funkcijų Mirna, šios molekulės taip pat vaidina svarbų vaidmenį daugelyje žmogaus ligų įvairovė. Keli tyrimai parodė, kad miRNAs misregulation yra susijęs su vėžio [6, 7], kurioje jie veikia arba kaip onkogenų ar naviko slopintuvai. Buvo pranešta miRNAs dalyvauti ūmaus mieloleukemija, krūties vėžio, nesmulkialąstelinio plaučių vėžio, kepenų ląstelių karcinoma, storosios žarnos vėžio, GC ir kitų vėžio [8-13]. Padidėjusi ar downregulation iš miRNAs veda prie diversifikacijos baltymų raiškos, todėl prisideda prie Tumorigenesis keičiant ginklų platinimu strategiją, angiogenezę ir invazija. Mokslininkai nustatė, kad Mirna ekspresijos profilius galima naudoti klasifikuoti žmogaus vėžio, ir ši išvada buvo prieš RNR profilių panaudojimo prastai diferencijuotų navikų [14, 15] klasifikaciją.
Aberrant išraiška konkrečių miRNAs GC buvo anksčiau pranešė ir buvo susietas su progresavimo ir prognoze GC [16-18]. Mes anksčiau nustatė, kad Pasaulis-24, kuris gali tarnauti kaip naviko slopintuvas per tikslinę svetainę polimorfizmo [19], buvo žymiai downregulated Mirna GC ląstelių ir audinių, palyginti su ne navikų audiniuose. Šiame tyrime mes analizuojami Pasaulis-24 raiškos lygį GC audinių, palyginti su suderintų ne navikų audiniuose, ir įvertinti koreliacijas tarp Pasaulis-24 lygio ir clinicopathologic parametrus. Mes įvertino raiškos miR-24 įtaka augimui ir apoptozės SGC-7901 GC ląstelės in vitro ir in vivo

. Taip pat nustatėme, biologinį poveikį downregulation miR-24 raiškos GC ląstelių. Be to, mes nustatyti RegIV (Atstatantis salelių kilmės šeimos narys 4) kaip vieną iš tikslinių genų PPN-24. Mes iškėlė hipotezę, kad Pasaulis-24 gali reguliuoti invazija ir metastazes GC ląsteles tiesiogiai nukreipta į RegIV geną.
Rezultatai
Padidėjusi miR-24 slopina GC ląstelių proliferaciją
Tirti PPN-24 raišką GC, buvo atliktas kiekybinis realaus laiko PGR (KRL-PGR). Išraiška miR-24 buvo visuotinai downregulated devyniose GC ląstelių linijų, palyginti su imortalizuotų normaliomis skrandžio gleivinės epitelio ląstelių GES-1 (1a pav.) Išraiška miR-24 buvo toliau nagrinėjamas KRL-PGR naviko audiniuose ir atitiko ne navikų audiniuose iš 63 GC pacientų (1b pav.) Vidutinis išraiška lygis miR-24 buvo žymiai downregulated naviko audiniuose, palyginti su suderintų ne navikų audiniuose (1c pav.) Kartu šie rezultatai pateikti svarūs įrodymai, kad Pasaulis-24 buvo žymiai downregulated GC. 1 pav Pasaulis-24 yra žymiai downregulated GC ir slopinamas SGC-7901 ląstelių augimą. (A) Santykinis išraiška, miR-24 devynis GC ląstelių linijų, palyginti su GES-1 nustatomi pagal KRL-PGR trijų nepriklausomų eksperimentų (** p < 0,01, *** P < 0,001). (B), santykinė išraiška miR-24 chirurginių egzempliorių 63 GC nustatyta KRL-PGR. Visi eksperimentai buvo pakartotas tris kartus. Duomenys rodomi kaip -ΔΔCT vertybių, Š.D. nerodomas. (C) vidurkis ir standartinis nuokrypis Pasaulis-24 raiškos lygių chirurginių egzempliorių 63 GC audinių ir suderintų ne navikų audiniuose yra parodyta. Duomenys pateikiami kaip 2-ΔCT vertybių (** p < 0,05). U6 snRNA buvo naudojamas normalizuoti. (D) ir miR-24 slopino SGC-7901 ląstelių augimą, kaip aptikti WST, o anti-miR-24 padidėjo ląstelių augimą (* p < 0,05). Duomenys rodomi kaip vidurkis ± Š.D. iš trijų nepriklausomų eksperimentų.
