Soppressore del tumore miR-24 trattiene la progressione del cancro gastrico downregulating RegIV

Soppressore del tumore miR-24 trattiene la progressione del cancro gastrico downregulating RegIV
Abstract
sfondo
microRNA sono piccoli RNA non codificanti che modulano una varietà di processi cellulari, regolando bersagli multipli, che possono promuovere o inibire lo sviluppo di comportamenti maligni . Accumulando prove suggeriscono miR-24 svolge un ruolo importante nella carcinogenesi umana. Tuttavia, il suo preciso ruolo biologico rimane in gran parte sfuggente. Questo studio ha esaminato il ruolo di miR-24 nel carcinoma gastrico (GC).
Metodi
L'espressione del miR-24 nei tessuti GC rispetto ai tessuti non tumorali e cellule abbinati GC è stato rilevato dal qRT-PCR. Sintetico brevi oligonucleotidi RNA bloccati singole o doppie e vettori lentivirali sono stati utilizzati per regolare miR-24 nelle cellule GC per indagare la sua funzione in vitro e in vivo

. Risultati
miR-24 era significativamente downregulated nei tessuti GC rispetto ai tessuti non tumorali abbinati ed è stato associato con la differenziazione del tumore. espressione ectopica di miR-24 in cellule GC SGC-7901 ha soppresso la proliferazione cellulare, la migrazione e l'invasione in vitro
così come tumorigenicità in vivo
inducendo arresto del ciclo cellulare in fase G0 /G1 e promuovendo l'apoptosi cellulare. Inoltre, abbiamo identificato RegIV come bersaglio di miR-24 e ha dimostrato che miR-24 regolate espressione RegIV via vincolante la sua regione non tradotta 3 '.
Conclusioni
miR-24 funziona come un soppressore del tumore romanzo in GC e anti attività -oncogenic può comportare la sua inibizione della RegIV gene bersaglio. Questi risultati suggeriscono la possibilità di miR-24 come un obiettivo terapeutico in GC.
Parole
miR-24 RegIV cancro gastrico proliferazione Invasion Metastasi Sfondo
cancro gastrico (GC) è uno dei tumori umani più comuni. Anche se l'incidenza e la mortalità sono diminuiti in tutto il mondo negli ultimi 20 anni, GC si classifica ancora come la quarta più comune e il secondo tumore più letale di tutto il mondo [1]. Anche se la ricerca in CG ha fatto grandi progressi, i meccanismi molecolari alla base GC ancora non sono stati completamente chiariti.
I microRNA (miRNA) sono piccole non codificanti, molecole a doppio filamento di RNA in grado di modulare l'espressione di geni bersaglio influenzando il post I processi di trascrizione che regolano l'espressione genica. miRNA riconoscono mRNA bersaglio sulla base completa o incompleta complementarietà sequenza e impediscono la produzione di proteine ​​legandosi alla regione 3 'non tradotta (UTR) o la griglia di lettura aperta (ORF) di mRNA [2, 3]. miRNA hanno dimostrato di funzionare in processi di proliferazione e differenziazione cellulare, compresa la transizione epitelio-mesenchimale [4] e endodermico la differenziazione delle cellule staminali embrionali umane [5]. Oltre alle funzioni cellulari generali di miRNA, queste molecole svolgono anche un ruolo importante in una varietà di malattie umane. Diversi studi hanno dimostrato che la misregulation di miRNA è correlata con il cancro [6, 7], in cui operano sia come oncogeni o soppressori tumorali. miRNA sono stati segnalati per essere coinvolti nella leucemia mieloide acuta, il cancro al seno, non a piccole cellule di carcinoma del polmone, carcinoma epatocellulare, cancro del colon, GC e di altri tumori [8-13]. Sovraespressione o down-regulation dei miRNA porta alla diversificazione delle espressione della proteina, contribuendo così alla tumorigenesi modulando la proliferazione, l'angiogenesi e l'invasione. Ricercatori hanno scoperto che i profili di espressione dei miRNA possono essere utilizzati per classificare i tumori umani, e questo risultato è stato prima l'uso di profili di RNA messaggero per la classificazione dei tumori scarsamente differenziati [14, 15]. Espressione
aberrante di miRNA specifici in GC è stato riportato in precedenza ed è stata correlata con la progressione e la prognosi di GC [16-18]. Abbiamo già scoperto che miR-24, che può servire come un soppressore del tumore attraverso un sito di destinazione polimorfismo [19], è stato un miRNA significativamente downregulated nelle cellule e nei tessuti GC rispetto ai tessuti non tumorali. In questo studio, abbiamo analizzato miR-24 livelli di espressione nei tessuti GC rispetto ai tessuti non tumorali abbinati, e valutato le correlazioni tra miR-24 livelli e parametri clinico-patologici. Abbiamo valutato l'influenza della sovraespressione di miR-24 sulla crescita ed apoptosi delle cellule SGC-7901 GC sia in vitro che in vivo
e
. Abbiamo inoltre determinato l'effetto biologico di down-regulation di miR-24 espressione sulle cellule GC. Inoltre, abbiamo identificato RegIV (rigenerante famiglia isolotto di derivazione, membro 4) come uno dei geni bersaglio di miR-24. Noi ipotizziamo che miR-24 in grado di regolare l'invasione e metastasi delle cellule GC di mira direttamente il gene RegIV.
