Опухолевый супрессор микроРНК-24 сдерживает прогрессирование рака желудка с помощью downregulating RegIV

Опухолевый супрессор микроРНК-24 сдерживает прогрессирование рака желудка по downregulating RegIV
Аннотация
Справочная информация
микроРНК малые некодирующие РНК, которые модулируют различные клеточные процессы, регулируя несколько целей, которые могут способствовать или препятствовать развитию злокачественных поведения , Накопленные данные свидетельствуют о том микроРНК-24 играет важную роль в человеческом канцерогенеза. Тем не менее, его точная биологическая роль остается в значительной степени недостижимой. В данном исследовании изучалась роль микроРНК-24 в рак желудка (GC).
Методы
Выражение СИК-24 в тканях по сравнению GC с согласованными тканей неопухолевых и GC клеток был обнаружен QRT-PCR. Синтетические короткие одно- или двухцепочечных РНК олигонуклеотиды и лентивирусов векторы использовали для регулирования микроРНК-24 экспрессию в клетках GC исследовать свою функцию в пробирке
и в естественных условиях

. Результаты
MIR-24 был значительно подавляются в GC тканях по сравнению с согласованными тканей неопухолевых и было связано с дифференцировки опухоли. Эктопическая экспрессия микроРНК-24 в SGC-7901 GC клеток подавляется клеточную пролиферацию, миграцию и инвазию в пробирке
а также туморогенность в естественных условиях
путем индукции цикла ареста клеток в G0 /G1 фазе и продвижение апоптоз клеток. Кроме того, мы определили RegIV как мишень MIR-24 и показали, что микроРНК-24 регулируется выражение RegIV посредством связывания его 3 'нетранслируемую область.
Выводы
Mir 24-функций в качестве нового опухолевого супрессора в GC и анти -oncogenic деятельность может включать его ингибирование гена-мишени RegIV. Эти данные свидетельствуют о возможности для MIR-24 в качестве терапевтической мишени в GC.
Ключевые слова
микроРНК-24 RegIV Рак желудка пролиферации Invasion метастазирования фон
Рак желудка (GC) является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей человека. Хотя заболеваемость и смертность снизились во всем мире за последние 20 лет, по-прежнему GC занимает четвертое место наиболее распространенным и вторым самым смертельным раком во всем мире [1]. Хотя исследования в GC был достигнут значительный прогресс, молекулярные механизмы, лежащие в основе GC до сих пор полностью не выяснены.
MicroRNAs (микроРНК) небольшие некодирующие, двухцепочечной молекулы РНК, которые могут модулировать экспрессию генов-мишеней путем воздействия на пост- транскрипционные процессы, регулирующие экспрессию генов. микроРНК признают мРНК мишеней, основанные на полный или неполный комплементарности последовательности и предотвращать образование белка путем связывания с нетранслируемой области 3 '(UTR) или открытой рамки считывания (ORF) мРНК-мишени [2, 3]. микроРНК были продемонстрированы функционировать в клеточных процессах пролиферации и дифференцировки, включая эпителиально-мезенхимальных перехода [4] и энтодермальной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека [5]. В дополнение к общим клеточных функций микроРНК, эти молекулы также играют важную роль в различных заболеваний человека. Несколько исследований показали, что misregulation микроРНК связан с раком [6, 7], в котором они функционируют либо как онкогенов или супрессоров опухолей. микроРНК, как сообщается, участвовать в острой миелоидной лейкемии, рака молочной железы, немелкоклеточного рака легкого, гепатоцеллюлярной карциномы, рака толстой кишки, GC и других видов рака [8-13]. Сверхэкспрессия или деактивация микроРНК приводит к диверсификации экспрессии белка, способствуя таким онкогенеза путем модуляции пролиферации, ангиогенеза и инвазии. Исследователи обнаружили, что профили экспрессии микроРНК могут быть использованы для классификации злокачественных опухолей человека, и это открытие было до использования профилей матричную РНК для классификации плохо дифференцированных опухолей [14, 15].
Аберрантная экспрессия специфических микроРНК в GC был ранее сообщалось, и коррелирует с прогрессированием и прогноз GC [16-18]. Ранее мы обнаружили, что микроРНК-24, который может служить в качестве супрессора опухоли через целевой сайт полиморфизма [19], была значительно подавлена ​​микроРНК в GC клетках и тканях по сравнению с неопухолевых тканей. В данном исследовании мы проанализировали микроРНК-24 уровней экспрессии в тканях GC по сравнению с согласованными тканей неопухолевыми, и оценивали корреляцию между микроРНК-24 уровня и клиникопатологическими параметров. Мы оценивали влияние избыточной экспрессии микроРНК-24 на рост и апоптоз SGC-7901 GC клетки как в пробирке
и в естественных условиях
. Мы также определили биологический эффект понижающей регуляции экспрессии микроРНК-24 на GC клетках. Кроме того, мы определили RegIV (регенерирующий островок производных семьи, элемент 4) в качестве одного из целевых генов микроРНК-24. Мы предполагаем, что микроРНК-24 может регулировать инвазию и метастазирование GC клеток путем непосредственного ориентации гена RegIV.