Mes šalia išnagrinėjo tarp ekspresijos lygį miR-24 ir clinicopathologic veiksnių žmogaus GC koreliacijas. Klinikiniai ir patologiniai bruožai 63 GC pacientams yra teikiamos 1 lentelėje Remiantis santykinio raiškos santykis PPN-24 /U6 = 1, atvejai buvo suskirstyti į dvi grupes: Mir-24 aukšto išraiška grupė (n = 29) ir miR-24 mažai išraiška grupė (n = 34). Mir-24 mažai išraiška grupė eksponuojami žymiai mažesnę naviko diferenciacija (p = 0,021). Tačiau Mir-24 išraiška lygis neparodė jokio ryšio su amžiumi, lytimi, auglio vietą, vietos invazijos gylis, limfmazgių metastazių arba TNM stage.Table 1 Sąryšis tarp Pasaulis-24 raiškos lygį ir clinicopathologic kintamųjų 63 GC pacientai
Clinicopathologic parametrai
Pasaulis-24 raišką
p reikšmė
didelis (n = 29)
Žemas (n = 34)

Lyčių

Male
17
21
0,799
Moteris
12
13
Amžius (metai)
< 60
15
18
0,923 ≥60
14
16
naviko vietą
Distalinė trečioji
8
8
0.310 Proksimalinės trečioji
15
13
viduriniame trečdalyje
6
13
PSO klasifikacija
adenokarcinoma
25
28
0,155
Signet žiedas ląstelių karcinoma
1
5
mucinous adenokarcinoma
3
1
diferencijavimas
Na, vidutiniškai
15
8
0,021
Prastai
14
26
BORRMANN klasifikacija
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
Vietinis invazija
T1 /T2
1
7
0,098
T3 /T4
28
27
Limfmazgių metastazės

Nėra
6
4
0,535
Taip
23
30
Nutolusio metastazių
Nėra
28
31
0,724
Taip
1 3
TNM etapo
I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
ištirti biologinę funkciją miR-24 iN vystymosi ir progresavimo GC, mes perkeltų SGC-7901 ląsteles Pasaulis-24 imituoja (SGC-7901 /Pasaulis-24) arba Pasaulis-24 inhibitorius (SGC-7901 /anti-Pasaulis-24). Kaip parodyta Papildoma failą 1: S1A ir S1B pav, mes išrinkome 100 nm kaip tinkamos koncentracijos vėlesniais eksperimentais. Negimdinis išraiška miR-24 SGC-7901 ląstelių buvo patvirtinta KRL-PGR. Be to, mes išnagrinėjo ląstelių proliferaciją iki WST tyrimu. Padidėjusi miR-24 slopina augimo tempą SGC-7901 ląstelių, lyginant su miR kontrolės perkeltų ląstelių (p < 0,05), o anti-Pasaulis-24 padidėjo ląstelių augimą veiklą (P < 0,05, 1D pav.)
Padidėjusi miR-24 slopina migracija ir invazija GC ląstelių
Kitas mes įvertino miR-24 poveikį ląstelių migracijos ir invazijos GC. Mobilusis migracija ir invazija tyrimai parodė, kad padidėjusi miR-24 slopino ląstelių migracija (SGC-7901 /Mir-24 grupę, 63,0 ± 3,6 ląstelių viename srityje; kontrolinė grupė, 126.3 ± 7,0 ląstelių viename srityje; P < 0,05) ir invazija ( SGC-7901 /Pasaulis-24 grupė, 34,7 ± 2,1 ląstelės per srityje; kontrolinė grupė, 63,7 ± 3,5 ląstelių viename srityje; p < 0,05) (2a pav B). Priešingai, nokdaunas miR-24 žymiai padidėjo ląstelių migraciją (SGC-7901 /Anti-Pasaulis-24 grupė, 182.3 ± 5,0 ląstelės per srityje; kontrolinė grupė, 105.3 ± 3,8 ląstelių viename srityje; P < 0,01) ir invazija (SGC -7901 /anti-miR-24 grupė, 124.3 ± 3,8 ląstelių skaičius viename lauke; kontrolinė grupė, 62,7 ± 2,5 viename lauke; P < 0,01) (pav 2A, C). 2 pav Pasaulis-24 slopinamas migracija ir invazija SGC-7901 ląstelių. (A), atstovas sritys SGC-7901 ląstelių į transwell tyrimus. (B, C) atstovas sritys SGC-7901 ląstelių migracijos ir invazija tyrimus, atitinkamai. Vidutinis migracijos ir invazija ląstelių viename lauke iš trijų nepriklausomų eksperimentų (* p < 0,05, ** p < 0,01).
