Tumor suppressor miR-24 weerhoudt maagkanker progressie door neerwaarts reguleren RegIV

tumor suppressor miR-24 weerhoudt maagkanker progressie door neerwaarts reguleren RegIV
Abstracte achtergrond
microRNAs zijn klein, niet-coderende RNA's die een verscheidenheid van cellulaire processen te moduleren door het reguleren van multiple doelen, te bevorderen of remmen de ontwikkeling van kwaadaardige gedrag. Accumuleren bewijs suggereert miR-24 speelt een belangrijke rol in de menselijke carcinogenese. Echter, de precieze biologische rol blijft grotendeels ongrijpbaar. Deze studie onderzocht de rol van miR-24 bij maagkanker (GC).
Methods Ondernemingen De expressie van miR-24 in GC weefsels vergeleken met matchende niet-tumorweefsels en GC cellen werd gedetecteerd met qRT-PCR. Synthetische korte enkel- of dubbelstrengs RNA oligonucleotiden en lentivirale vectoren werden gebruikt voor miR-24 expression in GC cellen zijn functie in vitro en in vivo

.
Resultaten
miR-24 was significant downregulated in GC weefsels vergeleken met matchende niet-tumorweefsels en is geassocieerd met tumordifferentiatie. Ectopische expressie van miR-24 in SGC-7901 GC cellen onderdrukt celproliferatie, migratie en invasie in vitro
evenals tumorvorming in vivo
door het induceren celcyclus arrestatie in G0 /G1-fase en het bevorderen van cel apoptose. Verder hebben we geïdentificeerd RegIV als een doelwit van miR-24 en toonden aan dat miR-24 gereguleerd RegIV expressie via binding haar 3 'onvertaalde regio.
Conclusies
miR-24 functioneert als een nieuwe tumor suppressor in GC en de anti -oncogenic activiteit kan de remming van het doelwitgen RegIV betrekken. Deze bevindingen suggereren dat de mogelijkheid van miR-24 als een therapeutisch doel in GC.
Trefwoorden
miR-24 RegIV Maagkanker Proliferatie Invasion metastase Achtergrond
Maagkanker (GC) is één van de meest voorkomende menselijke kankers. Hoewel de incidentie en sterfte over de hele wereld in de afgelopen 20 jaar zijn gedaald, GC behoort nog steeds als de vierde meest voorkomende en de tweede meest dodelijke kanker wereldwijd [1]. Hoewel het onderzoek in GC grote vooruitgang heeft geboekt, de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan GC nog niet volledig opgehelderd.
MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine niet-coderende, dubbelstrengs RNA-moleculen die de expressie van target genen kunnen moduleren door beïnvloeding van het post- transcriptionele processen reguleren van genexpressie. miRNAs herkennen doelwit mRNA van volledige of onvolledige sequentie complementariteit en om de productie van eiwit door binding aan het ongetranslateerde gebied 3 '(UTR) of het open leesraam (ORF) van het doel-mRNA [2, 3]. miRNAs zijn aangetoond te functioneren in cellulaire proliferatie en differentiatie processen, waaronder de epitheliale-mesenchymale overgang [4] en endodermale differentiatie van humane embryonale stamcellen [5]. Naast algemene cellulaire functies van miRNA deze moleculen spelen ook een belangrijke rol in diverse humane ziekten. Meerdere studies hebben aangetoond dat de misregulation van miRNAs houdt verband met kanker [6, 7], waarin ze functioneren als ofwel oncogenen of tumor suppressors. miRNAs gerapporteerd betrokken te zijn bij acute myeloïde leukemie, borstkanker, niet-kleincellig longcarcinoom, hepatocellulair carcinoom, colonkanker, GC en andere kankers [8-13]. Overexpressie of neerwaartse regulatie van miRNAs leidt tot diversificatie van de eiwitexpressie, dus bij te dragen aan het ontstaan ​​van tumoren door het moduleren van de proliferatie, angiogenese en invasie. De onderzoekers vonden dat miRNA expressieprofielen kunnen worden toegepast om menselijke kankers te classificeren en deze bevinding was vóór het gebruik van messenger RNA profielen voor classificatie van slecht gedifferentieerde tumoren [14, 15].
