Supresor MIR-24 potláča žalúdočnú progresiu rakoviny o downregulating RegIV

nádorového supresor MIR-24 potláča žalúdočnú progresiu rakoviny o downregulating RegIV
abstraktné
pozadia
microRNA sú malé nekódujúca RNA, ktoré modulujú rad bunkových procesov tým, že reguluje násobku ciele, ktoré môžu podporovať alebo potlačenie rastu zhubných správania. Hromadia sa dôkazy naznačujú, MIR-24 hrá dôležitú úlohu v ľudskej rakoviny. Avšak, jeho presná biologická úloha zostáva z veľkej časti uniká. Táto štúdia skúmala úlohu Mir-24 v karcinómu žalúdka (GC).
Metódy
expresie Mir-24 v GC tkanivách v porovnaní s spárovaných nenádorových tkanív a GC buniek bola zistená pomocou QRT-PCR. Syntetické krátke jednoduché alebo dvojité RNA oligonukleotidy a lentivirové vektory boli použité na reguláciu Mir-24 expresie v GC buniek vyšetriť svoju funkciu in vitro stroje a in vivo
.
Výsledky
MIR-24 bola signifikantne downregulated v GC tkanivách v porovnaní s spárovaných nenádorových tkanív a bola spojená s diferenciáciou nádoru. Ektopická expresia Mir-24 v SGC-7901 GC buniek potlačená bunkovú proliferáciu, migráciu a inváziu in vitro
, rovnako ako in vivo karcinogenity
indukciu zastavenie bunkového cyklu v G0 /G1 fáze a podporovať apoptózu buniek. Ďalej sme identifikovali RegIV ako cieľ Mir-24 a preukázali, že mier-24 reguluje RegIV expresiu väzbou jeho 3 'nepřekládané oblasti.
Závery
Mir-24 funkcie ako nové nádorový supresor v GC a anti -oncogenic aktivita môže zahŕňať jeho inhibícia cieľového génu RegIV. Tieto zistenia ukazujú na možnosť pre mier-24 ako terapeutický cieľ v GC.
Kľúčové
MIR-24 RegIV Karcinóm žalúdka proliferation Invasion Metastasis pozadí
rakovina žalúdka (GC) je jedným z najčastejších ľudských rakovín. Aj keď je výskyt a úmrtnosť sa v priebehu posledných 20 rokov po celom svete sa znížil, GC zostáva prvým štvrtou najčastejšou a druhý najviac smrtiace rakoviny po celom svete [1]. Hoci výskum v GC zaznamenala veľký pokrok, molekulárnej mechanizmy GC ešte neboli plne objasnené.
MikroRNA (miRNA) sú malé nekódujúca, dvouřetězcové molekuly RNA, ktoré môžu modulovať expresiu cieľových génov ovplyvnením post- transkripčné procesy regulujúci génovú expresiu. miRNA rozpoznať cieľovej mRNA na základe úplnej alebo neúplné sekvenčné komplementarity a zabrániť produkciu proteínu viazať sa na netranslatované oblasti (3 'UTR), alebo otvoreného čítacieho rámca (ORF) cieľovej mRNA [2, 3]. miRNA Bolo preukázané, že funkcie v bunkovej proliferácie a diferenciácie procesov, vrátane epiteliálnych-mezenchýmových prechodu [4] a endodermální diferenciáciu ľudských embryonálnych kmeňových buniek [5]. Okrem všeobecných bunkových funkcií miRNA, tieto molekuly hrajú tiež dôležitú úlohu v rôznych ľudských ochorení. Početné štúdie preukázali, že misregulation miRNA súvisí s rakovinou [6, 7], v ktorom fungujú buď ako onkogény alebo nádorových supresor. miRNA boli popísané, ktoré majú byť zapojené do AML, karcinóm prsníka, nemalobunkový karcinóm pľúc, hepatocelulárny karcinóm, rakovina hrubého čreva, GC a ďalších typov rakoviny [8-13]. Nadmerná expresia alebo zníženie expresie miRNA génov vedie k diverzifikácii expresie proteínu, a preto prispievajú k tvorbe nádorov moduláciou proliferácie, angiogenézy a invázie. Vedci zistili, že miRNA expresné profily môžu byť použité ku klasifikácii rakoviny u ľudí, a toto zistenie bolo pred použitím messenger RNA profilov pre klasifikáciu zle diferencovaných tumorov [14, 15].