Raiška miR-24 skatina GC ląstelių apoptozę ir skatina ląstelių ciklo suimti G0 /G1 fazės
Kadangi pastebėta ląstelių augimą gali paveikti apoptozės ir ląstelės ciklo progresavimo normos, mes išnagrinėjome PPN-24 poveikį apoptozė ir ląstelės ciklo in vivo
tėkmės citometrijos. Mes nustatėme, kad maždaug 12-15% iš SGC-7901 /Pasaulis-24 ląstelių eksponuojami morfologines savybes būdingas apoptozės, įskaitant kondensuota chromatino ir branduolinės fragmentacijos pagal Hoechst33342 dažymo DNR kiekis. Priešingai, po apskaitos retas spontaniškos apoptozę SGC-7901 ląstelių, Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 /Anti-Pasaulis-24 grupė neparodė jokių reikšmingų pokyčių pagal Hoechst33342 dažymo (3a pav.) Tėkmės citometrijos parodė, kad apoptozės lygis buvo gerokai padidėjo SGC-7901 /Pasaulis-24 ląstelių, lyginant su kontrolinės ląstelių (13.62% ± 1,25% vs 6.15% ± 0,95%, atitinkamai; P < 0,01), ir žymiai sumažėjo SGC -7901 /anti-Pasaulis-24, palyginti su kontroline grupe (3.92% ± 0.52% vs 6.35% ± 0,83%, atitinkamai; p < 0,05). (pav 3B, D),
toliau nušviesti miR- mechanizmą 24-tarpininkaujant augimo slopinimas iš GC ląstelių, ląstelės ciklo analizė buvo atlikta (pav 3C, E). Po ląstelę miR-24, iš ląstelių G0 /G1 fazės procentinė dalis padidėjo nuo 40.51% ± 3,15% kontrolinės grupės į 72.24% ± 3,65% (p < 0,01), o nokdaunas Pasaulis-24 sumažėjo ląstelių G0 procentą /G1 fazės iš 42.35% ± 2,78% kontrolinės grupės į 30.25% ± 1,25% (P < 0,05). 3 pav Pasaulis-24 sukeltos ląstelių apoptozę ir G0 /G1 ląstelės ciklo sustojimas. (A), atstovas histogramos vaizduojančios branduolinę morfologiją SGC-7901 ląstelių laikinai transfekuota 100 Nm Pasaulis-24 imituoja arba inhibitorius bei jų kontrolė (Hoechst33342 dažymo, originalus didinimas 400 x). (B), atstovas histogramos vaizduojančios apoptozę SGC-7901 ląstelių laikinai perkeltų su 100 Nm Pasaulis-24 imituoja arba inhibitorių ir jų atitinkamų kontrolės. (C) atstovas histogramos vaizdavo savo atitinkamas kontrolės ląstelių ciklą SGC-7901 ląstelių laikinai transfekuota 100 Nm Pasaulis-24 imituoja arba inhibitorius. (D e) apoptozinių ir G0 /G1 fazės ląstelių trijų nepriklausomų eksperimentų procentais, vidurkis ± Š.D. (* P < 0,05, ** p < 0,01).