Risultati
sovraespressione di miR-24 inibisce la proliferazione delle cellule GC
Per esplorare l'espressione di miR-24 in GC, quantitativa real-time RT-PCR (qRT-PCR) è stata eseguita. L'espressione di miR-24 è stato generalmente downregulated in nove linee di cellule GC rispetto alle normali mucosa gastrica GES-1 di cellule epiteliali immortalato (Figura 1A). L'espressione di miR-24 è stato esaminato ulteriormente con qRT-PCR nei tessuti tumorali e abbinati tessuti non tumorali da 63 pazienti CG (Figura 1B). Il livello medio di espressione di miR-24 era significativamente downregulated nei tessuti tumorali rispetto ai tessuti non tumorali abbinati (Figura 1C). Insieme, questi risultati fornirono una prova evidente che miR-24 era significativamente downregulated in GC. Figura 1 miR-24 è significativamente downregulated in GC e inibito la crescita delle cellule SGC-7901. (A) L'espressione relativa di miR-24 in nove linee di cellule GC rispetto ai GES-1 determinati da qRT-PCR di tre esperimenti indipendenti (** p < 0,01, *** P < 0,001). (B) L'espressione relativa di miR-24 in campioni chirurgici di 63 GC determinato da qRT-PCR. Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in triplicato. I dati sono mostrati come valori -ΔΔCT, S.D. non mostrato. (C) La media e la deviazione standard di miR-24 livelli di espressione nei campioni chirurgici di 63 tessuti GC e tessuti non tumorali abbinati sono mostrati. I dati sono presentati come valori 2-ΔCT (** P < 0,05). U6 snRNA è stato utilizzato per la normalizzazione. (D) miR-24 ha inibito la crescita delle cellule SGC-7901, come rilevato dal WST, mentre anti-miR-24 è aumentata la crescita cellulare (* P < 0,05). I dati sono mostrati come media ± S.D. di tre esperimenti indipendenti.
Abbiamo poi esaminato le correlazioni tra livello di espressione di miR-24 e fattori clinico-patologici in GC umana. Le caratteristiche cliniche e patologiche di 63 pazienti GC sono riportati nella Tabella 1. Sulla base relativi rapporti di espressione di miR-24 /U6 = 1, i casi sono stati divisi in due gruppi: il gruppo ad alta espressione di miR-24 (n = 29) e il gruppo a basso espressione di miR-24 (n = 34). Il gruppo a basso espressione di miR-24 esposto significativamente più bassa differenziazione del tumore (P = 0,021). Tuttavia, il livello di espressione di miR-24 non ha mostrato alcuna relazione con l'età, il sesso, sede del tumore, la profondità di invasione locale, metastasi linfonodali, o TNM stage.Table 1 Relazione tra miR-24 livelli di espressione e variabili clinico-patologici in 63 GC
pazienti parametri clinico-patologiche
miR-24 espressione
valore P
alto (n = 29)
basso (n = 34)

Sesso
Maschio
17
21
0,799
femminile
12
13
Età (anni)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
localizzazione del tumore
distale terzo
8 Pagina 8
0,310
Medio terzo
6
13
prossimale terzo
15
13
classificazione WHO
Adenocarcinoma
25
28
0,155 carcinoma
anello con castone
1 5
mucinoso adenocarcinoma 3
1
Differenziazione
Beh, moderatamente
15
8
0.021
scarsamente
14
26
Borrmann classificazione
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
invasione locale
T1 /T2
1 7
0,098
T3 /T4
28
27
metastasi linfonodali
No
6 4
0,535
Sì
23
30
Distant metastasi
No
28
31
0,724
Si
1 3
stadio TNM
I /II Pagina 7 Pagina 8
0,955
III /IV
22
26