Aberrant expresie špecifických miRNA v GC bola už skôr a bol v korelácii s progresiou a prognózou GC [16-18]. Už skôr sme zistili, že mier-24, ktorý môže slúžiť ako nádorový supresor cez polymorfizmus cieľového miesta [19], bol výrazne downregulated miRNA v GC bunkách a tkanivách v porovnaní s non-nádorových tkanivách. V tejto štúdii sme analyzovali MIR-24 hladiny expresie v tkanivách v porovnaní s GC spárovaných nenádorových tkanív, a hodnotené korelácia medzi MIR-24 úrovne a patologickým parametrov. Hodnotili sme vplyv zvýšenej expresie Mir-24 na rast a apoptóze SGC-7901 GC buniek in vitro a in vivo
. Zistili sme tiež, biologický účinok downregulace Mir-24 na expresiu GC buniek. Ďalej sme identifikovali RegIV (regenerácia ostrovčekov odvodené od rodiny, člen 4) ako jedna z cieľových génov MIR-24. Predpokladáme, že mier-24 je možné regulovať inváziu a metastázovaniu GC buniek priamo cielia na gén RegIV.
Výsledky
Zvýšená expresia MIR-24 inhibuje proliferáciu buniek GC
Ak chcete preskúmať expresiu Mir-24 v GC bola vykonaná kvantitatívna real-time RT-PCR (QRT-PCR). Expresie MIR-24 bol všeobecne downregulated v deviatich GC bunkových líniách v porovnaní s imortalizovaných normálnych epitelových buniek žalúdočnej sliznice GES-1 (obrázok 1A). Expresie MIR-24 bola ďalej skúmaná pomocou QRT-PCR v nádorových tkanivách a uzavreté nenádorových tkanív od 63 GC pacientov (obrázok 1B). Priemerná úroveň expresie MIR-24 bola významne downregulated v nádorových tkanivách v porovnaní so zodpovedajúcimi nenádorových tkanív (Obrázok 1C). Spoločne tieto výsledky za predpokladu, silný dôkaz, že mier-24 bola významne downregulated v GC. Obrázok 1 Mier-24 je podstatne downregulated v GC a inhibuje SGC-7901 rast buniek. (A) Relatívna expresie MIR-24 v deviatich bunkových línií GC v porovnaní s GES-1 určené QRT-PCR z troch nezávislých experimentov (** p < 0,01, *** p 0,001). (B) Relatívna expresie MIR-24 v chirurgických vzoriek z 63 GC určeného QRT-PCR. Všetky experimenty boli vykonané v troch opakovaniach. Údaje sú uvedené ako hodnoty -ΔΔCT, S.D. neukázané. sú zobrazené (C) Priemerná hodnota a štandardná odchýlka Mir-24 úrovní expresie v chirurgických vzoriek z 63 GC tkanív a uzavreté normálnom tkanive. Údaje sú prezentované ako hodnoty 2-ΔCT (** P 0,05). U6 snRNA bol použitý pre normalizáciu. (D) MIR-24 inhibuje rast SGC-7901 buniek, ako je detekovaná WST, zatiaľ čo anti-MIR-24 zvyšuje rast buniek (* p 0,05). Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. z troch nezávislých experimentov.
Ďalej sme skúmali korelácia medzi hladinou expresie Mir-24 a patologickým faktorov v ľudskom GC. Klinické a patologické charakteristiky 63 pacientov GC sú uvedené v tabuľke 1. na relatívnych pomerov expresie MIR-24 /U6 = 1 základe prípady boli rozdelené do dvoch skupín: Mir-24 high-výraz skupina (n = 29) a mir-24 s nízkou výraz skupina (n = 34). Mir-24 s nízkou výraz skupina vykazovala výrazne nižšie diferenciácie nádoru (p = 0,021). Avšak úroveň expresie MIR-24 nepreukázali žiadny vzťah k veku, pohlavia, nádoru mieste, v hĺbke miestnej invázie, lymfatických uzlín, alebo TNM stage.Table 1 Vzťah medzi MIR-24 úrovne expresie a patologickým premenných 63 GC pacienti
patologickým parametre
MIR-24 expresie
P hodnota
Vysoká (n = 29)
Low (n = 34)

rodovej rovnosti
spoločností Male
17
21
0,799
Žena
12
13
vek (roky)
<60
15
18
0,923
≥60
14
16
umiestnenie nádoru
distálnej tretej
8
8
0,310
Middle tretej
6
13
Proximálna tretej
15
13
WHO klasifikácia
adenocarcinoma
25
28
0,155 karcinóm
Signet ring-cell
1
5
mucinózní adenokarcinóm Sims 3 foto 1
Diferenciácia
No, mierne
15
8
0,021
Zle
14.