RegIV yra tikslinio geno miR-24
plačiau ištirti miR-24 mechanizmus GC, mes ieškoma kandidatas tikslinių genų pagal bioinformatika. TargetScan, miRBase Tatget ir Starbase buvo taikomi ieškoti potencialių taikinių miR-24 d. Tarp numatomų tikslų, RegIV buvo įvardyta kaip vienas iš tikslinių genų PPN-24, ir mes nustatė vieną galimą Pasaulis-24 prijungimo vietą jos 3'UTR srities (4a paveikslas). Be to, mes išnagrinėjo RegIV išraišką devyniose GC ląstelių ir GES-1. Mes nustatėme, kad RegIV buvo ekspresija devyniose GC ląstelių, lyginant su GES-1 ir eksponuojami atvirkštinis išraiška modelį palyginti su miR-24 (papildomas failą 2: S2A ir S2B pav). Ištirti, ar RegIV mRNR 3'UTR buvo funkcinis tikslas miR-24, buvo atlikta liuciferazės reporteris genų tyrimai. Mes pirmą kartą įvertino PPN-24 (arba Pasaulis-kontrolė) bendrai perkeltų į SGC-7901 ląstelių su Luc RegIV plazmidžių arba Luc RegIV-Mut plazmidžių veiklą (kurio spėjamas Pasaulis-24 jungimosi vietos buvo mutavo) kartu su PRL-TK turinti plazmidė Renilla liuciferazės geną kaip vidaus kontrolės (4b paveikslas). Ląstelės bendrai transfektuotose miR-24 parodė reikšmingą sumažėjimą liuciferazės veiklos, palyginti su Mir-kontrolinės grupės (p < 0,05). Tačiau, PPN-24 bendro perkeltų su Luc RegIV-Mut plazmidžių parodė reikšmingai nesiskyrė reporteris veiklos, palyginti su ląstelės bendrai perkeltų su miR-kontrolė. Be to, prieš Pasaulis-24 padidino liuciferazės aktyvumą laukinio tipo Luc-RegIV, bet neturėjo Luc RegIV-Mut plazmidžių poveikį (4c pav; P <0,05). Mes taip pat atliekamas liuciferazės reporteris genų tyrimai su SNU-16, siekiant sumažinti endogeninio miR-24 įtaka. Pradžioje negimdinis išraiška miR-24 į SNU-16 ląstelių buvo patvirtinta KRL-PGR. Išraiška miR-24 transfekuota su miR-24 imituoja iš buvo apie 50 kartų didesnis nei, kad miR-kontrolinės grupės SNU-16 (P < 0,01), o ne statistinio skirtumo su anti-miR-24 (papildomas failo transfekciją 3: S3A pav.) Ląstelės bendrai transfektuotose miR-24 parodė reikšmingą sumažėjimą liuciferazės veiklos, palyginti su Mir-kontrolinės grupės (p < 0,001), o ne statistinis skirtumas su anti-miR-24 transfekciją (Papildoma failą 3: S3B ir S3C paveikslas) , Šie rezultatai tvirtai nurodė, kad RegIV 3'UTR yra tiesiogiai privalomi svetainių Mir-24. 4 pav Pasaulis-24 skirta į 3'UTR iš RegIV geną ir imunodažymu iš RegIV skrandžio audinius. (A), schema grafikas tariamų privalomus svetainių PPN-24 RegIV 3'UTR srities. RegIV-Mut rodo RegIV-3'UTR su mutacijos MIR-24 surišančio svetainėse. (B) ir miR-24 imituoja downregulated aktyvumą liuciferazės reporteris, kurių sudėtyje yra laukinio tipo RegIV 3'UTR (* p < 0,05), bet ne reporteris su mutantas RegIV 3'UTR srities. (C) anti-miR-24 padidėjo liuciferazės aktyvumą laukinio tipo Luc-RegIV (* P < 0,05), tačiau tai neturi įtakos mutanto poveikį. (D) Keturiasdešimt aštuonias valandas po to, kai miR-24 mimika ir kontrolės transfekciją SGC-7901 ląstelių, baltymų lygis RegIV buvo žymiai sumažėjo, palyginti su miR-kontrolės, kaip nustatyta pagal ELISA. Anti-miR-24 padidėjo RegIV išraiška, palyginti su anti-miR-kontrolės (* P < 0.05, ** p < 0,01). (E), dvidešimt keturias valandas po Pasaulis-24 imituoti arba inhibitorių ir atitinkamam kontroliniam transfekciją į SGC-7901 ląstelių, nebuvo skirtumo iRNR lygio RegIV palyginti su Mir-kontrolės, kaip nustatyta KRL-PCR (P > 0,05). Duomenys rodomi kaip vidurkis ± Š.D. iš trijų nepriklausomų eksperimentų. (F), Nr RegIV išraiška buvo aptiktas normalus skrandžio gleivinę. (G) RegIV buvo išreikšta žarnyno metaplazijos skrandžio. (H) Stiprus išraiška RegIV buvo pastebėtas skrandžio antspaudo žiedas ląstelių karcinoma.