Afwijkende expressie van specifieke miRNAs in GC is eerder gerapporteerd en is gecorreleerd met de voortgang en prognose van GC [16-18]. We hebben eerder gevonden dat miR-24, die een tumor suppressor kan dienen via een doelwitplaats polymorfisme [19], werd een significant neerwaarts gereguleerd miRNA in GC cellen en weefsels in vergelijking met niet-tumorweefsels. In deze studie analyseerden we miR-24 expressieniveaus in GC weefsels vergeleken met matchende niet-tumorweefsels, en beoordeeld correlaties tussen miR-24 niveau clinicopathologic parameters. Wij evalueerden de invloed van overexpressie van miR-24 op de groei en apoptose van SGC-7901 GC cellen zowel in vitro als in vivo

. Ook bepaalden de biologisch effect van neerregulatie van miR-24 expressie van GC-cellen. Bovendien identificeerden we RegIV (regenereren eilandjes afgeleide familie, lid 4) als één van de doelwitgenen van miR-24. Onze hypothese is dat miR-24 van de invasie en uitzaaiing van GC cellen door rechtstreeks te richten op de RegIV gen kan reguleren.
Resultaten
overexpressie van miR-24 remt proliferatie GC cel Belgique Om de expressie van miR-24 verkennen in GC kwantitatieve real-time RT-PCR (qRT-PCR) werd uitgevoerd. Expressie van miR-24 werd algemeen downgereguleerd in negen GC cellijnen opzichte van normale geïmmortaliseerde maagslijmvlies epitheelcel GES-1 (Figuur 1A). Expressie van miR-24 werd onderzocht met qRT-PCR in tumorweefsels en voldoen niet-tumorweefsels van GC 63 patiënten (Figuur 1B). De gemiddelde expressie van miR-24 was significant neerwaarts gereguleerd in tumorweefsels vergeleken met geëvenaard non-tumor weefsel (figuur 1C). Samen vormen deze resultaten levert sterke aanwijzingen dat miR-24 was significant downregulated in GC. Figuur 1 miR-24 is aanzienlijk neerwaarts gereguleerd in GC en remde SGC-7901 celgroei. (A) Relatieve expressie van miR-24 in negen GC cellijnen tegenover GES-1 bepaald met qRT-PCR van drie onafhankelijke experimenten (** P < 0,01, *** P < 0,001). (B) Relatieve expressie van miR-24 in chirurgische specimens van 63 GC bepaald door qRT-PCR. Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd. De gegevens worden weergegeven als -ΔΔCT waarden S.D. niet laten zien. (C) De gemiddelde en standaardafwijking van miR-24 expressieniveaus in chirurgische specimens van 63 GC weefsels en voldoen niet-tumorweefsels getoond. Gegevens zijn weergegeven als 2-OCT-waarden (** P < 0,05). U6 snRNA werd gebruikt voor normalisatie. (D) miR-24 remde de groei van SGC-7901 cellen zoals gedetecteerd door WST, terwijl anti-miR-24 verhoogde celgroei (* P < 0,05). De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten.