26
Borrmann klasifikácie
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
Miestne invázie
T1 /T2
1
7
0,098
T3 /T4
28
27
lymfatických uzlín
č ​​
6
4
0,535
Áno
23
30
vzdialenej metastázy
Nie
28
31
0,724
Áno
1 Sims 3
TNM štádia
I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
Pre zistenie biologickú funkciu Mir-24 v rozvoji a progresii GC sme transfekované SGC-7901 buniek s Mir-24 napodobňuje (SGC-7901 /MIR-24) alebo MIR-24 inhibítor (SGC-7901 /anti-MIR-24). Ako je znázornené na ďalší súbor 1: Obrázok S1A a S1B, sme vybrali 100 nM, ako bolo vhodné koncentrácii v nasledujúcich pokusoch. Ektopická expresia Mir-24 v SGC-7901 buniek bola potvrdená QRT-PCR. Ďalej sme skúmali bunkovej proliferácie WST test. Nadmerná expresia MIR-24 inhiboval rast o SGC-7901 buniek v porovnaní s Mir-kontrolných transfekciou buniek (P menšia ako 0,05), zatiaľ čo anti-MIR-24 zvyšuje aktivity bunkového rastu (P menšia ako 0,05, obr 1D).
Zvýšená expresia MIR-24 inhibuje migráciu a inváziu GC buniek
Ďalej sme hodnotili vplyv mir-24 o migrácii buniek a invázie v GC. migráciu buniek a invázie testy ukázali, že zvýšená expresia MIR-24 potlačil migráciu buniek (SGC-7901 /MIR-24 skupina, 63,0 ± 3,6 buniek v jednom poli; kontrolnej skupine 126,3 ± 7,0 buniek v jednom poli; P < 0,05) a invázie ( SGC-7901 /MIR-24 skupina, 34,7 ± 2,1 buniek na poli; kontrolná skupina, 63,7 ± 3,5 buniek v jednom poli; P menšia ako 0,05) (obrázok 2A, B). Na rozdiel od toho porazený Mir-24 významne zvýšené migráciu buniek (SGC-7901 /anti-MIR-24 skupina, 182,3 ± 5,0 buniek na poli; kontrolná skupina, 105,3 ± 3,8 buniek v jednom poli; P < 0,01) a invázie (SGC -7901 /anti-MIR-24 skupina, 124,3 ± 3,8 buniek na poli; kontrolná skupina, 62,7 ± 2,5 na poli; P < 0,01) (obrázok 2A, C). Obrázok 2 MIR-24 potlačený migrácie a invázie do SGC-7901 buniek. (A) reprezentatívne pole SGC-7901 buniek v transwell testoch. (B, C) Reprezentatívne pole SGC-7901 buniek v testoch migrácie a invázie, resp. Priemerný počet migrácie a invázie buniek na pole z troch nezávislých experimentov (* P menšie ako 0,05, ** P 0,01).
Zvýšená expresia MIR-24 podporuje apoptózu GC buniek a indukuje zástavu bunkového cyklu v G0 /G1 fázy
Vzhľadom na to, že pozorované bunkový rast môže byť ovplyvnený miery apoptózy a progresie bunkového cyklu sme skúmali účinky mir-24 o apoptózy a bunkového cyklu in vivo
pomocou prietokovej cytometrie. Zistili sme, že približne 12 až 15% z SGC-7901 /MIR-24 bunky vykazovali morfologické rysy typické apoptózy, vrátane kondenzovaného chromatínu a jadrovej fragmentácia Hoechst33342 farbenie na obsah DNA. Naproti tomu po zohľadnení vzácne spontánnej apoptózy u SGC-7901 buniek SGC-7901 /anti-MIR-24 skupina nevykazovali žiadne výrazné zmeny od Hoechst33342 farbenie (obrázok 3A). Prietoková cytometria ukázala, že proapoptotický rýchlosť bola významne zvýšená v SGC-7901 /MIR-24 buniek v porovnaní s kontrolnými bunkami (13,62% ± 1,25% oproti 6,15% ± 0,95%, v uvedenom poradí; P &0,01), a v SGC významne znížili -7901 /anti-MIR-24 v porovnaní s kontrolnou skupinou (3,92% ± 0,52% oproti 6,35% ± 0,83%, v uvedenom poradí, p menšie ako 0,05). (obrázok 3B, D)
