Tumor suppressor miR-24 tilbageholder gastrisk kræft progression ved at nedregulere RegIV

Tumor suppressor miR-24 tilbageholder gastrisk kræft progression ved at nedregulere RegIV
Abstract
Baggrund
microRNA er små ikke-kodende RNA, der modulerer en række cellulære processer ved at regulere flere mål, som kan fremme eller hæmme udviklingen af ​​maligne adfærd. Akkumulerende tyder miR-24 spiller en vigtig rolle i menneskets carcinogenese. Men dens præcise biologiske rolle stort set undvigende. Denne undersøgelse undersøgte rolle miR-24 i gastrisk cancer (GC).
Metoder
udtryk for miR-24 i GC væv sammenlignet med matchede ikke-tumorvæv og GC celler blev opdaget af QRT-PCR. Syntetisk korte enkelt- eller dobbeltstrengede RNA oligonukleotider og lentivirale vektorer blev anvendt til at regulere MIR-24 ekspression i GC-celler for at undersøge dens funktion in vitro
og in vivo
.
Resultater Salg MIR-24 var signifikant nedreguleret i GC væv sammenlignet med matchede ikke-tumorvæv og var forbundet med tumor differentiering. Ektopisk ekspression af MIR-24 i SGC-7901 GC-celler undertrykt celleproliferation, migration og invasion in vitro
samt tumorigenicitet in vivo
ved at inducere standsning af cellecyklus i G0 /G1-fasen og fremme celleapoptose. Endvidere har vi identificeret RegIV som et mål på MIR-24 og påvistes at MIR-24 reguleret RegIV ekspression via binding dens 3'-utranslaterede område.
Konklusioner Salg MIR-24 fungerer som en hidtil ukendt tumorsuppressor i GC og anti -oncogenic aktivitet kan indebære sin hæmning af målgenet RegIV. Disse resultater antyder muligheden for MIR-24 som et terapeutisk mål i GC.
Nøgleord
MIR-24 RegIV mavekræft spredning Invasion Metastasis Baggrund
gastrisk cancer (GC) er en af ​​de mest almindelige humane cancere. Selvom forekomsten og dødeligheden er faldet på verdensplan i løbet af de seneste 20 år, GC stadig rangerer som den fjerde mest almindelige og den anden mest dødelige kræft på verdensplan [1]. Selv om forskning i GC har gjort store fremskridt, de molekylære mekanismer bag GC stadig ikke fuldt belyst.
MikroRNA'er (miRNA) er små ikke-kodende, dobbeltstrengede RNA-molekyler, der kan modulere ekspression af målgener ved at påvirke post- transskriptionelle processer regulerer genekspression. miRNA genkender mål-mRNA'er baseret på fuldstændig eller ufuldstændig sekvens komplementaritet og forhindre produktionen af ​​protein ved binding til den 3 'utranslaterede region (UTR) eller den åbne læseramme (ORF) af mål-mRNA [2, 3]. miRNA har vist sig at fungere i cellulære proliferation og differentiering processer, herunder epitel-mesenkymale overgang [4] og endodermal differentiering af humane embryonale stamceller [5]. Udover generelle cellulære funktioner af miRNA, disse molekyler spiller også en vigtig rolle i en række humane sygdomme. Flere undersøgelser har vist, at fejlagtig regulering af miRNA er relateret med cancer [6, 7], hvor de fungerer som enten onkogener eller tumorsuppressorer. miRNA er blevet rapporteret at være involveret i akut myeloid leukæmi, brystcancer, ikke-småcellet lungekræft, leverkræft, coloncancer, GC og andre kræftformer [8-13]. Overekspression eller nedregulering af miRNA fører til spredning af protein udtryk og dermed bidrage til tumorigenese ved at modulere proliferation, angiogenese og invasion. Forskerne fandt, at miRNA udtryk profiler kan anvendes til at klassificere humane cancere, og dette fund var før anvendelse af messenger-RNA-profiler for klassificering af dårligt differentieret tumorer [14, 15].