wij naast onderzochten de correlatie tussen de expressie van miR-24 en Clinicopathologische factoren in menselijke GC. De klinische en pathologische kenmerken van GC 63 patiënten zijn samengevat in Tabel 1. Op basis van relatieve expressie verhoudingen van miR-24 /U6 = 1 zijn de zaken verdeeld in twee groepen: de miR-24 high-expressie (n = 29) en de miR-24 low-expressie groep (n = 34). De miR-24 low-expressie groep vertoonden beduidend lagere tumor differentiatie (P = 0,021). Echter, de miR-24-expressie niveau geen relatie met leeftijd, geslacht, tumor, de diepte van de lokale invasie, lymfeklieren metastase, of TNM stage.Table 1 Relatie tussen miR-24 expressie niveau en Clinicopathologische variabelen in 63 GC tonen patiënten
Clinicopathologische parameters
miR-24 expressie
P-waarde
High (n = 29)
Laag (n = 34)

Gender
Man
17
21
0,799
Female
12
13
Leeftijd (jaar)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
Tumor locatie
distale derde
8
8
0.310
Midden derde
6
13
proximale derde
15
13
WHO-classificatie
Darmkanker
25 | 28
0,155
zegelring cell carcinoma 1
5
Mucineuze adenocarcinoom
3 1
Differentiatie
Nou, matig
15
8
0.021
Slecht
14
26
Borrmann indeling
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
Lokale invasie
T1 /T2 1
7
0,098
T3 /T4
28
27
lymfekliermetastase
Geen
6 verhuur 4
0,535
Ja
23
30
Distant metastase
Geen
28
31
0,724
Yes 1
3
TNM stadium
I /II
7
8
0,955
III /IV 22

26 Belgique Om de biologische functie van miR-24 in de ontwikkeling en progressie van GC onderzoeken, transfecteerden wij SGC-7901 cellen met miR-24 bootst (SGC-7901 /miR-24) of miR-24 inhibitor (SGC-7901 /anti-miR-24). Zoals getoond in Extra file 1: Figuur S1A en S1B, selecteerden we 100 nM als geschikte concentratie in de volgende experimenten. Ectopische expressie van miR-24 in SGC-7901 cellen werd bevestigd door qRT-PCR. Vervolgens onderzochten we celproliferatie door WST assay. Overexpressie van miR-24 remde de groei van de SGC-7901-cellen ten opzichte van miR-control getransfecteerde cellen (P < 0,05), terwijl anti-miR-24 celgroei activiteiten (P < 0,05, figuur 1D) steeg.
overexpressie van miR-24 remt de migratie en invasie van GC cellen
Vervolgens evalueerden we het effect van miR-24 op mobiele migratie en invasie in GC. Celmigratie en invasie assays toonde aan dat overexpressie van miR-24 onderdrukt celmigratie (SGC-7901 /miR-24-groep, 63,0 ± 3,6 cellen per veld; controle groep, 126,3 ± 7,0 cellen per veld; P < 0,05) en de invasie ( SGC-7901 /miR-24-groep, 34,7 ± 2,1 cellen per veld; controle groep, 63,7 ± 3,5 cellen per veld; P < 0,05) (Figuur 2A, B). In contrast, knock-down van miR 24-aanzienlijk toegenomen migratie cel (SGC-7901 /anti-miR-24 groep, 182,3 ± 5,0 cellen per veld; controle groep, 105,3 ± 3,8 cellen per veld; P < 0,01) en de invasie (SGC -7901 /anti-miR-24 groep, 124,3 ± 3,8 cellen per veld; controle groep, 62,7 ± 2,5 per veld; P < 0,01) (Figuur 2A, C). Figuur 2 miR-24 geremd migratie en invasie van SGC-7901-cellen. (A) Representatieve gebieden van SGC-7901 cellen in transwell assays. (B, C) Representatieve gebieden van SGC-7901 cellen in de migratie en invasie assays, respectievelijk. Gemiddeld aantal migratie en invasie cellen per veld uit drie onafhankelijke experimenten (* P < 0,05, ** P < 0,01).
Overexpressie van miR-24 bevordert de apoptose van GC cellen en induceert celcyclus arrestatie in G0 /G1 fase
Aangezien celgroei waargenomen kan worden beïnvloed door de snelheden van apoptose en celcyclus progressie, onderzochten we de effecten van miR-24 op apoptose en celcyclus in vivo