Pre ďalšie objasnenie mechanizmu spätných 24-sprostredkované inhibícia rastu buniek GC analýza bunkového cyklu bola vykonaná (3C, E). Na up-reguláciu MIR-24, percento buniek v G0 /G1 fáze, sa zvýšil z 40,51% ± 3,15% u kontroly, 72,24% ± 3,65% (P 0,01), zatiaľ čo knockdown MIR-24 znižuje percento buniek v G0 /G1 fázy z 42,35% ± 2,78% u kontroly, 30,25% ± 1,25% (P menšia ako 0,05). Obrázok 3 MIR-24 indukovanú apoptózu a G0 /G1 bunkového cyklu. (A) reprezentatívne histogramy zobrazujúce jadrovej morfológiu SGC-7901 bunkách prechodne transfekciou 100 nM MIR-24 napodobňuje alebo inhibítor a ich príslušné kontroly (Hoechst33342 farbenie, pôvodné zväčšenie x 400). (B) reprezentatívne histogramy znázorňujúci apoptózu SGC-7901 buniek prechodne transfekciou 100 nM MIR-24 napodobňuje alebo inhibítora a ich kontrol. (C) reprezentatívne histogramy znázorňujúci bunkový cyklus SGC-7901 buniek prechodne transfekciou 100 nM MIR-24 napodobňuje alebo inhibítor a ich príslušné ovládacie prvky. (D, E) Percento apoptotických a G0 /G1 fáze buniek z troch nezávislých pokusov, priemer ± S.D. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV je cieľový gén MIR-24
Ak chcete bližšie skúmať mechanizmy Mir-24 v GC, sme hľadali kandidáta cieľových génov bioinformatika. TargetScan, miRBase Tatget a STARBASE boli použité na hľadanie potenciálnych cieľov MIR-24. Medzi predpokladané ciele, RegIV bol identifikovaný ako jeden z cieľových génov MIR-24, a boli identifikované jeden potenciálny MIR-24 väzobné miesto v jeho 3 'UTR (obrázok 4A). Ďalej sme skúmali expresiu RegIV v deviatich GC buniek a GES-1. Zistili sme, že RegIV bol nadmerne exprimovaný v deviatich GC buniek v porovnaní s GES-1, a vykazoval inverzné expresné vzor v porovnaní s Mir-24 (ďalšie súbor 2: Obrázok S2A a S2B). Pre zistenie, či je 3 'UTR RegIV mRNA bola funkčná terč MIR-24, boli vykonané testy reporterového génu luciferázy. Prvý sme hodnotili aktivitu MIR-24 (alebo MIR-kontrola) kotransfekovány do SGC-7901 buniek Luc-RegIV plazmidu alebo Luc-RegIV-mut plazmidu (v ktorej bol predpokladaný MIR-24 väzobné miesto mutovaný), spolu s PRL-TK plazmidu obsahujúceho gén pre luciferázy Renilla ako vnútorná kontrola (obrázok 4B). Bunky kotransfekovány s Mir-24 preukázali významné zníženie luciferázové aktivity v porovnaní s Mir-kontrolnej skupiny (p menšie ako 0,05). Avšak, mier-24 ko-transfekovány s Luc-RegIV-mut plazmidu ukázalo, žiadny významný rozdiel v aktivite reportérového v porovnaní s bunkami kotransfekovány s Mir-kontrolou. Rovnako tak, anti-MIR-24 zvyšuje aktivitu luciferázy u divokého typu Luc-RegIV, ale nemal žiadny vplyv na Luc-RegIV-mut plazmidu (obrázok 4C; P menšia ako 0,05). Tiež vykonáva testy reporterového génu pre luciferázy v SNU-16, aby sa minimalizovalo vplyv endogénnej MIR-24. Na prvý, ektopická expresia Mir-24 v SNU-16 buniek bola potvrdená QRT-PCR. Expresie MIR-24 transfekované s Mir-24 napodobňuje bola približne 50 krát vyššia, než je MIR-kontrolnej skupiny v SNU-16 (P 0,01), zatiaľ čo žiadny štatistický rozdiel transfekciu anti-MIR-24 (ďalší súbor 3: Obrázok S3A). Bunky kotransfekovány s Mir-24 preukázali významné zníženie luciferázové aktivity v porovnaní s Mir-kontrolnej skupiny (p 0,001), zatiaľ čo žiadny štatistický rozdiel anti-MIR-24 transfekcia (Ďalší súbor 3: Obrázok S3B a S3C) , Tieto výsledky jasne ukázali, že 3 'UTR RegIV obsahuje priame väzobné miesta pre mier-24. Obrázok 4 MIR-24 bola zameraná na 