Per indagare la funzione biologica di miR-24 in sviluppo e nella progressione di GC, abbiamo trasfettato cellule SGC-7901 con miR-24 imita (SGC-7901 /miR-24) o miR-24 inibitore (SGC-7901 /anti-miR-24). Come mostrato nel file aggiuntive 1: Figura S1A e S1B, abbiamo selezionato 100 nm come la concentrazione adatta in esperimenti successivi. espressione ectopica di miR-24 in cellule SGC-7901 è stata confermata da qRT-PCR. Successivamente, abbiamo esaminato la proliferazione cellulare mediante test WST. Sovraespressione di miR-24 ha inibito il tasso di crescita della SGC-7901 cellule rispetto alle cellule trasfettate miR-controllo (p < 0,05), mentre anti-miR-24 è aumentata attività di crescita delle cellule (P < 0,05, Figura 1D).
sovraespressione di miR-24 inibisce la migrazione e l'invasione delle cellule GC
Successivamente abbiamo valutato l'effetto di miR-24 in materia di migrazione cellulare e dell'invasione in GC. la migrazione delle cellule e saggi di invasione hanno dimostrato che l'iperespressione di miR-24 soppressa la migrazione delle cellule (SGC-7901 /miR-24 di gruppo, 63,0 ± 3,6 cellule per campo; gruppo di controllo, 126,3 ± 7,0 cellule per campo; P < 0,05) e l'invasione ( SGC-7901 /miR-24 di gruppo, 34,7 ± 2,1 cellule per campo; gruppo di controllo, 63,7 ± 3,5 cellule per campo; P < 0,05) (Figura 2A, B). Al contrario, l'abbattimento di miR-24 aumentato significativamente la migrazione delle cellule (SGC-7901 /Anti miR-24-gruppo, 182,3 ± 5,0 cellule per campo; gruppo di controllo, 105,3 ± 3,8 cellule per campo; P < 0,01) e l'invasione (SGC -7901 /gruppo anti-miR-24, 124,3 ± 3,8 cellule per campo; gruppo di controllo, 62,7 ± 2,5 per settore; P < 0,01) (Figura 2A, C). Figura 2 miR-24 migrazione inibito e l'invasione delle cellule SGC-7901. (A) Campi rappresentativi di cellule SGC-7901 nei test Transwell. (B, C) campi rappresentativi di cellule SGC-7901 nei test di migrazione e l'invasione, rispettivamente. numero medio di cellule migrazione e l'invasione per campo da tre esperimenti indipendenti (* P < 0.05, ** p < 0,01).
sovraespressione di miR-24 promuove l'apoptosi delle cellule GC e induce arresto del ciclo cellulare in G0 /fase G1
Dato che osserva la crescita cellulare può essere influenzato dai tassi di apoptosi e la progressione del ciclo cellulare, abbiamo esaminato gli effetti di miR-24 in apoptosi e ciclo cellulare in vivo
mediante citometria di flusso. Abbiamo scoperto che circa il 12-15% della SGC-7901 /miR-24 cellule esposte caratteristiche morfologiche tipiche dell'apoptosi, tra cui cromatina condensata e la frammentazione nucleare Hoechst33342 colorazione per contenuto di DNA. Al contrario, dopo la contabilità per la rara apoptosi spontanea nelle cellule SGC-7901, la SGC-7901 /anti-miR-24 del gruppo non ha mostrato alcun cambiamento significativo di Hoechst33342 colorazione (Figura 3A). Citometria a flusso ha mostrato che il tasso di apoptosi è risultato significativamente aumentato nel SGC-7901 /miR-24 celle rispetto alle cellule di controllo (13,62% ± 1,25% rispetto al 6,15% ± 0,95%, rispettivamente; P < 0,01), e significativamente diminuita in SGC -7901 /anti-miR-24 rispetto ai controlli (3,92% ± 0,52% vs. 6,35% ± 0,83%, rispettivamente; P < 0,05). (Figura 3B, D)