door flowcytometrie. We vonden dat ongeveer 12-15% van de SGC-7901 /miR-24 cellen vertoonden morfologische kenmerken typisch van apoptose, met inbegrip van gecondenseerd chromatine en nucleaire fragmentatie door Hoechst33342 kleuring voor DNA-gehalte. In tegenstelling, na de boekhouding voor de zeldzame spontane apoptose in SGC-7901 cellen, de SGC-7901 /anti-miR-24-groep leverde geen significante veranderingen door Hoechst33342 kleuring (figuur 3A) te tonen. Flowcytometrie toonde aan dat de apoptotische tarief aanzienlijk SGC-7901 /miR-24 cellen werd verhoogd in vergelijking met controle-cellen (13,62% ± 1,25% vs. 6,15% ± 0,95%, respectievelijk; P < 0,01), en daalde aanzienlijk in SGC -7901 /anti-miR-24 in vergelijking met de controlegroep (3,92% ± 0,52% vs. 6,35% ± 0,83%, respectievelijk P < 0,05). (Figuur 3B, D) Belgique Om het mechanisme van buitenspiegels verder te ontrafelen 24 gemedieerde groeiremming van GC cellen, werd celcyclusanalyse uitgevoerd (Figuur 3C, E). Bij opregulatie van miR-24, het percentage cellen in G0 /G1-fase nam toe van 40,51% ± 3,15% bij de controles tot 72,24% ± 3,65% (P < 0,01), terwijl knockdown miR-24 verminderde het percentage cellen in G0 /G1 fase uit 42,35% ± 2,78% bij de controles tot 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Figuur 3 miR-24 geïnduceerde apoptose en G0 /G1 celcyclus. (A) Representatieve histogrammen afbeelding nucleaire morfologie van SGC-7901-cellen die transiënt getransfecteerd met 100 nM miR-24 imiteert of remmer en hun controles (Hoechst33342 kleuring oorspronkelijke vergroting x 400). (B) Representatieve histogrammen afbeelding apoptose van SGC-7901-cellen die transiënt getransfecteerd met 100 nM miR-24 imiteert of remmer en hun respectievelijke controles. (C) Representatieve histogrammen afbeelding celcyclus van SGC-7901-cellen die transiënt getransfecteerd met 100 nM miR-24 imiteert of remmer en hun respectievelijke controles. (D, E) Het percentage apoptotische en G0 /G1-fase cellen van drie onafhankelijke experimenten, gemiddelde ± S.D. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV is een doelwit-gen van miR-24 Belgique Om nader te onderzoeken de mechanismen van miR-24 in GC, wij zochten naar kandidaat-target genen door bioinformatica. TargetScan, miRBase Tatget en Sterrenbasis werden toegepast om te zoeken naar potentiële doelwitten van miR-24. Onder de voorspelde targets, werd RegIV geïdentificeerd als een van de doelwitgenen van miR-24, en identificeerden we een potentiële miR-24 bindingsplaats binnen het 3'UTR (Figuur 4A). Vervolgens onderzochten we de expressie van RegIV in negen GC cellen en GES-1. We vonden dat RegIV negen GC cellen werd overexpressie tegenover GES-1, en vertoonde een inverse expressiepatroon opzichte van miR-24 (aanvullende bestandsinformatie 2: Figuur S2A en S2B). Om te onderzoeken of het 3'UTR van RegIV mRNA een functioneel doelwit van miR-24, werden luciferase reportergen assays uitgevoerd. We hebben eerst onderzocht de activiteit van miR-24 (of miR-control) gecotransfecteerd in SGC-7901 cellen met Luc-RegIV plasmide of Luc-RegIV-mut plasmide (waarbij werd de vermeende miR-24 bindingsplaats gemuteerd), samen met de pRL-TK plasmide dat het Renilla luciferase gen als een interne controle (Figuur 4B). Cellen gecotransfecteerd met miR-24 toonde een significante afname van luciferase activiteit ten opzichte van de miR-controlegroep (P < 0,05). Echter, miR-24 gecotransfecteerd met de Luc-RegIV-mut plasmide vertoonden geen significant verschil in reporter activiteit in vergelijking met cellen gecotransfecteerd met miR-control. Ook anti-miR-24 verhoogde de luciferaseactiviteit van wildtype-Luc RegIV, maar had geen effect op Luc-RegIV mut-plasmide (Figuur 4C, P < 0,05). Ook uitgevoerd luciferase reportergen assays SNU-16 om de invloed van endogeen miR-24 te minimaliseren. Aanvankelijk ectopische expressie van miR-24 in