3 'UTR RegIV gén a imunologické z RegIV v žalúdočných tkanivách. (A) Schéma graf väzbovými miestami pre mier-24 v RegIV 3 'UTR. RegIV-mut označuje RegIV-3 'UTR s mutáciou v Mir-24-väzobných miest. (B) MIR-24 má rovnakú funkciu ako downregulated aktivitu luciferázy reportérom, ktorý obsahuje divoký typ RegIV 3 'UTR (* p 0,05), ale nie s reportér mutantný RegIV 3' UTR. (C) Anti-MIR-24 zvyšuje aktivitu luciferázy u divokého typu Luc-RegIV (* p 0,05), ale nemala žiadny vplyv na mutantného. (D) Štyridsať osem hodín po MIR-24 mimických a kontrolné transfekciu SGC-7901 buniek, hladiny proteínu RegIV bol významne znížený v porovnaní s Mir-kontroly, ako je stanovené pomocou ELISA. Anti-MIR-24 zvýšil expresiu RegIV v porovnaní s anti-MIR-kontroly (* p menšie ako 0,05, ** P 0,01). (E) Dvadsaťštyri hodín po MIR-24 mimetikum či inhibítora a príslušné kontrolné transfekcia v SGC-7901 bunky, nebol žiadny rozdiel v úrovni mRNA RegIV v porovnaní s Mir-kontroly, ako je stanovené QRT-PCR (P >0,05). Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. z troch nezávislých experimentov. (F) č expresie RegIV bola detekovaná v normálnej žalúdočnej sliznici. (G) RegIV bol exprimovaný v intestinálnej metaplázia žalúdku. (H) silné vyjadrenie RegIV bola pozorovaná u karcinómu žalúdka Signet-ring buniek.
Next sme sa zaoberali Mir-24 reguláciu RegIV mRNA a nízka hladina bielkovín v transfekciou SGC-7901 buniek. ELISA analýza ukázala, že hladina RegIV proteínov boli výrazne potlačená v SGC-7901 /Mir-24 bunky, zatiaľ čo hladiny RegIV proteínov bola up-regulovaná v SGC-7901 /anti-MIR-24 bunkách (obrázok 4D; * P menšie ako 0,05, ** P < 0,01). QRT-PCR analýzou bolo zistené, žiadny rozdiel v úrovni RegIV mRNA vo všetkých transfektovaných bunkových skupín (obrázok 4E; P &0,05). Medzitým sme zistili expresiu c-myc v GC buniek ako pozitívnu kontrolu transfekované MIR-24 [20]. Zistili sme, že mier-24 downregulated RegIV a c-myc (dodatočný súbor 4: Obrázok S4A a S4B).
Predchádzajúce štúdie preukázali, že RegIV bolo spojené so šírením a metastázy GC. Ďalej sme použili imunohistochemické analýzy na vyhodnotenie expresie RegIV v GC. Naše zistenia potvrdila zvýšenú expresiu RegIV v GC. Hladiny proteínu RegIV v normálnej žalúdočnej sliznici bola nižšia ako črevnú metaplázia žalúdka a karcinómu žalúdka pečatný krúžok buniek (obrázok 4F-H). Aby bolo možné posúdiť klinický význam týchto zistení sme skúmali korelácia medzi prejavmi RegIV a Mir-24 v GC tkanivách. Zistili sme, že RegIV a mier-24 vykazovala inverzný výrazom vzor GC tkanív (tabuľka 2). Tieto výsledky podporujú názor, že zníženie expresie MIR-24 viedlo k zvýšeniu výskytu proteínových RegIV v GC.Table 2 RegIV a mier-24 vykazujú inverzný expresného profilu v GC
Mir-24 expresie
hodnota P
Low
spoločností High
Reg IV (IHC)
Negatívny
9
16
0,038 *
pozitívny
25
13
* P
menšia ako 0,05 bola považovaná za štatisticky významnú
Zvýšená expresia MIR-24 inhibuje tumorigeničnosti in vivo
Vzhľadom na to, že mier-24 zlepšila. proliferácie GC buniek in vitro
sme skúmali, či MIR-24 by mohli ovplyvniť tumorigeničnosti in vivo