Afvigende ekspression af specifikke miRNA i GC har været tidligere rapporteret og blev korreleret med progression og prognose af GC [16-18]. Vi har tidligere fundet, at MIR-24, som kan tjene som en tumorsuppressor gennem et målområde polymorfi [19], var en signifikant nedreguleret miRNA i GC celler og væv sammenlignet med ikke-tumorvæv. I denne undersøgelse har vi analyseret MIR-24 ekspressionsniveauer i GC væv sammenlignet med matchede ikke-tumorvæv, og vurderet korrelationer mellem MIR-24-niveau og clinicopathologic parametre. Vi evaluerede påvirkningen af ​​overekspression af miR-24 på væksten og apoptose af SGC-7901 GC celler både in vitro
og in vivo
. Vi bestemt også den biologiske effekt af nedregulering af miR-24-ekspression på GC celler. Desuden identificerede vi RegIV (regenererende ø-afledt familie, medlem 4) som et af de målgener af miR-24. Vi hypotesen, at miR-24 kan regulere invasion og metastase af GC celler ved direkte rettet mod RegIV genet.
Resultater
Overekspression af miR-24 hæmmer GC celledeling
At udforske udtryk for miR-24 i GC, kvantitativ real-time RT-PCR (QRT-PCR) blev udført. Ekspression af MIR-24 blev generelt nedreguleret i ni GC cellelinjer sammenlignet med de immortaliserede normale gastriske mucosale epitelceller GES-1 (figur 1A). Ekspression af MIR-24 blev undersøgt yderligere med QRT-PCR i tumorvæv og matches ikke-tumorvæv fra 63 GC patienter (figur 1b). Det gennemsnitlige ekspressionsniveau af MIR-24 var signifikant nedreguleret i tumorvæv sammenlignet med matchede ikke-tumorvæv (figur 1C). Tilsammen udgør disse resultater forudsat stærke beviser for, at miR-24 var signifikant nedreguleret i GC. Figur 1 MIR-24 er signifikant nedreguleret i GC og inhiberede SGC-7901 cellevækst. (A) Relativ udtryk for miR-24 i ni GC cellelinjer sammenlignet med GES-1 bestemt ved QRT-PCR af tre uafhængige forsøg (** P < 0,01, *** P < 0,001). (B) Relativ udtryk for miR-24 i kirurgiske eksemplarer af 63 GC bestemmes af QRT-PCR. Alle eksperimenter blev udført tredobbelt. Data er vist som -ΔΔCT værdier, S.D. ikke vist. (C) Middelværdien og standardafvigelsen for MIR-24 ekspressionsniveauer i kirurgiske prøver af 63 GC væv og matchede ikke-tumorvæv er vist. Data er præsenteret som 2-ACt-værdier (** P < 0,05). U6 snRNA blev anvendt til normalisering. (D) MIR-24 inhiberede væksten af ​​SGC-7901-celler som detekteret ved WST, mens anti-MIR-24 øget cellevækst (* P < 0,05). Data er vist som middelværdi ± S.D. af tre uafhængige forsøg.