Per chiarire ulteriormente il meccanismo di specchietto inibizione della crescita 24-mediata delle cellule GC, analisi del ciclo cellulare è stato eseguito (Figura 3C, E). Su upregulation di miR-24, la percentuale di cellule in fase G0 /G1 aumentata dal 40.51% ± 3,15% nei controlli al 72.24% ± 3,65% (P < 0.01), mentre knockdown miR-24 ha ridotto la percentuale di cellule in G0 /fase G1 dal 42.35% ± 2,78% nei controlli al 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Figura 3 miR-24 indotta l'apoptosi delle cellule e G0 /G1 arresto del ciclo cellulare. (A) istogrammi rappresentativi che descrivono la morfologia nucleare di cellule SGC-7901 transitoriamente trasfettate con 100 Nm di miR-24 imita o inibitore e dei loro rispettivi controlli (Hoechst33342 colorazione, originale ingrandimento 400 ×). (B) istogrammi rappresentativi che descrivono l'apoptosi delle cellule SGC-7901 transitoriamente trasfettate con 100 Nm di miR-24 imita o inibitori ed i loro rispettivi controlli. (C) istogrammi rappresentativi che descrivono il ciclo cellulare delle cellule SGC-7901 transitoriamente trasfettate con 100 Nm di miR-24 imita o inibitore ed i loro rispettivi controlli. (D, E) La percentuale di cellule apoptotiche e G0 di fase /G1 di tre esperimenti indipendenti, media ± S.D. (* P < 0.05, ** P < 0,01).
RegIV è un gene bersaglio di miR-24
Per esaminare più da vicino i meccanismi di miR-24 in GC, abbiamo cercato per geni bersaglio candidato bioinformatica. TargetScan, miRBase Tatget e Starbase sono stati applicati per la ricerca di potenziali obiettivi di miR-24. Tra gli obiettivi previsti, RegIV è stato identificato come uno dei geni bersaglio di miR-24, e abbiamo identificato un potenziale miR-24 sito di legame nel suo 3'UTR (Figura 4A). Successivamente, abbiamo esaminato l'espressione di RegIV in nove cellule di GC e GES-1. Abbiamo scoperto che RegIV è stato overexpressed in nove cellule GC rispetto ai GES-1, ed esposto un modello di espressione inversa rispetto al miR-24 (sui file 2: Figura S2A e S2B). Per verificare se il 3'UTR di RegIV mRNA era un obiettivo funzionale di miR-24, sono state eseguite le analisi del gene reporter di luciferasi. In primo luogo abbiamo valutato l'attività di miR-24 (o miR-controllo) co-trasfettato in cellule SGC-7901 con Luc-RegIV plasmide o il plasmide Luc-RegIV-mut (in cui il putativo miR-24 sito di legame è stato mutato), insieme con il plasmide pRL-TK contenente il gene luciferasi Renilla come controllo interno (Figura 4B). Cellule co-trasfettate con miR-24 hanno dimostrato una riduzione significativa dell'attività luciferasi rispetto al gruppo di controllo miR-(P < 0,05). Tuttavia, miR-24 co-trasfettate con il plasmide Luc-RegIV-mut ha mostrato alcuna differenza significativa nell'attività giornalista rispetto alle cellule co-trasfettate con miR-controllo. Allo stesso modo, anti-miR-24 aumentato l'attività della luciferasi di wild-type-Luc RegIV, ma non ha avuto effetto sul plasmide Luc-RegIV-mut (Figura 4C; P < 0,05). Abbiamo anche effettuato test gene reporter di luciferasi in SNU-16 per ridurre al minimo l'influenza di endogena miR-24. In un primo momento, l'espressione ectopica di miR-24 in SNU-16 celle è stata confermata da qRT-PCR. L'espressione di miR-24 trasfettate con miR-24 imita era di circa 50 volte superiore a quella del gruppo di miR-controllo SNU-16 (P < 0,01), mentre nessuna differenza statistica con la trasfezione di miR-24 anti-(sui file 3: Figura S3A). Le cellule co-trasfettate con miR-24 hanno dimostrato una significativa diminuzione dell'attività della luciferasi rispetto al gruppo di miR-controllo (p < 0,001), mentre nessuna differenza statistica con l'anti miR-24-trasfezione (sui file 3: Figura S3B e S3C) . Questi risultati hanno indicato con forza che la 3'UTR di RegIV contiene siti di legame diretto di miR-24. Figura 4 miR-24 di mira il 3'UTR del gene RegIV e immunocolorazione di RegIV nei tessuti gastrici. (A) grafico schematica delle