Toliau mes išnagrinėjo Pasaulis-24 reguliavimą RegIV mRNR ir baltymų kiekiai perkeltų SGC-7901 ląstelių. IFA analizė parodė, kad RegIV baltymų kiekis buvo labai nuslopintas SGC-7901 /Mir-24 ląstelių, o RegIV baltymų kiekis buvo aktyvinama į SGC-7901 /Apsaugos nuo MIR-24 ląstelių (4d pav; * P <0,05, ** p < 0,01). KRL-PGR analizė parodė, jokio skirtumo į RegIV mRNR lygį visose perkeltų ląstelių grupių (4E, skaičių; p > 0,05). Tuo tarpu, mes nustatėme, C-MYC išraišką GC ląstelių kaip teigiamos kontrolės transfekuota Pasaulis-24 [20]. Mes nustatėme, kad Pasaulis-24 downregulated RegIV ir C-Myc (papildomas failą 4: S4A ir S4b paveikslas).
Ankstesni tyrimai parodė, kad RegIV buvo susijęs su platinimo ir metastazių GC. Mes šalia naudojamas imunohistocheminės analizę, siekiant įvertinti RegIV išraišką GC. Mūsų išvados patvirtino Padidėjusi RegIV GC. Baltymų lygis RegIV normaliai skrandžio gleivinės buvo mažesnis nei žarnyno metaplazijos skrandžio ir skrandžio antspaudo žiedas ląstelių karcinoma (pav 4F-H). Siekiant įvertinti klinikinę svarbą šiomis išvadomis, mes išnagrinėjo tarp RegIV ir miR-24 raiškos GC audinių koreliaciją. Mes nustatėme, kad RegIV ir Pasaulis-24 eksponuojami atvirkštinis išraiška modelis GC audinių (2 lentelė). Šie rezultatai patvirtina mintį, kad downregulation miR-24 dėl kurių išaugo baltymų lygius RegIV į GC.Table 2 RegIV ir Pasaulis-24 eksponatas atvirkščiai raiškos modelis GC
Pasaulis-24 raišką
p-vertė
Žemas
Viesbutis High
taisyklė IV (IHC)
Neigiama
9
16
0,038 *
teigiamą
25
13
* p
< 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas
Padidėjusi miR-24 slopina tumorogeniš- in vivo
Kadangi Pasaulis-24 patobulintas. platinimo GC ląstelių in vitro
, mes nagrinėjo, ar Pasaulis-24 gali turėti įtakos tumorogeniš- in vivo
. Retrovirusų tarpininkaujant SGC-7901 /Mir-24 ir buvo gauti SGC-7901 /Pasaulis-kontrolės stabilios ląstelių linijas, kaip aprašyta Metodikos skyriuje. SGC-7901 /RV-Pasaulis-24 ir Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 /RV-Pasaulis-kontrolės ląstelės buvo švirkščiamas į poodį į keturių savaičių amžiaus vyrų nuogas pelėmis ir auglių formavimasis buvo stebimi. Navikai augo lėčiau SGC-7901 /RV-Pasaulis-24 grupės, nei į SGC-7901 /RV-Pasaulis-kontrolinės grupės (5A pav.) Vidutinis naviko tūris pelėms užkrėstų SGC-7901 /RV-Pasaulis-24 ląstelių, iki 28 dienos buvo gerokai mažesnis lyginant su pelėmis užkrėstų SGC-7901 /RV-Pasaulis-kontrolinių ląstelių (397.45 ± 93,07 mm 3 vs 1083.56 ± 101,56 mm 3, atitinkamai) (5B ir C pav; P < 0,05). 5 paveikslas Pasaulis-24 slopina tumorogeniš- ir proliferaciją in vivo. (A), fotografija navikų, gautų iš RV-miR-24 arba RV-miR-kontrolinių ląstelių nuogas pelių. (B) augimo kinetika navikų nuogas pelėmis. Naviko skersmuo buvo matuojamas kas 7 dienas. Iš nuogas pelių tūris barų, Š.D. nurodyta (* P < 0,05). (C) vidutinis svoris navikų nuogas pelių. Duomenys rodomi kaip reiškia ± Š.D. (* P < 0,05). (D) atitinka nuotraukos imunohistocheminio analizės Ki-67 antigeno navikų nuogas pelėmis (originalas priartinimas, 200 ×). (R) atstovas proliferacijos indeksas navikų RV-Pasaulis-24 ir RV-Pasaulis-kontrolės nuogas pelių. Duomenys rodomi kaip reiškia ± Š.D. (** P < 0,05). (F) raiškos lygiai RegIV vėžinių audinių nuogas pelėmis. Duomenys rodomi kaip reiškia ± Š.D. (* P < 0,05). (G) raiškos lygiai RegIV mRNR vėžinių audinių nuogas pelėmis (p > 0,05). Duomenys rodomi kaip vidurkis ± Š.D. iš trijų nepriklausomų eksperimentų.