Vi undersøgte dernæst korrelationerne mellem ekspressionsniveauet af MIR-24 og clinicopathologic faktorer i human GC. De kliniske og patologiske egenskaber ved 63 GC patienter er tilvejebragt i tabel 1. På grundlag af relative ekspressionsniveauer forhold af MIR-24 /U6 = 1 er sagerne opdelt i to grupper: den MIR-24 high-ekspression (n = 29) og mIR-24 low-ekspression (n = 34). MIR-24 low-udtryk udviste signifikant lavere tumor differentiering (P = 0,021). Men den miR-24 ekspressionsniveauet ikke nogen sammenhæng med alder, køn, tumor, dybden af ​​lokal invasion, lymfeknude metastaser, eller TNM stage.Table 1 Forholdet mellem miR-24 ekspressionsniveauet og clinicopathologic variabler i 63 GC patienter
Clinicopathologic parametre
miR-24 udtryk
P-værdi
høj (n = 29)
Low (n = 34)

Køn
Mand
17
21
0,799
Female
12
13
Alder (år)
< 60
15
18
0,923
≥60
14
16
Tumor placering
Distal tredje
8
8
0,310
Mellemøsten tredje
6
13
proksimal tredje
15
13
WHO klassificering
Adenocarcinom
25
28
0,155
Signet-ring cell carcinoma
1
5
mucinøs adenocarcinom
3
1
Differentiering
Nå, moderat
15
8
0,021
Dårligt
14
26
BORRMANN klassifikation
I /II
11
12
0,828
III /IV
18
22
Lokal invasion
T1 /T2
1
7
0,098
T3 /T4
28
27
lymfeknudemetastase
Ingen
6
4
0,535
Ja
23
30
Distant metastaser
Ingen
28
31
0,724
Ja
1
3
TNM stadie
I /II
7
8
0,955
III /IV
22
26
at undersøge den biologiske funktion af miR-24 i udvikling og progression af GC, vi transficeret SGC-7901 celler med miR-24 efterligner (SGC-7901 /miR-24) eller miR-24 inhibitor (SGC-7901 /anti-miR-24). Som vist i supplerende fil 1: Figur S1A og S1B valgte vi 100 nM som egnet koncentration i efterfølgende eksperimenter. Ektopisk udtryk for miR-24 i SGC-7901 celler blev bekræftet ved QRT-PCR. Dernæst undersøgte vi celleproliferation med WST-assay. Overekspression af miR-24 hæmmede væksten i SGC-7901 celler sammenlignet med miR-kontrol transfekterede celler (P < 0,05), mens anti-miR-24 øget cellevækst aktiviteter (P < 0,05, figur 1D).
Overekspression af miR-24 hæmmer migration og invasion af GC celler
Næste vi evaluerede effekten af ​​miR-24 på celle migration og invasion i GC. Cell migration og invasion analyser viste, at overekspression af miR-24 undertrykt celle migration (SGC-7901 /miR-24-gruppen, 63,0 ± 3,6 celler pr område; kontrolgruppe, 126,3 ± 7,0 celler pr område; P < 0,05) og invasion ( SGC-7901 /miR-24-gruppen, 34,7 ± 2,1 celler pr område; kontrolgruppe, 63,7 ± 3,5 celler pr område; P < 0,05) (Figur 2A, B). I modsætning hertil knockdown af miR-24 signifikant forøget celle migration (SGC-7901 /anti-miR-24-gruppen, 182,3 ± 5,0 celler pr område; kontrolgruppe, 105,3 ± 3,8 celler pr område; P < 0,01) og invasion (SGC -7901 /anti-miR-24-gruppen, 124,3 ± 3,8 celler pr område; kontrolgruppe, 62,7 ± 2,5 pr område; P < 0,01) (Figur 2A, C). Figur 2 miR-24 hæmmede migration og invasion af SGC-7901 celler. (A) Repræsentative områder af SGC-7901 celler i Transwell assays. (B, C) Repræsentative områder af SGC-7901 celler i migrations- og invasion assays, hhv. Gennemsnitligt antal migration og invasion celler pr felt fra tre uafhængige forsøg (* P < 0,05, ** P < 0,01).