putativi siti di legame di miR-24 nella RegIV 3'UTR. RegIV-mut indica la RegIV-3'UTR con mutazione in miR-24-siti di legame. (B) miR-24 imita l'attività di un reporter luciferasi contenente wild-type RegIV 3'UTR diminuito l'(* P < 0,05), ma non il giornalista con mutante RegIV 3'UTR. (C) anti-miR-24 aumentato l'attività della luciferasi di wild-type Luc-RegIV (* P < 0,05), ma non ha avuto effetto sul mutante. (D) Quarantotto ore dopo il miR-24 mimica e il controllo trasfezione di cellule SGC-7901, il livello della proteina di RegIV era significativamente diminuito rispetto al miR-controllo, come determinato da ELISA. Anti-miR-24 aumentato l'espressione di RegIV rispetto anti-miR-controllo (* P < 0.05, ** P < 0.01). (E) Ventiquattro ore dopo il miR-24 mimica o inibitore e la rispettiva trasfezione di controllo nelle cellule SGC-7901, non vi era alcuna differenza nel livello di mRNA di RegIV rispetto al miR-controllo, come determinato da qRT-PCR (P >0,05). I dati sono mostrati come media ± S.D. di tre esperimenti indipendenti. (F) Nessuna espressione di RegIV è stata rilevata nel normale mucosa gastrica. (G) RegIV era espresso in metaplasia intestinale dello stomaco. (H) forte espressione di RegIV è stata osservata nel carcinoma a cellule ad anello con castone gastrico.
Successivo abbiamo esaminato miR-24 regolazione del RegIV mRNA e livelli di proteine ​​nelle cellule trasfettate SGC-7901. analisi ELISA ha mostrato che i livelli di proteina RegIV sono stati notevolmente soppressi in SGC-7901 /miR-24 celle, mentre i livelli di proteina RegIV sono stati upregulated in SGC-7901 /anti-miR-24-cellule (Figura 4D; * P < 0.05, ** P < 0.01). qRT-PCR indicato alcuna differenza nel livello di mRNA RegIV in tutte le cellule trasfettate (Figura 4E; P > 0,05). Nel frattempo, abbiamo rilevato l'espressione di c-Myc in cellule di GC come controllo positivo trasfettate con miR-24 [20]. Abbiamo scoperto che miR-24 downregulated RegIV e c-Myc (sui file 4: Figura S4A e S4B).
Studi precedenti hanno dimostrato che RegIV è stato associato con la proliferazione e le metastasi del GC. Abbiamo poi usato analisi immunoistochimica per valutare l'espressione di RegIV in GC. I nostri risultati hanno confermato la sovraespressione di RegIV in GC. Il livello di proteine ​​di RegIV nel normale mucosa gastrica è stato inferiore metaplasia intestinale dello stomaco e del carcinoma a cellule ad anello con castone gastrica (Figura 4F-H). Per valutare la rilevanza clinica di questi risultati, abbiamo esaminato la correlazione tra le espressioni di RegIV e miR-24 nei tessuti GC. Abbiamo trovato che RegIV e miR-24 esibivano un pattern di espressione inversa nei tessuti GC (Tabella 2). Questi risultati supportano l'idea che sottoregolazione di miR-24 ha provocato un aumento dei livelli di proteina di RegIV in GC.Table 2 RegIV e miR-24 mostra inverso pattern di espressione in GC
miR-24 espressione
valore di P
basso
alta
Reg IV (IHC)
negativo 9
16
0.038 *
positivo
25
13
* P
< 0.05 è stato considerato statisticamente significativo
sovraespressione di miR-24 inibisce tumorigenicità in vivo
Dato che miR-24 ha migliorato la. la proliferazione delle cellule GC in vitro
, abbiamo esaminato se miR-24 potrebbe interessare tumorigenicità in vivo