Siekiant įvertinti, ar navikas augimo slopinimas SGC-7901 /RV-Pasaulis-24 ląstelių buvo iš dalies dėl to, platinimu slopinimo, imunohistocheminis analizė navikų audiniuose buvo atlikta. Kaip parodyta Ki-67 antigeno dažymo, sumažėjęs naviko augimo pelėms įšvirkščiama SGC-7901 /RV-miR-24 ląstelių gali būti iš dalies dėl mažesnio proliferacijos, kurį sukelia miR-24 raiškos. Iš Ki-67-antigeno-teigiamų ląstelių procentas buvo mažesnis naviko, gautų iš SGC-7901 /RV-mir-24 ląstelių nei naviko, gautų iš SGC-7901 /RV-Pasaulis-kontrolinių ląstelių (37,1% ± 3,6%, palyginti su . 79,5% ± 5,2%, atitinkamai) (5d paveiksle ir ilgumos; P < 0,01). Sąvoka lygis RegIV, kaip nustatyta pagal ELISA buvo mažesnis naviko, gautų iš ląstelių padidėjusia miR-24 nei naviko, gautais iš kontrolinių ląstelių (1,77 ± 0,15 ng /ml, SGC-7901 /RV-miR-24 vs 3,13 ± 0,25 ng /ml SGC-7901 /RV-miR-kontrolės) (5F pav; P < 0,05). Tačiau, ten nėra statistinio skirtumo santykinio išraiška RegIV mRNR (5G pav). Todėl SGC-7901 /RV-Pasaulis-24 ląstelių tumorogeniškumo buvo gerokai sumažintas in vivo
.
Diskusijos
Daugėja įrodymų, rėmė svarbias vaidmenis miRNAs, kurios veikia arba kaip naviko slopintuvai ar onkogenų, į GC [21-23]. Be to, buvo įrodyta daug miRNAs eksponuoti gydomąjį potencialą. Dėl savo funkcijos, kaip meistras Reguliavimo genomo ir naujų veikimo mechanizmo miRNAs laikomi perspektyvi technologija terapinio plėtros [24]. Pasaulis-26a turi antitumorigenic savybes ir galimą terapinį naudingumą kepenų vėžio in vitro parsisiųsti ir in vivo
, ir buvo susijęs su sparčiai ir tvariai slopinamas vėžinių ląstelių proliferaciją ir labai konkrečią indukcijos naviko ląstelių mirtis [25]. Konkretus mechanizmas iš dysregulated miRNAs skrandžio kancerogenezėje vaidmenų išlieka silpnas.
Šiame tyrime mes parodė slopinamąjį poveikį PPN-24 naviko metastazių į klinikinę, ląstelių ir molekulių lygiu ir eksperimentinio gyvūnų modelį. Mes pateikė išsamią mechaniškai eksperimentinę įrodymų Mir-24 vaidmenį GC ir slopina RegIV išraiška. Tyrimai parodė, kad miR-24 gali veikti kaip onkogeno piktybinėse ertmėse, [26], geriamojo preparato karcinoma [27, 28], prostatos vėžio [3] ir plaučių vėžio [29, 30], bet gali veikti kaip auglio slopinamojo gaubtinės žarnos vėžiui gydyti [ ,,,0],19] ir Retinoblastoma navikai [31]. Lal ir kt. nustatė, kad Pasaulis-24 slopino ląstelių proliferacija ir ląstelės ciklo progresavimo ir slopina E2F2 Myc ir kitų ląstelės ciklą reguliuojančių genų ekspresiją, prisijungdamas prie "be sėklų" 3'UTR Mirna pripažinimo elementai [20]. Wu J ir kt., Pranešama, kad transfekcija miR-24 į GC ląstelių sumažino AE1 baltymo ekspresiją, kuri lėmė slopina ląstelių proliferaciją [32]. Tačiau visiškai pagrindinės mechanizmai Mir-24 GC vis dar nėra aišku.