SNU-16-cellen werd bevestigd door qRT-PCR. Expressie van miR-24 getransfecteerd met miR-24 bootst ongeveer 50 maal hoger dan die van miR-controlegroep SNU-16 (P < 0,01), terwijl er geen statistisch verschil met de transfectie van anti-miR-24 (aanvullende bestandsinformatie 3: Figuur S3A). Cellen gecotransfecteerd met miR-24 toonde een significante afname van luciferase activiteit ten opzichte van de miR-controlegroep (P < 0,001), terwijl er geen statistisch verschil met anti-miR-24 transfectie (aanvullende bestandsinformatie 3: Figuur S3B en S3C) . Deze resultaten sterk aan dat de 3'UTR van RegIV bevat directe binding sites voor miR-24. Figuur 4 miR-24 gerichte het 3'UTR van RegIV gen en immunokleuring van RegIV gastrische weefsels. (A) Schematisch diagram van de putatieve bindingsplaatsen van miR-24 in de RegIV 3'UTR. RegIV-mut geeft de RegIV-3'UTR met een mutatie in miR-24-bindende plaatsen. (B) miR-24 bootst gedownreguleerd activiteit van een luciferase reporter met wildtype RegIV 3'UTR (* P <0,05), maar niet de reporter met mutant RegIV 3'UTR. (C) Anti-miR-24 verhoogde de luciferaseactiviteit van wildtype-Luc RegIV (* P < 0,05), maar had geen effect op het mutant. (D) Achtenveertig uur na miR-24 nabootsen en controle transfectie van SGC-7901-cellen, werd het eiwitgehalte RegIV significant gedaald in vergelijking met de miR-besturing zoals bepaald met ELISA. Anti-miR-24 verhoogde de expressie van RegIV opzichte van de anti-miR-controle (* P < 0,05, ** P < 0,01). (E) Vierentwintig uur na miR-24 nabootsen of remmer en de respectievelijke controle transfectie in SGC-7901-cellen, was er geen verschil in het mRNA-niveau van RegIV opzichte van de miR-besturing zoals bepaald met qRT-PCR (P >0,05). De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten. (F) nr expressie van RegIV werd gedetecteerd in normale maagslijmvlies. (G) RegIV werd uitgedrukt in intestinale metaplasie van de maag. (H) Sterke expressie van RegIV werd waargenomen in de maag zegelring cell carcinoma.
Vervolgens onderzochten we miR-24 regulering van RegIV mRNA en eiwit niveaus in getransfecteerde SGC-7901-cellen. ELISA-analyse toonde aan dat RegIV eiwitniveaus sterk onderdrukt werden in SGC-7901 /miR-24 cellen, terwijl RegIV eiwitgehalten in SGC-7901 /anti-miR-24-cellen (Figuur 4D werden opgereguleerd; * P < 0,05, ** P < 0,01). qRT-PCR analyse toonde geen verschil in het niveau van RegIV mRNA in alle getransfecteerde celgroepen (Figuur 4E; P > 0,05). Ondertussen gedetecteerd we de expressie van c-MYC GC cellen als positieve controle getransfecteerd met miR-24 [20]. We vonden dat miR-24 neerwaarts gereguleerd RegIV en c-MYC (Extra file 4: Figuur S4A en S4B).
Eerdere studies toonden aan dat RegIV werd geassocieerd met proliferatie en metastase van GC. We vervolgens gebruikt immunohistochemische analyse om de expressie van RegIV GC evalueren. Onze bevindingen bevestigd overexpressie van RegIV in GC. Het eiwitgehalte van RegIV in normale maagslijmvlies was lager dan intestinale metaplasie van de maag en de maag zegelring cell carcinoma (Figuur 4F-H). Om de klinische relevantie van deze bevindingen te beoordelen, onderzochten we de correlatie tussen de uitingen van RegIV en miR-24 in GC weefsels. We vonden dat RegIV en miR-24 vertoonde een inverse expressiepatroon in GC weefsels (Tabel 2). Deze resultaten ondersteunen het idee dat downregulatie van miR-24 resulteerde in een verhoogde eiwit niveaus van RegIV in GC.Table 2 RegIV en miR-24 vertonen inverse expressie patroon in GC
miR-24 expressie
P-waarde
Laag
hoge
Reg IV (IHC)
Negatief
9
16
0,038 *
Positieve
25 | 13
* P Restaurant < 0,05 werd beschouwd als statistisch significant
overexpressie van miR-24 remt tumorvorming in vivo