Overekspression af miR-24 fremmer apoptose af GC celler og inducerer cellecyklusstop i G0 /G1 fase
Eftersom observeret cellevækst kan blive påvirket af satserne for apoptose og cellecyklusprogression, vi undersøgt virkningerne af miR-24 på apoptose og cellecyklus in vivo
ved flowcytometri. Vi fandt, at omkring 12-15% af SGC-7901 /miR-24 celler udviste morfologiske træk er typiske for apoptose, herunder kondenseret kromatin og nuklear fragmentering af Hoechst33342 farvning for DNA-indhold. I modsætning hertil efter tegner sig for den sjældne spontane apoptose i SGC-7901 celler, SGC-7901 /anti-miR-24-gruppen viste ingen signifikante ændringer ved Hoechst33342 farvning (figur 3A). Flowcytometri viste, at den apoptotiske sats blev øget betydeligt i SGC-7901 /miR-24 celler sammenlignet med kontrol celler (13,62% ± 1,25% vs. 6,15% ± 0,95%, henholdsvis; P < 0,01), og faldt betydeligt i SGC -7901 /anti-miR-24 sammenlignet med kontroller (3,92% ± 0,52% vs. 6,35% ± 0,83%, henholdsvis; P < 0,05). (figur 3B, D)
for yderligere at belyse mekanismen i miR- 24-medieret vækstinhibering af GC-celler, blev cellecyklus analyse udført (figur 3C, E). Ved opregulering af MIR-24, procentdelen af ​​celler i G0 /G1-fasen steg fra 40,51% ± 3,15% i kontroller til 72,24% ± 3,65% (P < 0,01), mens knockdown MIR-24 reducerede procentdelen af ​​celler i G0 /G1 fase fra 42,35% ± 2,78% i kontroller til 30,25% ± 1,25% (P < 0,05). Figur 3 miR-24-induceret celle apoptose og G0 /G1 cellecyklusstop. (A) Repræsentative histogrammer skildrer nukleare morfologi SGC-7901 celler forbigående transficeret med 100 nM miR-24 efterligner eller hæmmer og deres respektive kontroller (Hoechst33342 farvning, original forstørrelse 400 ×). (B) Repræsentative histogrammer afbilder apoptose af SGC-7901 celler transient transficeret med 100 nM MIR-24 efterligner eller inhibitor og deres respektive kontroller. (C) Repræsentative histogrammer afbilder cellecyklus af SGC-7901 celler transient transficeret med 100 nM MIR-24 efterligner eller inhibitor og deres respektive kontroller. (D, E) Procentdelen af ​​apoptotiske og G0 /G1-fase celler af tre uafhængige forsøg, middelværdi ± S.D. (* P < 0,05, ** P < 0,01).
RegIV er et target-gen af ​​miR-24
Til nærmere undersøge de mekanismer miR-24 i GC, søgte vi efter kandidat målgener ved bioinformatik. Targetscan, miRBase Tatget og starbase blev anvendt til at søge efter potentielle mål for miR-24. Blandt de forudsagte mål, blev RegIV udpeget som en af ​​de målgener af MIR-24, og vi identificeret en potentiel MIR-24 bindingssted inden for dens 3'UTR (figur 4A). Dernæst undersøgte vi ekspressionen af ​​RegIV i ni GC celler og GES-1. Vi fandt, at RegIV blev overudtrykt i ni GC-celler sammenlignet med GES-1 og udviste en invers ekspressionsmønster sammenlignet med MIR-24 (Supplerende fil 2: Figur S2A og S2B). For at undersøge om 3'UTR af RegIV mRNA var en funktionel mål for MIR-24, blev luciferasereportergenet assays udført. Vi først evalueret aktiviteten af ​​miR-24 (eller miR-kontrol) cotransficeret ind i SGC-7901 celler med Luc-RegIV plasmid eller den Luc-RegIV-mut plasmid (hvor den formodede miR-24 bindingssted blev muteret), sammen med pRL-TK plasmid