Mūsų ataskaita nustatė Pasaulis-24 kaip kandidatas naviko slopintuvas GC. Mes nustatėme, downregulation miR-24 išraiška tiek GC audinių ir ląstelių linijų. Padidėjusi miR-24 SGC-7901 GC ląstelių žymiai sumažino neplatinimo ir invazija ir in vitro, parsisiųsti ir in vivo,
, atskleisti galimą terapinį poveikį PPN-24 GC. Priešinga rezultatas buvo gautas, kai Mir-24 išraiška buvo slopinamas anti-miR-24. Kartu šie rezultatai rodo, kad Pasaulis-24 gali funkcionuoti kaip naviko slopintuvas žmonijos GC.
MiRNAs įpareigoti tobulinti ar netobulas papildomi "sėklų" sekos tikslinių mRNR, todėl skilimo tikslinių iRNR ar slopinamas jų vertimu [33] , Šiame tyrime, mes identifikuojamos RegIV kaip taikinio geno miR-24 d. Pasaulis-24 jungiasi su nepilno papildytų RegIV iRNR, kuri tiesiogiai pritaikymo slopinimu RegIV mRNR, bet be bendram iRNR stabilumo poveikį. Kaip skirtingų veiksmų rūšių Mirna, PPN-24 neturėjo įtakos iRNR lygį RegIV bet transliacijos slopinimą. RegIV yra žmogaus Reg genų šeimos, kuri dalinasi sekos panašumo su angliavandenių-rišantis domenas, C-tipo lectins narys, ir pirmą kartą buvo išskirtas ir besiskiriantis tuo, žmogaus uždegiminės žarnų ligos [34]. RegIV yra vieno tipo išskiriami baltymų, ir vaidina biologinį vaidmenį, priklausomai nuo ekstraląstelinio išskiriami baltymų, taip, kad mes pradėjo ELISA kaip pageidaujamą aptikimo metodą. Vakarų dėmė taip pat buvo atliekami siekiant patvirtinti baltymų lygį RegIV ir gavome panašius rezultatus. Ankstesni tyrimai, pranešė, kad RegIV genas buvo dažnai ekspresija GC ir potencialiai dalyvauja invazija, metastazių ir kancerogeninio poveikio GC. RegIV išraiška buvo siaurai apribotas noncancerous audiniuose [35, 36]. RegIV išraiška buvo žymiai didesnis pacientams, sergantiems peritoninės metastazių, palyginti su be pilvaplėvės metastazių. RegIV gali paspartinti peritoninė metastazių GC ir lygių lavažo skysčiuose gali pasitarnauti kaip geras markeris peritoninės metastazių [37-39]. RegIV gali veikti kaip biologinis žymuo GC pacientų serume ir slopina 5-FU sukeltas apoptozę indukcija BCL-2 ir dihidropirimidindehidrogenazei [40].
Dabartiniame tyrime mes identifikuoti MIR-24 kaip galimą tiekėjų reguliatorius RegIV. Pirma, raiška miR-24 sumažino liuciferazės reporteris genų, kurių sudėtyje yra iš RegIV 3'UTR veiklą, o mutacija iš "sėkla regione" svetainių nuo RegIV 3'UTR srities panaikino reguliavimo poveikį PPN-24. Priešinga rezultatas buvo gautas, kai mes naudojamas anti-Pasaulis-24. Antra, žmogaus GC audiniai išreiškė žymiai mažesnes PPN-24, nei ne navikų audiniuose, o GC audiniai yra žymiai didesnis iš RegIV baltymų lygį nei ne navikų audiniuose. Trečia, raiška miR-24 downregulated RegIV tuo baltymų lygį, o downregulation miR-24 padidėjo RegIV baltymų lygį. Ketvirta, raiška miR-24 buvo reikšmingai susiję su platinimu ir metastazių, nurodant funkcinį sutampa su RegIV. Visi šie rezultatai rodo, kad RegIV gali būti tiesioginis taikinys genas miR-24 GC.