Результаты Гиперэкспрессия MIR-24 ингибирует пролиферацию клеток GC
Для изучения экспрессии микроРНК-24 в ГХ, проводили количественную в реальном времени ОТ-ПЦР (QRT-ПЦР). Выражение MIR-24 в целом подавлена ​​в девяти GC клеточных линиях по сравнению с увековечены нормальной слизистой оболочки желудка эпителиальных клеток GES-1 (Рис. 1А) Выражение MIR-24 была рассмотрена далее с QRT-ПЦР в опухолевых тканях и соответствует неопухолевые ткани от 63 GC пациентов (рис 1В). Средний уровень экспрессии микроРНК-24 была значительно подавлена ​​в опухолевых тканях по сравнению с согласованными тканей неопухолевыми (Рисунок 1C). Вместе эти результаты убедительно показали, что микроРНК-24 была значительно подавлена ​​в GC. Рисунок 1 микроРНК-24 значительно подавлена ​​в GC и ингибирует рост SGC-7901 клеток. (A) Относительное выражение MIR-24 в девяти линий GC клеток по сравнению с GES-1 определяется QRT-PCR трех независимых экспериментов (** P ≪ 0,01, *** Р &л; 0,001). (B) Относительное выражение MIR-24 в хирургических образцах 63 ГК определяется QRT-PCR. Все эксперименты проводились в трех экземплярах. Данные представлены в виде значений -ΔΔCT, S.D. не показано. (C) Среднее значение и стандартное отклонение уровней экспрессии микроРНК-24 в хирургических образцах тканей 63 ГЦ и подобранных тканей неопухолевыми показаны. Данные представлены в виде значений 2-Δ CТ (** P &ЛТ; 0,05). U6 мяРНК использовали для нормализации. (D) микроРНК-24 ингибирует рост СГК-7901 клеток, как детектируется WST, в то время как анти-микроРНК-24 усиленный рост клеток (* P ≪ 0,05). Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. из трех независимых экспериментов.
Далее мы исследовали корреляции между уровнем экспрессии микроРНК-24 и клиникопатологическими факторов в организме человека GC. Клинические и патологические характеристики 63 пациентов GC представлены в таблице 1. На основе относительном выражении соотношения MIR-24 /U6 = 1, случаи были разделены на две группы: высокая экспрессия группы микроРНК-24 (п = 29) и микроРНК-24 с низким уровнем экспрессии группы (п = 34). С низким уровнем экспрессии группы микроРНК-24 показали значительно более низкую дифференцировку опухоли (P = 0,021). Тем не менее, уровень экспрессии микроРНК-24 не показали каких-либо отношений с возрастом, полом, опухоли, глубина локального вторжения, узла метастаза лимфатический или TNM stage.Table 1 Отношения между микроРНК-24 уровня экспрессии и клиникопатологическими переменных в 63 GC пациенты
клиникопатологическими параметры

микроРНК-24 выражение

Значение Р

High (п = 29)

Low (п = 34) <бр>
Гендерные

Male
17
21
0,799
Женский
12
13
Возраст (лет)

&л; 60
15
18
0,923
≥60
14
16
Опухоль местоположение

дистальной трети
8
8 <бр> 0.310
Средняя треть
6
13
проксимальной трети
15
13
классификации ВОЗ