indeholdende Renilla luciferase genet som en intern kontrol (figur 4B). Celler cotransficeret med MIR-24 viste en signifikant reduktion af luciferaseaktivitet i forhold til MIR-kontrolgruppen (P < 0,05). Men MIR-24 co-transficeret med Luc-RegIV-mut plasmid viste ingen signifikant forskel i reporter aktivitet sammenlignet med celler cotransficeret med MIR-kontrol. Ligeledes anti-MIR-24 steg luciferaseaktiviteten af ​​vildtype Luc-RegIV, men havde ingen virkning på Luc-RegIV-mut plasmid (figur 4C; P < 0,05). Vi udførte også luciferasereportergen assays i SNU-16 at mindske virkningen af ​​endogent MIR-24. I første omgang blev ektopisk udtryk for miR-24 i SNU-16 celler bekræftet ved QRT-PCR. Ekspression af MIR-24 transficeret med MIR-24 efterligner var omkring 50 gange højere end for MIR-kontrolgruppe i SNU-16 (P < 0,01), mens ingen statistisk forskel med transfektion af anti-MIR-24 (Supplerende fil 3: fig S3A). Celler cotransficeret med MIR-24 viste en signifikant reduktion af luciferaseaktivitet i forhold til MIR-kontrolgruppen (P < 0,001), mens ingen statistisk forskel med anti-MIR-24 transfektion (Yderligere fil 3: Figur S3B og S3C) . Disse resultater kraftigt indikerede, at 3'UTR af RegIV indeholder direkte bindingssteder for miR-24. Figur 4 MIR-24 målrettet 3'UTR af RegIV genet og immunfarvning af RegIV i gastriske væv. (A) Skematisk diagram af de formodede bindingssteder af miR-24 i RegIV 3'UTR. RegIV-mut angiver RegIV-3'UTR med mutation i MIR-24-bindingssteder. (B) MIR-24 efterligner nedreguleret aktivitet af et luciferase reporter indeholdende vildtype RegIV 3'UTR (* P <0,05), men ikke reporter med mutant RegIV 3'UTR. (C) Anti-MIR-24 steg luciferaseaktiviteten af ​​vildtype Luc-RegIV (* P < 0,05), men havde ingen effekt på mutanten. (D) Otteogfyrre timer efter MIR-24 mimic og kontrol transfektion af SGC-7901 celler, proteinniveauet af RegIV blev signifikant reduceret sammenlignet med den MIR-kontrol som bestemt ved ELISA. Anti-MIR-24 forøgede ekspression af RegIV sammenlignet med anti-MIR-kontrol (* P < 0,05, ** P < 0,01). (E) Fireogtyve timer efter MIR-24 mimic eller inhibitor og den respektive kontrol transfektion i SGC-7901 celler, var der ingen forskel i mRNA-niveauet af RegIV forhold til MIR-kontrol som bestemt ved QRT-PCR (P >0,05). Data er vist som middelværdi ± S.D. af tre uafhængige forsøg. (F) nr ekspression af RegIV blev detekteret i normal gastrisk mucosa. (G) RegIV blev udtrykt i intestinal metaplasi af maven. (H) Stærk udtryk for RegIV blev observeret i gastrisk signet-ring celle carcinom.
Næste vi undersøgte miR-24 regulering af RegIV mRNA og protein niveauer i transfekterede SGC-7901 celler. ELISA-analyse viste, at RegIV protein niveauer i høj grad blev undertrykt i SGC-7901 /MIR-24 celler, hvorimod RegIV protein niveauer blev opreguleret i SGC-7901 /anti-MIR-24 celler (figur 4D; * P < 0,05, ** P < 0,01). QRT-PCR-analyse viste ingen forskel i niveauet af RegIV mRNA i alle transficerede celle grupper (Figur 4E; P > 0,05). I mellemtiden detekteret vi ekspressionen af ​​c-myc i GC-celler som positiv kontrol transficeret med MIR-24 [20]. Vi fandt, at miR-24 nedreguleret RegIV og c-myc (Ekstra fil 4: Figur S4A og s4b).