. Retrovírusom sprostredkovaná SGC-7901 /MIR-24 a SGC-7901 /MIR-riadiace stabilné bunkové línie boli získané, ako je popísané v časti Metódy. SGC-7901 /RV-MIR-24 a SGC-7901 /RV-MIR-kontrolné bunky boli injikované subkutánne do štyroch týždňov starých samcov nahých myší, a tvorba nádorov bol sledovaný. Tumory rástli pomalšie v SGC-7901 /RV-MIR-24 skupine ako tí v SGC-7901 /RV-MIR-kontrolnej skupine (obrázok 5A). Priemerný objem nádoru u myší inokulovaných SGC-7901 /RV-MIR-24 buniek v deň 28 bola podstatne menšia v porovnaní s myšou inokulovaných SGC-7901 /RV-MIR-kontrolný bunky (397.45 ± 93,07 mm 3 vs. 1083.56 ± 101,56 mm 3, v danom poradí) (obrázok 5B a C, P menšie ako 0,05). Obrázok 5 MIR-24 inhibuje proliferáciu tumorigeničnosti a in vivo. (A) Fotografie nádorov odvodených od RV-MIR-24 alebo RV-MIR-kontrolných buniek u holých myší. (B), kinetika rastu nádorov u nahých myší. Priemery nádorov boli merané každých 7 dní. Objem nahých myší indikované barov, S.D. (* P menšie ako 0,05). (C) Priemerná hmotnosť nádorov u nahých myší. Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (* P menšie ako 0,05). (D) Reprezentatívne fotografií imunohistochemické analýzy Ki-67 antigénu v nádorov u nahých myší (pôvodné zväčšenie, 200 x). (E) Zástupca proliferačnej index nádorov v RV-MIR-24 a RV-MIR-kontrolných nahých myší. Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (** P menšie ako 0,05). (F) Hladiny expresie RegIV v nádorovom tkanive u nahých myší. Údaje sú uvedené ako priemer ± štandardná odchýlka (* P menšie ako 0,05). (G) Hladiny expresie RegIV mRNA v nádorovom tkanive u nahých myší (P 0,05). Dáta sú uvedené ako stredná hodnota ± S.D. z troch nezávislých experimentov.
Pre posúdenie, či inhibícia rastu nádoru v SGC-7901 /RV-MIR-24 buniek bolo čiastočne kvôli potlačenie proliferácie, imunohistochemické analýzy nádorových tkanív boli vykonané. Ako je znázornené farbenie antigén Ki-67 sa znížil rast nádoru u myší s injekciou SGC-7901 /RV-MIR-24 buniek môže byť čiastočne z dôvodu nižšieho proliferácie spôsobenú nadmernou expresiou MIR-24. Percento Ki-67-antigén-pozitívnych buniek bola nižšia v nádoru odvodeného od SGC-7901 /RV-MIR-24 buniek, ako je nádor odvodený z SGC-7901 /RV-MIR-kontrolných bunkách (37,1% ± 3,6% vs. . 79,5% ± 5,2%, v uvedenom poradí) (obrázok 5D a E; P < 0,01). Hladina expresie RegIV, ako je stanovené pomocou ELISA bola nižšia v nádore odvodeného z buniek nadmernou expresiou MIR-24, ako je nádor odvodený z kontrolných buniek (1,77 ± 0,15 ng /ml v SGC-7901 /RV-MIR-24 vs 3,13 ± 0,25 ng /ml v SGC-7901 /RV-MIR-kontrola) (obrázok 5F, P menšie ako 0,05). Avšak, neexistuje žiadny štatisticky významný rozdiel v relatívnej expresiu RegIV mRNA (obr 5G). Preto je karcinogenity SGC-7901 /RV-MIR-24 bunky sa významne znížili in vivo
.
Diskusia
Hromadí sa dôkazy podporila dôležitú úlohu pre miRNA, ktoré pôsobia buď ako nádorové supresormi a onkogény, v GC [21 až 23]. Okrem toho, mnoho miRNA bolo preukázané, že vykazujú terapeutický potenciál. Z hľadiska svojej funkcie ako master regulátory genómu a nový mechanizmus účinku, miRNA sú považované za sľubná technológia pre terapeutické vývoj [24]. MIR-26a má antitumorigenic vlastnosti a potenciálne terapeutické využitie pri liečbe rakoviny pečene in vitro a in vivo
, a bola spojená s rýchlou a trvalou inhibíciu proliferácie nádorových buniek a vysoko špecifické indukciu smrti nádorovej bunky [25]. Konkrétny mechanizmus rolí dysregulovaný miRNA v žalúdočnej karcinogenéze zostáva nejasná.