Аденокарцинома
25
28 <бр> 0,155 рак
перстень клеток
1 страница 5 Mucinous аденокарциномы страница 3 1
Дифференциация

Ну, умеренно
15 <бр> 8
0,021
Плохо
14
26
Боррманна классификации

I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
Местное вторжение

T1 /T2
1
7
0,098
T3 /T4
28
27 <бр> лимфоузлов метастаз
не
нет
6 4
0,535
Да
23
30
отдаленными метастазами

Информация нет
28
31
0,724
Да
1 страница 3 этап TNM

I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
Для исследования биологической функции MIR-24 в развитии и прогрессировании ГХ, мы трансфецировали SGC-7901 клеток с микроРНК-24 имитаторов (SGC-7901 /микроРНК-24) или микроРНК-24 ингибитор (SGC-7901 /анти-микроРНК-24). Как показано в дополнительном файле 1: Рисунок S1A и S1B, мы выбрали 100 нм, соответствующей концентрации в последующих экспериментах. Эктопическая экспрессия микроРНК-24 в SGC-7901 клеток была подтверждена QRT-PCR. Далее, мы исследовали пролиферацию клеток путем WST анализа. Избыточная экспрессия микроРНК-24 ингибирует скорость роста SGC-7901 клеток по сравнению с микроРНК-контрольными трансфицированных клеток (P &ЛТ; 0,05), в то время как анти-микроРНК-24 увеличилась деятельность клеточного роста (P &л; 0,05, рис 1D).
Гиперэкспрессия MIR-24 ингибирует миграцию и инвазию клеток GC
Далее мы оценивали влияние MIR-24 по вопросам миграции клеток и вторжения в GC. Миграция клеток и инвазии анализы показали, что избыточная экспрессия микроРНК-24 подавляется миграция клеток (SGC-7901 /MIR-24 группа, 63,0 ± 3,6 клеток на поле; контрольная группа, 126,3 ± 7,0 клеток на поле; P &л; 0,05) и инвазии ( СГК-7901 /микроРНК-24 группа, 34,7 ± 2,1 клеток на поле; контрольная группа, 63,7 ± 3,5 клеток на поле, P ≪ 0,05) (фиг.2А, в). В противоположность этому, нокдаун MIR-24 значительно повышенной миграции клеток (SGC-7901 /анти-микроРНК-24 группа, 182,3 ± 5,0 клеток на поле; контрольная группа, 105,3 ± 3,8 клеток на поле; P ≪ 0,01) и инвазии (SGC -7901 /анти-микроРНК-24 группа, 124,3 ± 3,8 клеток на поле; контрольная группа, 62,7 ± 2,5 поля; Р &л; 0,01) (рис 2А, в). Рисунок 2 микроРНК-24 тормозится миграция и вторжение SGC-7901 клеток. (A) Типичные поля СГК-7901 клеток в Transwell анализах. (B, C) Типичные поля SGC-7901 клеток в миграции и инвазии анализов, соответственно. Среднее количество миграции и инвазии клеток на поле из трех независимых экспериментов (* Р &л; 0,05, ** Р &л; 0,01).
Оверэкспрессия MIR-24 способствует апоптозу GC клеток и индуцирует остановку клеточного цикла в G0 /G1 фазы
Учитывая, что наблюдается рост клеток может зависеть от темпов апоптоза и клеточного цикла, мы исследовали влияние MIR-24 на апоптоз и клеточный цикл в естественных условиях
с помощью проточной цитометрии. Мы обнаружили, что примерно 12-15% от SGC-7901 /микроРНК-24 клетки экспонируются морфологические черты, характерные для апоптоза, в том числе конденсированного хроматина и ядерной фрагментации путем Hoechst33342 окрашивания для содержания ДНК. В отличие от этого, после учета редкого спонтанного апоптоза в SGC-7901 клетках, КЗВ-7901 /анти-микроРНК-24 группа не показала каких-либо существенных изменений от Hoechst33342 окрашивания (рис 3А). Проточная цитометрия показала, что апоптическая скорость была значительно увеличена в SGC-7901 /микроРНК-24 клеток по сравнению с контрольными клетками (13,62% ± 1,25% против 6,15% ± 0,95% соответственно; P &лт; 0,01), а также значительно уменьшились в ГЭК -7901 /анти-микроРНК-24 по сравнению с контрольной группой (3,92% ± 0,52% против 6,35% ± 0,83% соответственно; P &л; 0,05). (рис 3B, D)