. Retrovirus-mediata SGC-7901 /miR-24 e le linee cellulari stabili SGC-7901 /miR-controllo sono stati ottenuti come descritto nella sezione Metodi. SGC-7901 /RV-miR-24 e le cellule SGC-7901 /RV-miR-controllo sono state iniettate per via sottocutanea in quattro settimane di età topi nudi maschili, e la formazione del tumore è stata monitorata. I tumori sono cresciuti più lento nella SGC-7901 /RV-miR-24 del gruppo rispetto a quelli del gruppo SGC-7901 /RV-miR-controllo (Figura 5A). Il volume medio del tumore nei topi inoculati con SGC-7901 /RV-miR-24 celle al giorno 28 era significativamente più piccola rispetto ai topi inoculati con cellule SGC-7901 /RV-miR-controllo (397.45 ± 93,07 millimetri 3 vs. 1083.56 ± 101,56 millimetri 3, rispettivamente) (Figura 5B e C; P < 0,05). Figura 5 miR-24 ha inibito tumorigenicità e la proliferazione in vivo. (A) Fotografia di tumori derivati ​​da RV-miR-24 o RV-miR-controllo le cellule in topi nudi. cinetiche (B) crescita di tumori in topi nudi. diametri tumorali sono stati misurati ogni 7 giorni. Il volume dei topi nudi indicata dalle barre, S.D. (* P < 0,05). (C) Il peso medio dei tumori in topi nudi. I dati sono mostrati come media ± S.D. (* P < 0,05). (D) fotografie rappresentativi di analisi immunoistochimica di Ki-67 antigene nei tumori di topi nudi (ingrandimento originale, 200 ×). (E) indice di proliferazione Rappresentante dei tumori in RV-miR-24 e RV-miR-controllo topi nudi. I dati sono mostrati come media ± S.D. (** P < 0,05). (F) I livelli di espressione di RegIV nei tessuti tumorali di topi nudi. I dati sono mostrati come media ± S.D. (* P < 0,05). (G) I livelli di espressione di mRNA RegIV nei tessuti tumorali di topi nudi (p > 0,05). I dati sono mostrati come media ± S.D. di tre esperimenti indipendenti.
Per valutare se l'inibizione della crescita tumorale in SGC-7901 /RV-miR-24 celle è in parte dovuto alla soppressione della proliferazione, immunoistochimica analisi di tessuti tumorali sono state eseguite. Come mostrato con Ki-67 antigene colorazione, la crescita del tumore è diminuito nei topi iniettati con SGC-7901 /RV-miR-24 cellule può essere parzialmente a causa della minore proliferazione causata dalla sovraespressione di miR-24. La percentuale di cellule Ki-67-antigene-positivi era più bassa nel tumore derivato da SGC-7901 /RV-miR-24 cellule di tumore derivato da cellule SGC-7901 /RV-miR-controllo (37,1% ± 3,6% vs . 79,5% ± 5,2%, rispettivamente) (Figura 5D e e; P < 0.01). Il livello di espressione di RegIV come determinato da ELISA è stato inferiore nel tumore derivato da cellule che iperesprimono miR-24 che il tumore derivato da cellule di controllo (1,77 ± 0,15 ng /ml in SGC-7901 /RV-miR-24 vs. 3.13 ± 0.25 ng /ml in SGC-7901 /RV-miR-controllo) (Figura 5F; P < 0,05). Tuttavia, non vi era alcuna differenza statistica nella relativa espressione di mRNA RegIV (Figura 5G). Pertanto, l'oncogenesi della SGC-7901 /RV-miR-24 cellule sono state significativamente ridotto in vivo
.
Discussione
prove Accumulare ha sostenuto ruoli importanti per miRNA, che agiscono sia come soppressori tumorali o oncogeni, in GC [21-23]. Inoltre, molti miRNA hanno dimostrato di esibire potenziale terapeutico. A causa della loro funzione di maestri regolatori del genoma e nuovo meccanismo d'azione, miRNA sono considerati una tecnologia promettente per lo sviluppo terapeutico [24]. miR-26a ha proprietà antitumorigenic e potenziale utilità terapeutica per il cancro al fegato in vitro e in vivo

, ed è stato associato con l'inibizione rapida e sostenuta della proliferazione delle cellule tumorali e l'induzione altamente specifico della morte delle cellule tumorali [25]. Il meccanismo specifico dei ruoli dei miRNA sregolati nella carcinogenesi gastrica rimane elusiva.