V tejto štúdii sme preukázali inhibičný účinky Mir-24 na nádorových metastáz pri klinickej, bunkovej a molekulárnej úrovni a v experimentálnom zvieracom modeli. Poskytli sme podrobný mechanický experimentálny dôkaz pre úlohu Mir-24 v GC potlačením expresie RegIV. Štúdie ukázali, že mier-24 môže pôsobiť ako onkogén v malígnych výpotkov [26], perorálne karcinóm [27, 28], rakoviny prostaty [3] a karcinómu pľúc [29, 30], ale môže pôsobiť ako nádorový supresor v rakovine hrubého čreva [ ,,,0],19] a retinoblastóm nádory [31]. Lal A. et al. zistené, že mier-24 inhiboval proliferáciu buniek a progresie bunkového cyklu potlačením expresie E2F2, MYC a ďalších regulačných génov bunkového cyklu väzbou na "bez jadier" prvky 3'UTR miRNA rozpoznávacie [20]. Wu J et al. uvádzajú, že transfekcia MIR-24 do GC buniek znižuje expresiu proteínu AE1, čo malo za následok inhibíciu proliferácie buniek [32]. Avšak, kompletné podkladové mechanizmy pre Mir-24 v GC sú stále ešte nie je jasné.
Naša správa identifikovaná MIR-24 ako kandidát nádorový supresor v GC. Zistili sme, down-reguláciu expresie MIR-24, a to ako v GC tkanivách a bunkových líniách. Nadmerná expresia Mir-24 v SGC-7901 GC buniek výrazne znižuje proliferáciu a invázie in vitro a in vivo
, odhaľovať potenciálny terapeutický účinok Mir-24 v GC. Opačný výsledok bol získaný, keď je expresia MIR-24 bola inhibovaná anti-MIR-24. Dohromady tieto výsledky naznačujú, že mier-24 môže fungovať ako nádorový supresor v ľudskej GC.
Mierna viazať zdokonaliť alebo nedokonalé komplementárnu "semeno" sekvencie v cieľovej mRNA, čo vedie ku štiepenie cieľovej mRNA alebo inhibícia ich preklade [33] , V tejto štúdii sme zistili RegIV ako cieľový gén MIR-24. MIR-24 viazaný s neúplným komplementarity na RegIV mRNA, čo vedie k priamemu translačný inhibíciu RegIV mRNA, ale nemajú žiadny vplyv na celkovú stabilitu mRNA. Vzhľadom k tomu, rôznych akčných spôsobov miRNA, MIR-24 neovplyvňuje hladinu mRNA RegIV ale translačný inhibíciu. RegIV je členom Reg génové rodiny človeka, ktorý zdieľa sekvenčná podobnosť s sacharidov väzbovou doménu C-typu lektínov, a bol prvýkrát izolovaný a charakterizovaný v ľudských zápalových črevných ochorení [34]. RegIV je jeden typ vylučovaných proteínov, a hrá biologickú úlohu v závislosti na extracelulárnej vylučovaných proteínov, aby sme sa ELISA ako výhodného spôsobu detekcie. Western blot bol vykonaný tiež pre overenie hladiny proteínu RegIV, a získali sme podobné výsledky. Predchádzajúce štúdie uvádzajú, že gén RegIV bol často nadmerne vystavený pre GC a je potenciálne podieľa na inváziu, metastázy a karcinogenézy GC. RegIV expresia bola úzko obmedzená noncancerous tkanivách [35, 36]. RegIV výraz bol výrazne vyšší u pacientov s peritoneálnej metastázami v porovnaní s pacientmi bez peritoneálnej metastáz. RegIV môže urýchliť peritoneálnej metastázy v GC a úrovne v lavážnej kvapalín môže slúžiť ako dobrý marker pre peritoneálnej metastázy [37-39]. RegIV môže slúžiť ako biomarker v sére u pacientov GC a inhibuje 5-FU-indukovanej apoptózy indukciou Bcl-2 a dihydropyrimidíndehydrogenázy [40].
V tejto štúdii sme identifikovali MIR-24 ako potenciálny proti prúdu regulátor RegIV. Po prvé, zvýšená expresia MIR-24 znížil aktivitu Luciferase reportérovým génom, ktorý obsahuje 3 'UTR RegIV, zatiaľ čo mutácie z "oblasti nukleace" miest v 3' UTR RegIV zrušil regulačný účinok MIR-24. Opačný výsledok bol dosiahnutý, keď bol použitý anti-MIR-24. Po druhé, ľudské tkanivá GC vyjadrené podstatne nižšie hladiny MIR-24, ako normálnom tkanive, zatiaľ čo GC tkanivá obsahujú významne vyššie hladiny RegIV bielkovín, než normálnom tkanive. Po tretie, zvýšená expresia MIR-24 downregulated RegIV na úrovni proteínu, zatiaľ čo zníženie expresie MIR-24 zvýšená hladina RegIV proteínu. Po štvrté, zvýšená expresia MIR-24 bola významne súvisí s proliferáciou a metastáz, čo ukazuje funkčné prekrývanie s RegIV. Všetky tieto výsledky ukazujú, že RegIV môže byť priamym cieľový gén Mir-24 v GC.