Для дальнейшего выяснения механизма зер- 24-опосредованных ингибирование роста клеток ГХ, анализ клеточного цикла проводили (рис 3C, Е). После повышающей регуляции MIR-24, процент клеток в фазе G0 /G1 увеличилась с 40,51% ± 3,15% в контрольной группе до 72,24% ± 3,65% (P ≪ 0,01), в то время как нокдаун микроРНК-24 снижается процент клеток в G0 /G1 фазы от 42,35% ± 2,78% в контрольной группе до 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Рисунок 3 микроРНК-24 индуцируется апоптоз клеток и G0 /G1 клеточного цикла. (A) Характерные гистограмм, изображающих ядерной морфологии SGC-7901 клеток трансфицированы с 100 нМ микроРНК-24 мимики или ингибитор и их соответствующие средства управления (Hoechst33342 окрашивания, исходное увеличение × 400). (B) Типичные гистограмм, изображающие апоптоз SGC-7901 клеток транзиторно трансфицированных 100 нМ микроРНК-24 мимики или ингибитора и их соответствующих органов управления. (C) Типичные гистограмм, изображающие клеточный цикл SGC-7901 клеток трансфицированы с 100 нМ микроРНК-24 мимики или ингибитора и их соответствующие средства управления. (D, E) Процент апоптотических и G0 /G1 фазы клеток трех независимых экспериментов, среднее значение ± S.D. (* Р &л; 0,05, ** Р &л; 0,01).
RegIV является мишенью ген MIR-24
Для того, чтобы более внимательно изучить механизмы MIR-24 в GC, мы искали кандидатов целевых генов путем биоинформатики. TargetScan, miRBase Tatget и StarBase были применены для поиска потенциальных мишеней микроРНК-24. Среди предсказанных мишеней, RegIV был идентифицирован как один из генов мишеней MIR-24, и мы идентифицировали один потенциальный микроРНК-24 связывающий сайт в пределах своей 3'-UTR (фиг.4А). Далее, мы исследовали экспрессию RegIV в девяти GC клеток и ГЭС-1. Мы обнаружили, что RegIV был избыточно экспрессируется в девяти GC клеток по сравнению с ГЭС-1, и показал обратную паттерн экспрессии по сравнению с MIR-24 (дополнительный файл 2: Рисунок S2A и s2b). Для того, чтобы исследовать, был ли 3'UTR мРНК RegIV функциональная мишень MIR-24, были проведены анализы люциферазы репортерного гена. Сначала мы оценивали активность MIR-24 (или микроРНК-управления) котрансфицируют в SGC-7901 клеток с Luc-RegIV плазмиды или Luc-RegIV-Мут плазмиды (в которой предполагаемый сайт связывания микроРНК-24 мутировал), наряду с плазмидой PRL-TK, содержащей ген люциферазы Renilla в качестве внутреннего контроля (фиг.4В). Клетки котрансфицируемым с MIR-24 продемонстрировали значительное снижение активности люциферазы по сравнению с микроРНК-контрольной группой (Р &ЛТ; 0,05). Тем не менее, микроРНК-24 совместно не трансфицировали Люк-RegIV-Мут плазмиды показали никакой существенной разницы в репортеру активности по сравнению с клетками, котрансфицируют MIR-контролем. Кроме того, анти-микроРНК-24 увеличило активность люциферазы дикого типа Люк-RegIV, но не имел никакого влияния на Luc-RegIV-Мут плазмиды (фиг.4С; P &л; 0,05). Мы также проводили анализы гена люциферазы репортера в СНУ-16, чтобы минимизировать влияние эндогенных MIR-24. Во-первых, эктопическая экспрессия микроРНК-24 в СНУ-16 клеток была подтверждена QRT-PCR. Выражение MIR-24, трансфицированных микроРНК-24 мимике было примерно в 50 раз выше, чем у микроРНК-контрольной группы в СНУ-16 (Р &л; 0,01), в то время как не статистической