Gezien het feit dat miR-24 verbeterde de. proliferatie van GC-cellen in vitro
, we onderzocht of miR-24 zou kunnen beïnvloeden tumorvorming in vivo
. Door retrovirus gemedieerde SGC-7901 /miR-24 en SGC-7901 /miR-control stabiele cellijnen werden verkregen zoals beschreven in het hoofdstuk Werkwijzen. SGC-7901 /RV-miR-24 en SGC-7901 /RV-miR-controlecellen werden subcutaan in vier weken oude mannelijke naakt muizen en tumorvorming werd gevolgd. Groeiden langzamer SGC-7901 /RV-miR-24-groep dan in de SGC-7901 /RV-miR-controlegroep (figuur 5A). Het gemiddelde tumorvolume in muizen ingeënt met SGC-7901 /RV-miR-24-cellen op dag 28 was aanzienlijk kleiner in vergelijking met muizen die geënt met SGC-7901 /RV-miR-control-cellen (397,45 ± 93,07 mm 3 vs. 1083,56 ± 101,56 mm 3, respectievelijk) (figuur 5B en C; P < 0,05). Figuur 5 miR-24 remde tumorgeniciteit en proliferatie in vivo. (A) Foto van tumoren afgeleid van RV-miR-24 of RV-miR-controle cellen in naakt muizen. (B) Groeikinetiek van tumoren in naakt muizen. Tumordiameters werden elke 7 dagen gemeten. Het volume van het naakt muizen door balkjes, S.D. (* P < 0,05). (C) Het gemiddelde gewicht van tumoren in naakt muizen. De gegevens worden getoond als gemiddelden ± S.D. (* P < 0,05). (D) Representatieve foto van immunohistochemische analyse van Ki-67 antigeen in tumoren van naakt muizen (oorspronkelijke vergroting 200 x). (E) Vertegenwoordiger proliferatieve index van tumoren in RV-miR-24 en RV-miR-control naakt muizen. De gegevens worden getoond als gemiddelden ± S.D. (** P < 0,05). (F) expressieniveaus van RegIV in tumorweefsels van naakt muizen. De gegevens worden getoond als gemiddelden ± S.D. (* P < 0,05). (G) Expressie niveaus van RegIV mRNA in tumor weefsels van naakt muizen (P > 0,05). De gegevens worden getoond als gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten.
Om te beoordelen of de tumor groeiremming in SGC-7901 /RV-miR-24-cellen was deels te wijten aan de onderdrukking van de proliferatie, immunohistochemische analyses van de tumor weefsels werden uitgevoerd. Zoals getoond met Ki-67 antigeen kleuring, kan de verminderde tumorgroei bij muizen geïnjecteerd met SGC-7901 /RV-miR-24 cellen deels als gevolg van lagere proliferatie veroorzaakt door overexpressie van miR-24. Het percentage Ki-67 antigeen-positieve cellen was lager in de tumor afgeleid van SGC-7901 /RV-miR-24 cellen dan de tumor afgeleid van SGC-7901 /RV-miR-controlecellen (37,1% ± 3,6% vs. . 79,5% ± 5,2%, respectievelijk) (figuur 5D en E; P < 0,01). Het expressieniveau van RegIV zoals bepaald met ELISA was lager in de tumor afgeleid van overexpressie miR-24 dan de tumor afgeleid van controlecellen (1,77 ± 0,15 ng /ml in SGC-7901 /RV-miR-24 versus 3,13 ± 0,25 ng /ml in SGC-7901 /RV-miR-control) (Figuur 5F; P < 0,05). Er was echter geen statistisch verschil in de relatieve expressie van mRNA RegIV (Figuur 5G). Daarom werden de tumorigeniteit van SGC-7901 /RV-miR-24 cellen aanzienlijk verminderd in vivo
.
Discussie
werd bewezen heeft belangrijke rollen voor miRNAs die fungeren hetzij tumor suppressors of oncogenen ondersteund in GC [21-23]. Daarnaast zijn veel miRNAs aangetoond dat therapeutisch potentieel vertonen. Vanwege hun functie als kapitein regulatoren van het genoom en nieuwe werkingsmechanisme, worden miRNAs als een veelbelovende techniek voor therapeutische ontwikkeling [24]. miR-26a heeft antitumorigene eigenschappen en potentiële therapeutische bruikbaarheid van leverkanker in vitro Kopen en in vivo
, en is geassocieerd met snelle en aanhoudende remming van proliferatie van kankercellen en zeer specifieke inductie van celdood tumor [25]. Het specifieke mechanisme van de rol van ontregelde miRNAs in de maag carcinogenese blijft ongrijpbaar.