Kancerogeninis yra nuosekliųjų įvykius, įskaitant būrys, migracijos, vietos invazijos, angiogenezę, intravasation, išlikimo kraujotakos sistemos, ekstravazacija serija atauga įvairių organų [41, 42]. Čia mes parodė, kad Pasaulis-24 gali reguliuoti GC kancerogenezės per moduliacinės dauginimosi, migracijos ir vietos invazijos. Be to, mūsų duomenys rodo, kad Mir-24 galimybės kaip terapinio tikslo GC. Tolesni tyrimai turi visiškai suprasti išsamias mechanizmus PPN-24 GC kancerogenezėje ir kaip galimą terapinį metodą.
Metodai
etikos pareiškimą
Parašė informuotas sutikimas buvo surinkta iš visų dalyvių, o Tyrimo protokolas buvo patvirtintas pagal etikos komiteto Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiaotong universiteto medicinos mokyklos. Visi pelės eksperimentai patvirtino Gyvūnų priežiūra (Leidimas.120.810) ir naudojimo komitetas ir kuri yra vykdoma vadovaujantis oficialiomis rekomendacijomis priežiūrai ir naudojimui laboratorinių gyvūnų iš Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiaotong universiteto medicinos mokyklos.
Ląstelių linijas
žmogiškųjų GC ląstelių linijos SNU-1, SNU-16, NVI-N87 ir KATO III buvo perkami iš Amerikos tipas kultūros kolekcija (ATCC). Ląstelių linijų SGC-7901, MKN-28, bgc-823, MKN-45, o AGS buvo įsigytas iš Shanghai institutai biologijos mokslų, Kinijos mokslų akademijos. Imortalizuotų normalus skrandžio gleivinės epitelio ląstelių linija (GES-1) buvo dovana prof Feng Bi (Huaxi medicinos universitetas, Chengdu, Sichuan provincija, Kinija). Embrioninė inkstų ląstelių linija 293, T buvo išsaugota mūsų laboratorijoje ir išlaikyta Dulbecco modifikuota Eagle terpėje (DMEM) su 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje su 5% CO 2. Visi GC ląstelės buvo auginamos RPMI 1640, papildytoje 10% FBS drėgmėje, inkubatoriuje su 5% CO 2 esant 37 ° C temperatūroje.
Audinių mėginiai
Pirminės vėžio audiniai ir suporuotas gretimų ne-navikų audiniuose, buvo surinkti pacientų, sergančių GC buvo iš esmės pašalintas skrandis tuo chirurgijos departamento Ruijin ligoninė, Šanchajaus Jiao Tong universiteto medicinos mokyklos. Gretimi normaliuose audiniuose buvo gauti per 5 cm atstumu nuo pirminės vėžio. Audinio mėginiai buvo nedelsiant prisegami užšaldomos skystame azoto ir laikyti šaldytuve iki -80 ° C. Audinių imunohistocheminiu buvo nustatytas 4% paraformaldehido ir parafiną įdėta. Klinikos duomenys buvo peržiūrėti ir TNM sustojimo klasifikacija buvo grindžiama kriterijais Amerikos jungtiniame komitete dėl vėžio (AJCC, 6-asis leidimas). Visi mėginiai buvo patikrinti patologinį tyrimą.
RNR išskyrimas ir KRL-PCR
viso RNR buvo išskirta iš audinių pavyzdžius ir ląstelių linijų, naudojančių Trizol reagentą (Invitrogen, Karlovi Varai, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Sąvoka lygiai miRNAs buvo įvertintas naudojant segtukas-itTM miRNAs qPCR kiekybinio rinkinį (GenePharma, Šanchajus, Kinija) pagal gamintojo protokolą. U6 mažas branduolinis RNR (RNU6B; GenePharma) buvo naudojamas normalizuoti. Santykinis išraiška santykis miR-24 kiekvieno prijungto naviko ir ne naviko audinyje buvo apskaičiuojamas naudojant 2 -ΔΔCT metodą. Mir-24 raiškos lygis buvo apibrėžtas kaip aktyvinama, kai santykinė išraiška santykis buvo > 1, ir apibrėžiamas kaip downregulated, kai santykinė išraiška santykis buvo < 1. iš trijų nepriklausomų eksperimentų. Visi autoriai skaityti ir patvirtino galutinį rankraštį.

• Skrandžio prieš po prievarčio pašarams: sisteminė apžvalga
• Naudingumas nosį Ketaminas vartojant midazolamo atlikti skrandžio aspiratai vaikams: dvigubo aklo, placebu kontroliuojamų, randomizuotų studijų