Tidligere undersøgelser viste, at RegIV var forbundet med spredning og metastaser af GC. Dernæst anvendes immunhistokemisk analyse for at evaluere ekspressionen af ​​RegIV i GC. Vores resultater bekræftede overekspression af RegIV i GC. Proteinet niveau af RegIV i normal gastrisk mucosa var lavere end intestinal metaplasi af maven og gastrisk signet-ring cellecarcinom (Figur 4F-H). For at vurdere den kliniske relevans af disse fund, vi undersøgte sammenhængen mellem udtryk for RegIV og miR-24 i GC væv. Vi fandt, at RegIV og MIR-24 udviste en omvendt ekspressionsmønster i GC væv (tabel 2). Disse resultater understøtter den opfattelse, at nedregulering af miR-24 resulterede i øgede protein niveauer af RegIV i GC.Table 2 RegIV og miR-24 udviser omvendt udtryk mønster i GC
miR-24 udtryk
P-værdi
lav
høj
Reg IV (IHC)
Negativ
9
16
0,038 *
Positiv
25
13
* P
< 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant
Overekspression af miR-24 hæmmer tumorigenicitet in vivo
Da miR-24 forbedret. spredning af GC celler in vitro
, vi undersøgt, om miR-24 kan påvirke tumorgenicitet in vivo
. Retrovirusmedieret SGC-7901 /MIR-24 og SGC-7901 /MIR-kontrol stabile cellelinier blev opnået som beskrevet i afsnittet Fremgangsmåder. SGC-7901 /RV-MIR-24 og SGC-7901 /RV-MIR-kontrolceller blev injiceret subkutant i fire uger gamle mandlige nøgne mus, og tumordannelse blev overvåget. Tumorer voksede langsommere i SGC-7901 /RV-miR-24 gruppe end i SGC-7901 /RV-miR-kontrolgruppen (figur 5A). Den gennemsnitlige tumorvolumen i mus inokuleret med SGC-7901 /RV-MIR-24 celler på dag 28 var signifikant mindre i forhold til mus inokuleret med SGC-7901 /RV-MIR-kontrolceller (397.45 ± 93.07 mm 3 vs. 1083.56 ± 101,56 mm 3, henholdsvis) (figur 5B og C; P < 0,05). Figur 5 MIR-24 inhiberede tumorigenicitet og proliferation in vivo. (A) Fotografi af tumorer afledt fra RV-MIR-24 eller RV-MIR-kontrolceller i nøgne mus. (B) Vækst kinetik for tumorer i nøgne mus. Tumordiametre blev målt hver 7. dag. Volumenet af de nøgne mus angivet med barer, S.D. (* P < 0,05). (C) Den gennemsnitlige vægt af tumorer i nøgne mus. Data er vist som middelværdier ± S.D. (* P < 0,05). (D) Repræsentative fotografier af immunhistokemisk analyse af Ki-67 antigen i tumorer i nøgne mus (oprindelig forstørrelse, 200 ×). (E) repræsentant proliferative indeks af tumorer i RV-MIR-24 og RV-MIR-kontrol nøgne mus. Data er vist som middelværdier ± S.D. (** P < 0,05). (F) Ekspressionsniveauer af RegIV i tumorvæv af nøgne mus. Data er vist som middelværdier ± S.D. (* P < 0,05). (G) Ekspressionsniveauer af RegIV mRNA i tumorvæv hos nøgne mus (P > 0,05). Data er vist som middelværdi ± S.D. af tre uafhængige forsøg.
at vurdere, om tumor væksthæmning i SGC-7901 /RV-miR-24 celler skyldes dels undertrykkelse af spredning, immunhistokemiske analyser af tumorvæv blev udført. Som vist med Ki-67 antigen-farvning, kan den formindskede tumorvækst i mus injiceret med SGC-7901 /RV-MIR-24 celler være delvist på grund af lavere proliferation forårsaget af overekspression af MIR-24. Procentdelen af ​​Ki-67-antigen-positive celler var lavere i tumoren er afledt af SGC-7901 /RV-MIR-24 celler end tumoren stammer fra SGC-7901 /RV-MIR-kontrolceller (37,1% ± 3,6% vs. . 79,5% ± 5,2%, henholdsvis) (figur 5D og E, P < 0,01). Ekspressionsniveauet af RegIV som bestemt ved ELISA var lavere i tumoren er afledt fra celler, der overudtrykker MIR-24 end tumoren stammer fra kontrolceller (1,77 ± 0,15 ng /ml i SGC-7901 /RV-MIR-24 vs. 3,13 ± 0,25 ng /ml i SGC-7901 /RV-miR-kontrol) (figur 5F; P < 0,05). Der var imidlertid ingen statistisk forskel i den relative ekspression af RegIV mRNA (figur 5G). Derfor blev den tumorgenicitet af SGC-7901 /RV-miR-24 celler betydeligt reduceret in vivo
.