In deze studie hebben we aangetoond dat de remmende effecten van miR-24 op tumor metastase in de klinische, cellulair en moleculair niveau en in een proefdiermodel. Wij ontvangen gedetailleerde mechanistische experimenteel bewijs voor de rol van miR-24 in GC door het onderdrukken van de expressie van RegIV. Studies toonden aan dat miR-24 kan als oncogen bij maligne effusies [26], orale carcinoma [27, 28], prostaatkanker [3] en longkanker [29, 30], maar kan als een tumor suppressor colonkanker [ ,,,0],19] en retinoblastoom tumoren [31]. Een Lal et al. gevonden dat miR-24 remden celproliferatie en celcyclusprogressie door het onderdrukken van de expressie van E2F2, MYC en andere celcyclus regulerende genen door binding aan "zaadloze" 3'UTR miRNA herkenningselementen [20]. Wu J et al. gemeld dat transfectie van miR-24 in GC cellen verminderde de expressie van AE1 eiwit, waardoor remming van cellulaire proliferatie [32]. Echter, de complete onderliggende mechanismen voor miR-24 in GC zijn nog steeds niet duidelijk.
Onze rapport geïdentificeerd miR-24 als een kandidaat tumor suppressor in GC. We vonden downregulatie van miR-24 expressie, zowel in GC weefsels en cellijnen. Overexpressie van miR-24 in SGC-7901 GC cellen aanzienlijk verminderd proliferatie en invasie zowel in vitro en in vivo

, het openbaren van de potentiële therapeutische effect van miR-24 in GC. Het tegenovergestelde resultaat werd verkregen wanneer de expressie van miR-24 werd geremd door anti-miR-24. Tezamen suggereren deze resultaten dat miR-24 kan functioneren als een tumor suppressor in human GC.
MiRNAs binden bij perfect of imperfecte complementair "seed" sequenties in doelwit mRNA, wat leidt tot splitsing van doelwit mRNA of inhibitie van de vertaling [33] . In deze studie hebben we vastgesteld RegIV een doelgen van miR-24. miR-24 gebonden onvolledige complementariteit met RegIV mRNA, waardoor directe translationele remming van mRNA RegIV maar zonder effect op de totale mRNA stabiliteit. Omdat de verschillende actie modes van miRNA, heeft miR-24 geen invloed op het mRNA-niveau van RegIV maar de translationele remming. RegIV is een lid van het humane Reg-gen familie, die sequentie-overeenkomst deelt met het koolhydraat-bindende domein van C-type lectinen, en werd eerst geïsoleerd en gekarakteriseerd in menselijke inflammatoire darmziekte [34]. RegIV is een soort van uitgescheiden eiwitten, en speelt een biologische rol afhankelijk van de extracellulaire uitgescheiden eiwitten, zodat we namen ELISA als geprefereerde detectiemethode. Western blot werd uitgevoerd op het eiwitniveau van RegIV valideren, en we vergelijkbare resultaten verkregen. Eerdere studies hebben gemeld dat de RegIV gen veelvuldig werd overexpressie in GC en is mogelijk betrokken zijn bij de invasie, metastase en carcinogenese van GC. RegIV expressie werd eng beperkt in goedaardige weefsels [35, 36]. RegIV expressie was aanzienlijk hoger bij patiënten met peritoneale metastasen in vergelijking met patiënten zonder peritoneale metastasen. RegIV misschien peritoneale uitzaaiingen in GC en niveaus in lavagevloeistoffen versnellen als een goede marker voor peritoneale metastase [37-39] zou kunnen dienen. RegIV kan functioneren als een serum biomarker voor GC patiënten en remt 5-FU-geïnduceerde apoptose door inductie van Bcl-2 en dihydropyrimidine dehydrogenase [40].
In de huidige studie, identificeerden wij miR-24 als potentiële stroomopwaartse regulator van RegIV. Eerste, overexpressie van miR-24 verminderde de activiteit van een luciferase reporter gen dat het 3'UTR van RegIV, terwijl mutatie van de sites "seed regio" in de 3'UTR van RegIV ter regulering van miR-24 afgeschaft. Het tegenovergestelde resultaat werd verkregen toen we anti-miR-24. Ten tweede, menselijke GC weefsels tot expressie significant lagere miR-24 dan niet-tumorweefsels, terwijl GC weefsels bevatten significant hogere RegIV eiwit dan niet-tumorweefsels. Ten derde, overexpressie van miR-24 neerwaarts gereguleerd RegIV op het eiwit niveau, terwijl de neerwaartse regulatie van miR-24 steeg RegIV eiwitgehalte. Ten vierde, overexpressie van miR-24 was significant verband met proliferatie en metastase, wat wijst op een functionele overlap met RegIV. Al deze resultaten geven aan dat een rechtstreekse RegIV doelgen van miR-24 in GC kan zijn.