разницы с трансфекцией анти-MIR-24 (дополнительный файл 3: Рисунок S3A). Клетки котрансфицируют с MIR-24 продемонстрировали значительное снижение активности люциферазы по сравнению с микроРНК-контрольной группой (P &л; 0,001), в то время как нет статистически значимых различий с анти-MIR-24 трансфекции (Дополнительный файл 3: Рисунок S3B и S3C) , Эти результаты убедительно показали, что 3'UTR из RegIV содержит прямые сайты связывания для MIR-24. Рисунок 4 микроРНК-24 ориентирована на 3'UTR из RegIV гена и иммунное RegIV в желудочных тканях. (А) Схематическое график предполагаемых участков связывания СИК-24 в RegIV 3'UTR. RegIV-Мут указывает RegIV-3'UTR с мутацией в Мирском 24-связывающим-сайтов. (B) микроРНК-24 имитирует подавлена ​​активность люциферазы репортера, содержащего дикого типа RegIV 3'UTR (* P &лт; 0,05), но не репортер с мутантным RegIV 3'UTR. (C) Анти-микроРНК-24 увеличило активность люциферазы дикого типа Luc-RegIV (* P &ЛТ; 0,05), но не имел никакого влияния на мутанта. (D) Через сорок восемь часов после того, как микроРНК-24 мимической и контрольной трансфекции SGC-7901 клеток, уровень белка RegIV значительно снизился по сравнению с MIR-контролем, как определено методом ELISA. Анти-микроРНК-24 увеличило экспрессию RegIV по сравнению с анти-MIR-контроля (* P < 0,05, ** Р &л; 0,01). (Е) Через двадцать четыре часа после того, как микроРНК-24 имитируют или ингибитора и соответствующего контроля трансфекции в SGC-7901 клетках, не было никакой разницы в уровне мРНК RegIV по сравнению с MIR-контролем, как определено QRT-PCR (P > 0,05). Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. из трех независимых экспериментов. (F) Нет экспрессии RegIV не был обнаружен в нормальной слизистой оболочке желудка. Была выражена (G) RegIV в кишечной метаплазии желудка. (H) наблюдалась выраженная экспрессия RegIV в желудочном карциномы печатка кольцо клеток.
Далее мы исследовали микроРНК-24 регуляции мРНК RegIV и уровней белка в трансфицированных SGC-7901 клеток. Анализ ELISA показал, что уровни белка RegIV были сильно подавлены в SGC-7901 /MIR-24 клеток, в то время как уровни белка RegIV были повышающей регуляции в SGC-7901 /анти MIR-в-24 клеток (рис 4D; * P &л; 0,05, ** Р &л; 0,01). Анализ QRT-ПЦР не выявили разницы в уровне мРНК RegIV во всех группах трансфицированных клеток (рис 4Е; P > 0,05). В то же время, мы обнаружили экспрессию с-Мус в GC клетках в качестве положительного контроля, трансфицированных микроРНК-24 [20]. Мы обнаружили, что микроРНК-24 подавляются RegIV и с-Мус (дополнительный файл 4: Рисунок S4A и S4B).
Предыдущие исследования показали, что RegIV было связано с распространением и метастазирования GC. Далее мы использовали иммуногистохимический анализ, чтобы оценить экспрессию RegIV в GC. Наши результаты подтвердили избыточную экспрессию RegIV в GC. Уровень белка RegIV в нормальной слизистой оболочки желудка была ниже, чем кишечной метаплазии желудка и желудка кольцо с печаткой-клеточной карциномы (рис 4F-H). Для того, чтобы оценить клиническую значимость этих результатов, мы исследовали корреляцию между выражениями RegIV и MIR-24 в GC тканях. Мы обнаружили, что RegIV и микроРНК-24 выставлен инверсной характер экспрессии в тканях GC (таблица 2). Эти результаты поддерживают идею о том, что подавление микроРНК-24 привело к повышению уровня протеина RegIV в GC.Table 2 RegIV и микроРНК-24 демонстрируют обратного характера экспрессии в GC