In questo studio, abbiamo dimostrato gli effetti inibitori di miR-24 in metastasi tumorali a livello clinico, cellulare e molecolare e in un modello animale sperimentale. Abbiamo fornito dettagliate evidenze sperimentali meccanicistica per il ruolo di miR-24 in GC sopprimendo l'espressione di RegIV. Gli studi hanno dimostrato che miR-24 può agire come oncogene in effusioni maligne [26], il carcinoma orale [27, 28], il cancro alla prostata [3] e il cancro ai polmoni [29, 30], ma può agire come un soppressore del tumore nel colon cancro [ ,,,0],19] e tumori retinoblastoma [31]. Lal A et al. scoperto che miR-24 proliferazione cellulare inibita e progressione del ciclo cellulare sopprimendo l'espressione di E2F2, MYC e altri geni regolatori del ciclo cellulare legandosi ad elementi di riconoscimento 3'UTR miRNA "senza semi" [20]. Wu J et al. ha riferito che trasfezione di miR-24 in cellule di GC ha ridotto l'espressione della proteina AE1, che ha portato a inibire la proliferazione cellulare [32]. Tuttavia, i meccanismi alla base complete per miR-24 in GC non sono ancora chiare.
Il nostro rapporto ha identificato miR-24 come un soppressore del tumore candidato in GC. Abbiamo trovato down-regulation di espressione di miR-24, sia nei tessuti GC e linee cellulari. Sovraespressione di miR-24 in SGC-7901 cellule GC ha ridotto significativamente la proliferazione e l'invasione sia in vitro che in vivo
e
, rivelando il potenziale effetto terapeutico di miR-24 in GC. Il risultato opposto è stato ottenuto quando l'espressione di miR-24 è stata inibita da anti-miR-24. Insieme, questi risultati suggeriscono che miR-24 può funzionare come un soppressore del tumore in GC umana.
MiRNA legano a perfetta o imperfetta complementari sequenze "seme" di mRNA bersaglio, portando a scissione di mRNA o inibizione della loro traduzione bersaglio [33] . In questo studio, abbiamo identificato RegIV come gene bersaglio di miR-24. miR-24 legato con complementarità incompleta a RegIV mRNA, con conseguente inibizione traslazionale diretta di RegIV mRNA, ma senza alcun effetto sulla stabilità complessiva mRNA. Come le diverse modalità di azione di miRNA, miR-24 non ha influenzato il livello di mRNA del RegIV ma l'inibizione traslazionale. RegIV è un membro della famiglia Reg gene umano, che condivide similarità di sequenza con il dominio di carboidrati vincolante del tipo C lectine, e è stato isolato e caratterizzato malattia infiammatoria intestinale umana [34]. RegIV è un tipo di proteine ​​secrete, e svolge un ruolo biologico seconda delle proteine ​​secrete extracellulari, in modo che abbiamo preso ELISA come metodo di rilevamento preferito. Western Blot è stata effettuata anche per convalidare il livello della proteina di RegIV, e abbiamo ottenuto i risultati simili. Precedenti studi hanno segnalato che il gene RegIV stato spesso sovraespresso in GC ed è potenzialmente coinvolto in invasione, metastasi, e carcinogenesi di GC. espressione RegIV è stato strettamente limitato in tessuti non tumorali [35, 36]. espressione RegIV era nettamente superiore nei pazienti con metastasi peritoneale rispetto a quelli senza metastasi peritoneali. RegIV potrebbe accelerare la metastasi peritoneali in GC e livelli di liquidi di lavaggio potrebbe servire come un buon marker per le metastasi peritoneali [37-39]. RegIV può funzionare come un biomarcatore siero per pazienti GC e inibisce l'apoptosi 5-FU-indotta da induzione di Bcl-2 e diidropirimidina deidrogenasi [40].