Carcinogenese is een reeks opeenvolgende events onthechting, migratie, lokale invasie, angiogenese, intravasation, overleving in de bloedsomloop, extravasatie en hergroei in verschillende organen [41, 42]. Hier hebben we aangetoond dat miR-24 de carcinogenese van GC kan regelen door middel van het moduleren van de proliferatie, migratie en lokale invasie. Bovendien zijn onze bewijs suggereert de mogelijkheid van miR-24 als een therapeutisch doel in GC. Verdere studies zijn nodig om volledig te begrijpen de gedetailleerde mechanismen van miR-24 in GC carcinogenese en als een potentiële therapeutische aanpak.
Methods
ethische verklaring
Schriftelijke informed consent werd verzameld uit alle deelnemers, en de studie protocol werd goedgekeurd door de ethische commissie van Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Alle muizen experimenten werden goedgekeurd door de Animal Care (Permit.120.810) en gebruik Comite en uitgevoerd in overeenstemming met de officiële aanbevelingen van de zorg en het gebruik van proefdieren Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
Cellijnen
De GC humane cellijnen SNU-1, SNU-16, NCI-N87 en KATO III werden gekocht bij American Type Culture Collection (ATCC). De cellijnen SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, en AGS werden gekocht bij Shanghai Institutes voor Biologische Wetenschappen, de Chinese Academy of Sciences. De vereeuwigd normale maagslijmvlies epitheliale cellijn (GES-1) was een gift van Prof. Feng Bi (Huaxi Medical University, Chengdu, provincie Sichuan, PR China). De embryonale niercellijn 293 T werd bewaard laboratoriumwaarden onderhouden in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM) met 10% foetaal runderserum (FBS) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO 2. Alle GC-cellen werden gekweekt in RPMI 1640 aangevuld met 10% FBS in een bevochtigde incubator met 5% CO 2 bij 37 ° C.
Weefselmonsters
Primaire kankerweefsels en gepaarde naburige niet-tumorweefsels verzameld van patiënten met GC ingrijpend gastrectomy op de afdeling Chirurgie, Ruijin Hospital, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. De aangrenzende normale weefsels werden verkregen op 5 cm van de primaire kanker. Weefsel monsters werden onmiddellijk snel bevroren in vloeibare stikstof en bewaard in een koelkast bij -80 ° C. Weefsels voor immunohistochemie werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde en in paraffine ingebedde. Clinicopathologische gegevens werden beoordeeld, en TNM staging indeling is gebaseerd op de criteria van de Amerikaanse Joint Committee on Cancer (AJCC, 6e editie). Alle monsters werden geverifieerd door pathologisch onderzoek.
RNA-isolatie en qRT-PCR
Totaal RNA werd geïsoleerd uit weefsel monsters en cellijnen behulp van Trizol reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) volgens de instructies van de fabrikant. De expressieniveaus van miRNAs werden geëvalueerd met de Hairpin-ITTM miRNAs qPCR Kwantificering Kit (GenePharma, Shanghai, China PR) volgens protocol van de fabrikant. De U6 klein nucleair RNA (RNU6B; GenePharma) werd gebruikt voor normalisatie. De relatieve expressie verhouding van miR-24 in elke gekoppelde tumor en niet-tumorweefsel werd berekend met behulp van de 2 -ΔΔCT methode. De miR-24-expressie niveau werd gedefinieerd als opgereguleerd als de relatieve expressie verhouding > 1, en gedefinieerd als neerwaarts gereguleerd wanneer de relatieve expressie verhouding < 1. van drie onafhankelijke experimenten. Alle auteurs gelezen en goedgekeurd het definitieve manuscript.

• Gastric versus post-pyloric voeden: een systematische review
• Nut van intranasale Ketamine en Midazolam aan maag zuigt uit te voeren bij kinderen: een dubbelblinde, placebo-gecontroleerde, gerandomiseerde studie