микроРНК-24 выражение

значение P


Low

высокого


Reg IV (IHC)
Негативный
9
16
0,038 *
позитиве
25
13
* P
&л; 0,05 считалось статистически значимым
Гиперэкспрессия MIR-24 ингибирует онкогенность в естественных условиях
Учитывая, что микроРНК-24 улучшилось. пролиферацию клеток GC в пробирке
мы исследовали, является ли микроРНК-24 может повлиять на онкогенность в естественных условиях
. Ретровируса-опосредованной СГК-7901 /MIR-24 и СГК-7901 /микроРНК-контроль стабильные клеточные линии были получены, как описано в разделе Методы. SGC-7901 /RV-микроРНК-24 и клетки SGC-7901 /RV-Mir-контроль вводили подкожно в четыре-недельных самцов голых мышей, и формирование опухоли контролировали. Опухоли росли медленнее в SGC-7901 /RV-микроРНК-24 группы, чем те, в СГК-7901 /RV-микроРНК-контрольной группы (рис 5А). Средний объем опухоли у мышей, которым вводили СГК-7901 /RV-микроРНК-24 клеток на 28-й день было значительно меньше, по сравнению с мышами, которым вводили клетки СГК-7901 /RV-микроРНК-регулирования (397.45 ± 93.07 мм 3 против 1083.56 ± 101,56 мм 3, соответственно) (рис 5B и C; P &л; 0,05). Рисунок 5 микроРНК-24 ингибирует пролиферацию онкогенность и в естественных условиях. (A) Фотография опухолей, полученных из RV-микроРНК-24 или RV-микроРНК-контрольными клетками у голых мышей. кинетика (Б) роста опухолей у голых мышей. были измерены диаметры опухоли каждые 7 дней. Объем голых мышей показано столбиками, S.D. (* Р &л; 0,05). (С) Средний вес опухолей у голых мышей. Данные представлены в виде средних значений ± S.D. (* Р &л; 0,05). (D) Типичные фотографии иммуногистохимического анализа Ki-67 антигена в опухолях голых мышей (исходное увеличение, 200 ×). (E) Представитель индекс пролиферативной опухолей в RV-микроРНК-24 и RV-микроРНК-контрольных голых мышей. Данные представлены в виде средних значений ± S.D. (** Р &л; 0,05). (F) Уровни экспрессии RegIV в опухолевых тканях голых мышей. Данные представлены в виде средних значений ± S.D. (* Р &л; 0,05). (G) уровни экспрессии мРНК RegIV в опухолевых тканях голых мышей (P > 0,05). Данные представлены в виде среднего значения ± S.D. из трех независимых экспериментов.
Чтобы оценить, было ли торможение роста опухоли в SGC-7901 клеток /RV-микроРНК-24 частично из-за подавления пролиферации, иммуногистохимического анализа опухолевых тканей были выполнены. Как показано с Ki-67 антигена окрашивания, пониженный рост опухоли у мышей, которым вводили СГК-7901 /RV-микроРНК-24 клеток может быть частично из-за более низкой пролиферации, вызванной избыточной экспрессии микроРНК-24. Процент Ki-67-антиген-позитивных клеток была ниже в опухоли, полученной из SGC-7901 /RV-MIR-24 клеток, чем опухоли, полученной из SGC-7901 /RV-микроРНК-контрольных клеток (37,1% ± 3,6% против . 79,5% ± 5,2%, соответственно) (рис 5D и E, P < 0,01). Уровень экспрессии RegIV, как определено методом ELISA была ниже в опухоли, полученной из клеток с гиперэкспрессией микроРНК-24, чем опухоли, полученной из контрольных клеток (1,77 ± 0,15 нг /мл в СГК-7901 /RV-микроРНК-24 против 3,13 ± 0,25 нг /мл в SGC-7901 /RV-MIR-контроль) (рис 5F; P &л; 0,05). Тем не менее, не было статистически значимых различий в относительном выражении RegIV мРНК (рис 5G). Таким образом, туморогенности SGC-7901 RV-микроРНК-24 клеток /были значительно снижены в естественных условиях
.
Обсуждение
Накопленные данные поддержала важные роли микроРНК, которые действуют либо как супрессоров опухолей или онкогенов, в GC [21-23]. Кроме того, многие микроРНК было показано, обладает терапевтическим потенциалом. Из-за их функции в качестве основных регуляторов генома и новым механизмом действия, микроРНК считается перспективной технологией для терапевтического развития [24]. микроРНК-26а имеет противоопухолевые свойства и потенциальную терапевтическую полезность для рака печени в пробирке
и в естественных условиях
, и было связано с быстрым и устойчивым ингибирования пролиферации раковых клеток и высоко специфической индукции гибели опухолевых клеток [25]. Конкретный механизм роли дизрегуляции микроРНК в желудочном канцерогенезе остается неуловимым.