Karcinogenéza je séria po sebe idúcich udalostí, vrátane oddelenia, migrácia, miestne invázie, angiogenézy, intravasation, prežitie v obehovom systéme, extravazácia a opätovný rast v rôznych orgánoch [41, 42]. Tu sme ukázali, že mier-24 by mohla upravovať karcinogenéze GC vďaka plynulo množenia sa, migrácie a lokálne inváziu. Okrem toho, naše dôkazy naznačujú možnosť MIR-24 ako terapeutický cieľ v GC. Sú potrebné ďalšie štúdie, aby plne pochopiť detailné mechanizmy Mir-24 v GC karcinogenéze a ako potenciálny terapeutický prístup.
Metódy
etické oznámení
písomný informovaný súhlas boli zozbierané od všetkých účastníkov, a Protokol štúdie bol schválený etickou komisiou Ruijin nemocnice, Šanghaj Jiaotong University School of Medicine. Všetky pokusy myši boli schválené starostlivosť o zvieratá (povolenieÉ20810) a použite výboru a ktorá sa uskutočňuje v súlade s oficiálnymi odporúčaniami starostlivosť a používanie laboratórnych zvierat v Ruijin nemocnice, Šanghaj Jiaotong University School of Medicine.
Bunkové línie
GC ľudské bunkové línie SNU-1, SNU-16, NCI-N87, a KATO III boli získané od American Type Culture Collection (ATCC). Tieto bunkové línie SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, a AGS boli zakúpené od Shanghai inštitútov pre biologických vied, čínskej akadémie vied. Imortalizovaná Normálny žalúdočnej sliznice epitelu bunkové línie (GES-1) bol dar od Prof. Feng Bi (Huaxi Medical University, Chengdu v provincii Sichuan, PR Čína). Embryonálne obličkové bunkové línie 293 T bola zachovaná v našom laboratóriu a udržiavané v Dulbeccova modifikovanom Eaglovho média (DMEM) s 10% fetálnym hovädzím sérom (FBS) pri 37 ° C vo vlhkej atmosfére s 5% CO 2. Všetky GC bunky boli kultivované v médiu RPMI 1640 doplnenom 10% FBS vlhké s inkubátora s 5% CO 2 pri teplote 37 ° C. Vzorky tkaniva
primárnej tkaniva s nádorovým ochorením a párové priľahlé non-nádorového tkaniva boli zhromaždené od pacientov s GC radikálnej gastrektómii na oddelení chirurgie, nemocnice Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. Priľahlé normálne tkanivá boli získané v priebehu 5 cm od primárneho karcinómu. Vzorky tkaniva boli okamžite snap-zmrazí v kvapalnom dusíku a skladované v chladničke pri teplote -80 ° C. Tkanivá pre imunohistochémia boli fixované v 4% paraformaldehydu a parafínových. Klinicko-patologické údaje boli preskúmané a klasifikácia TNM staging bol založený na kritériách spoločného výboru amerického rakoviny (AJCC, 6. vydanie). Všetky vzorky boli overené patologickým vyšetrením. Izolácia RNA a
QRT-PCR
Celková RNA bola izolovaná zo vzoriek tkanív a bunkových línií za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) podľa inštrukcií výrobcu. Hladiny expresie miRNA boli hodnotené pomocou Hairpin-itTM miRNA qPCR Kvantitatívne Kit (GenePharma, Shanghai, PR Čína) po protokolu výrobcu. U6 snrna (RNU6B; GenePharma) bol použitý pre normalizáciu. Relatívna expresia pomer Mir-24 v každej párové nádorové a nenádorové tkanivo bola vypočítaná za použitia 2 -ΔΔCT metódy. Hladina expresie MIR-24 bola definovaná ako up-regulovaná, keď je relatívny pomer výraz bol > 1, a sú definované ako downregulated, keď je relatívny pomer expresia bola menej ako 1. z troch nezávislých experimentov. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Žalúdočné proti post-pyloric kŕmenie: systematický prehľad
• Užitočnosť intranazálne ketamínu a midazolamu vykonať žalúdočné aspirates u detí s dvojito zaslepenej, placebom kontrolovanej, randomizovanej štúdii