In questo studio, abbiamo identificato miR-24 come un potenziale regolatore a monte RegIV. In primo luogo, la sovraespressione di miR-24 è diminuita l'attività di un gene reporter luciferasi contenente il 3'UTR di RegIV, mentre la mutazione dei siti "regione semi" nel 3'UTR del RegIV abolito l'effetto regolatore di miR-24. Il risultato opposto è stato ottenuto quando abbiamo usato anti-miR-24. In secondo luogo, i tessuti GC umani hanno espresso livelli significativamente più bassi di miR-24 di tessuti non tumorali, mentre i tessuti GC contengono livelli significativamente più alti di proteine ​​RegIV di tessuti non tumorali. In terzo luogo, la sovraespressione di miR-24 downregulated RegIV a livello proteico, mentre sottoregolazione di miR-24 è aumentato livello di proteine ​​RegIV. In quarto luogo, la sovraespressione di miR-24 era significativamente correlata con la proliferazione e le metastasi, che indica una sovrapposizione funzionale con RegIV. Tutti questi risultati indicano che RegIV potrebbe essere un gene bersaglio diretto di miR-24 in GC.
Carcinogenesi è una serie di eventi in sequenza, tra cui il distacco, la migrazione, invasione locale, l'angiogenesi, intravasation, la sopravvivenza nel sistema circolatorio, stravaso e ricrescita in diversi organi [41, 42]. Qui abbiamo dimostrato che miR-24 potrebbe regolare la carcinogenesi del GC attraverso la proliferazione di modulazione, la migrazione e l'invasione locale. Inoltre, la nostra evidenza suggerisce la possibilità di miR-24 come bersaglio terapeutico in GC. Sono necessari ulteriori studi per comprendere appieno i meccanismi dettagliati di miR-24 in GC cancerogenesi e come potenziale approccio terapeutico.
Metodi
dichiarazione etica
consenso informato scritto è stato raccolto da tutti i partecipanti, e protocollo di studio è stato approvato dal comitato etico di Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Tutti gli esperimenti del mouse sono stati approvati dalla cura degli animali (Permesso.120.810) e del Comitato Usa e condotte in conformità con le raccomandazioni ufficiali delle cura e l'uso animali da laboratorio di Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
Linee cellulari
Le linee di cellule umane GC SNU-1, SNU-16, NCI-N87, e Kato III sono stati acquistati da American Type Culture Collection (ATCC). Le linee di cellule SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, e AGS sono stati acquistati da Shanghai Istituti di Scienze Biologiche, Accademia Cinese delle Scienze. Il normale mucosa gastrica linea di cellule epiteliali immortalato (GES-1) è stato un dono dal Prof. Feng Bi (Huaxi Medical University, Chengdu, provincia di Sichuan, Cina). La linea di cellule embrionali renali 293 T è stato conservato nel nostro laboratorio e mantenuta in terreno Dulbecco modificato Eagle (DMEM) con il 10% di siero fetale bovino (FBS) a 37 ° C in atmosfera umidificata con 5% di CO 2. Tutte le cellule sono state coltivate GC in RPMI 1640 supplementato con 10% FBS in un incubatore umidificato con 5% di CO 2 a 37 ° C. I campioni di tessuto

tessuti tumorali primari e tessuti non tumorali adiacenti appaiati sono stati raccolti da pazienti con CG sono stati sottoposti a gastrectomia radicale presso il Dipartimento di Chirurgia, Ospedale Ruijin, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. I tessuti normali adiacenti sono stati ottenuti in 5 cm dal tumore primario. I campioni di tessuto sono stati immediatamente snap-congelati in azoto liquido e conservati in frigorifero a -80 ° C. I tessuti per immunoistochimica sono state fissate in paraformaldeide al 4% e inclusi in paraffina. dati clinico-patologici sono stati rivisti, e la classificazione stadiazione TNM è basata su criteri di Joint Committee on Cancer (AJCC, 6 ° edizione). Tutti i campioni sono stati verificati con l'esame patologico. Isolamento
RNA e qRT-PCR
RNA totale è stato isolato da campioni di tessuto e linee cellulari utilizzando il reagente Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) secondo le istruzioni del produttore. I livelli di espressione di miRNA sono stati valutati utilizzando il miRNA qPCR quantificazione Kit Hairpin-ITTM (GenePharma, Shanghai, Repubblica Popolare Cinese) seguendo il protocollo del produttore. Il U6 piccolo RNA nucleare (RNU6B; GenePharma) è stato utilizzato per la normalizzazione. Il rapporto di espressione relativa di miR-24 in ciascun tessuto tumorale e non del tumore accoppiato è stato calcolato utilizzando il 2 metodo -ΔΔCT. Il livello di espressione di miR-24 è stata definita come upregulated quando il rapporto di espressione relativa di > 1, e definito come downregulated quando il rapporto di espressione relativa di < 1. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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