В данном исследовании мы продемонстрировали ингибирующее действие MIR-24 на метастазирование опухоли в клиническом, клеточном и молекулярном уровне, так и в экспериментальной модели животных. Мы представили подробную механистической экспериментальные доказательства роли микроРНК-24 в GC путем подавления экспрессии RegIV. Исследования показали, что микроРНК-24 может действовать как онкоген в злокачественных выпотов [26], пероральный карциномы [27, 28], рак предстательной железы [3] и рака легких [29, 30], но может действовать как супрессор опухоли при раке толстой кишки [ ,,,0],19] и опухоли ретинобластомы [31]. Лал и др. обнаружили, что микроРНК-24 пролиферации клеток и тормозится прогрессии клеточного цикла путем подавления экспрессии E2F2, MYC и других клеточного цикла регуляторных генов путем связывания с "бессемонные" элементов распознавания 3'UTR микроРНК [20]. У J и др. сообщили, что трансфекция MIR-24 в GC клетки снижала экспрессию белка AE1, что привело к ингибирования клеточной пролиферации [32]. Тем не менее, полные базовые механизмы для MIR-24 в GC до сих пор не ясно.
Наш отчет определены микроРНК-24 как подавитель опухоли кандидата в GC. Мы нашли понижающей регуляции экспрессии микроРНК-24 как в GC тканях и клеточных линиях. Сверхэкспрессия MIR-24 в SGC-7901 GC клеток значительно снижается пролиферацию и инвазию как в пробирке
и в естественных условиях
, выявление потенциального терапевтического эффекта MIR-24 в GC. Противоположный результат был получен, когда экспрессия микроРНК-24 ингибируется анти-MIR-24. Вместе эти результаты свидетельствуют о том, что микроРНК-24 может функционировать как опухолевый супрессор в человеческом GC.
МикроРНК связываются с совершенной или несовершенной комплементарный "семенем" последовательностей в мРНК мишеней, что приводит к расщеплению мРНК мишеней или ингибирования их перевода [33] , В данном исследовании мы определили RegIV в качестве целевого гена микроРНК-24. микроРНК-24 граница с неполной комплементарности мРНК RegIV, что приводит к прямой трансляционной ингибирования мРНК RegIV, но без влияния на общую стабильность мРНК. В различных режимах действия микроРНК, микроРНК-24 не влияет на уровень мРНК RegIV, но поступательное торможение. RegIV является членом Reg семейства генов человека, который разделяет сходство последовательности с углеводной-связывающим доменом лектинов С-типа, и впервые был выделен и охарактеризован в человеческом воспалительное заболевание кишечника [34]. RegIV один тип секретируемых белков, и играет биологическую роль в зависимости от внеклеточного секретируемых белков, так что мы взяли ELISA в качестве предпочтительного способа обнаружения. Вестерн-блот также выполнены, чтобы подтвердить уровень белка RegIV, и мы получили аналогичные результаты. Предыдущие исследования показали, что ген RegIV часто избыточно экспрессируется в GC и потенциально участвует в инвазии, метастазирования и канцерогенеза GC. Выражение RegIV был узко ограничен в нераковых тканях [35, 36]. Выражение RegIV была заметно выше у пациентов с перитонеального метастазирования по сравнению с пациентами без перитонеального метастазирования. RegIV может ускорить перитонеальный метастаз в GC и уровни в промывных жидкостях может служить хорошим маркером для перитонеального метастазирования [37-39]. RegIV может функционировать в качестве сыворотки биомаркеров для пациентов GC и ингибирует 5-FU-индуцированный апоптоз путем индукции Bcl-2 и дигидропиримидиндегидрогеназы [40].
В настоящем исследовании мы определили MIR-24 в качестве потенциального регулятора вверх по течению RegIV. Во-первых, избыточная экспрессия микроРНК-24 уменьшилась активность люциферазы гена-репортера, содержащего 3'UTR из RegIV, в то время как мутация "Семя области" сайтов в 3'UTR из RegIV отменили регулирующее действие СИК-24. Противоположный результат был получен, когда мы использовали анти-микроРНК-24. Во-вторых, ткани GC человека выражены значительно более низкие уровни микроРНК-24, чем неопухолевых тканей, в то время как GC ткани содержат значительно более высокие уровни белка RegIV чем неопухолевых тканей. В-третьих, избыточная экспрессия микроРНК-24 подавляются RegIV на уровне белка, в то время как подавление MIR-24 повышенный уровень белка RegIV. В-четвертых, избыточная экспрессия микроРНК-24 была в значительной степени связано с распространением и метастазированию, что указывает на функциональное перекрытие с RegIV. Все эти результаты указывают на то, что RegIV может быть прямой целевой ген MIR-24 в GC.
Канцерогенез представляет собой ряд последовательных событий, в том числе отряд, миграции, местного вторжения, ангиогенез, intravasation, выживание в кровеносной системе, кровоподтек и подроста в различных органах [41, 42]. Здесь мы показали, что микроРНК-24 может регулировать канцерогенез GC путем модулирования пролиферации, миграции и местного вторжения. Кроме того, наши данные свидетельствуют о возможности для MIR-24 в качестве терапевтической мишени в GC. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы полностью понять детальные механизмы MIR-24 в GC канцерогенеза и в качестве потенциального терапевтического подхода.
Методы
Ethical заявление
Письменное информированное согласие было собрано из всех участников, и протокол исследования был одобрен по этическим комитетом Жуйцзинь больницы, Шанхайский университет Цзяотун школы медицины. Все эксперименты мыши были одобрены уходу за животными (разрешениеÉ20810) и использование комитета и проводится в соответствии с официальными рекомендациями по уходу и использованию лабораторных животных в Жуйцзинь больницы, Шанхай Цзяотун школы медицины университета.
Клеточных линий <бр> ГХ клеточные линии человека SNU-1, SNU-16, NCI-N87, и КАТО III были приобретены у американской коллекции типовых культур (АТСС). Клеточные линии SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45 и АГС были приобретены из Шанхая институтом биологических наук, Китайской академии наук. Увековечены нормальная слизистой желудка эпителиальных клеток линии (ГЭС-1) был подарком от профессора Feng Bi (Huaxi медицинский университет, Чэнду, провинция Сычуань, Китай) PR. Линия клеток эмбриональной почки 293 Т была сохранена в нашей лаборатории, и поддерживали в среде Игла в модификации Игла (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO <югу> 2. Все GC клетки культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% FBS в увлажненном инкубаторе с 5% CO <суб> 2 при 37 ° С.
Образцы тканей
Первичные раковые ткани и спаренные прилегающие ткани неопухолевой были собраны у пациентов с GC подверглись радикальной резекции желудка в отделении хирургии, Жуйцзинь больницы, Shanghai Jiao Tong University школы медицины. Примыкающие нормальные ткани были получены в течение 5 см от первичного рака. Образцы ткани были немедленно мгновенно замораживали в жидком азоте и хранили в холодильнике при -80 ° С. Ткани для иммуногистохимии фиксировали в 4% параформальдегида и залитых парафином. Данные клинико-патологическими были рассмотрены, и классификация TNM постановка была основана на критериях американского Объединенного комитета по раку (AJCC, 6-е издание). Все образцы были проверены с помощью гистологического исследования. Изоляция
РНК и QRT-PCR
Общую РНК выделяли из образцов тканей и клеточных линий с использованием тризола реагента (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Уровни экспрессии микроРНК были оценены с использованием Шпилька-itTM микроРНК КПЦР Количественный анализ Kit (GenePharma, Шанхай, Китай PR) в соответствии с протоколом производителя. U6 малая ядерная РНК (RNU6B; GenePharma) использовали для нормализации. Относительное соотношение экспрессии микроРНК-24 в каждой парного опухоли и неопухолевой ткани была рассчитана с использованием метода -ΔΔCT 2 . Уровень экспрессии микроРНК-24 была определена как, когда активируется отношение относительное выражение было > 1, и определяется как подавляются, когда отношение относительное выражение было &л; 1. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Желудочный по сравнению с пост-привратника кормления: систематический review
• Утилита интраназального кетамина и мидазолама для выполнения желудочного содержимого у детей: двойное слепо…