Diskussion
Akkumulerende beviser har støttet vigtige roller for miRNA, der virker enten som tumorsuppressorer eller onkogener, i GC [21-23]. Desuden har mange miRNA blevet vist at udvise terapeutisk potentiale. På grund af deres funktion som master-regulatorer af genomet og ny virkningsmekanisme, er miRNA betragtes som en lovende teknologi til terapeutisk udvikling [24]. MIR-26a har antitumorigenic egenskaber og potentiel terapeutisk anvendelighed til leverkræft in vitro
og in vivo
, og var forbundet med en hurtig og vedvarende inhibering af cancercelleproliferation og særdeles specifik induktion af tumorcelledød [25]. Den specifikke mekanisme roller dysregulerede miRNA i gastrisk carcinogenese stadig undvigende.
I denne undersøgelse, vi demonstrerede de hæmmende virkninger af miR-24 på tumor metastaser på det kliniske, cellulære og molekylære niveau og i en eksperimentel dyremodel. Vi forudsat detaljeret mekanistisk eksperimentelt bevis for den rolle, miR-24 i GC ved at undertrykke ekspressionen af ​​RegIV. Undersøgelser viste, at MIR-24 kan virke som onkogen i maligne effusioner [26], oral carcinoma [27, 28], prostatacancer [3] og lungecancer [29, 30], men kan virke som en tumorsuppressor i coloncancer [ ,,,0],19] og retinoblastom tumorer [31]. Lal A et al. fandt, at MIR-24 inhiberede celleproliferation og cellecyklusprogression ved at undertrykke ekspressionen af ​​E2F2, MYC og andre cellecyklusregulerende gener ved at binde til "uden kerner" 3'UTR miRNA genkendelseselementer [20]. Wu J et al. rapporterede, at transfektion af MIR-24 ind GC-celler reducerede ekspressionen af ​​AE1 protein, hvilket resulterede i inhibering cellulær proliferation [32]. Men de komplette underliggende mekanismer for miR-24 i GC er stadig ikke klart.
Vores rapport identificeret miR-24 som en kandidat tumor suppressor i GC. Vi fandt nedregulering af MIR-24-ekspression i både GC væv og cellelinier. Overekspression af miR-24 i SGC-7901 GC celler betydeligt reduceret proliferation og invasion både in vitro
og in vivo
, afslører den potentielle terapeutiske effekt af miR-24 i GC. Det modsatte resultat blev opnået, når ekspressionen af ​​MIR-24 blev inhiberet af anti-MIR-24. Tilsammen tyder disse resultater på, at MIR-24 kan fungere som en tumorsuppressor i human GC.
MiRNA binder til perfekt eller ufuldkomment komplementære "afkom" sekvenser i mål-mRNA'er, der fører til spaltning af mål-mRNA'er eller inhibering af deres oversættelse [33] . I denne undersøgelse identificerede vi RegIV som et målgen af ​​MIR-24. miR-24 bundet med ufuldstændig komplementaritet til RegIV mRNA, hvilket resulterer i direkte translationel hæmning af RegIV mRNA, men uden effekt på den samlede mRNA stabilitet. Da de forskellige indsatsområder former for miRNA, gjorde miR-24 ikke påvirke mRNA niveauet RegIV men translationel hæmning. RegIV er medlem af det humane Reg-gen familie, som deler sekvenslighed med carbohydratbindende domæne i C-type lektiner, og blev først isoleret og karakteriseret i human inflammatorisk tarmsygdom [34]. RegIV er en type af udskilte proteiner, og spiller en biologisk rolle afhængig af de ekstracellulære udskilte proteiner, så vi tog ELISA som en foretrukken påvisningsmetode. Western blot blev også udført for at validere proteinniveauet af RegIV, og vi opnåede lignende resultater. Tidligere undersøgelser har rapporteret, at RegIV genet ofte blev overudtrykt i GC og potentielt involveret i invasion, metastase, og carcinogenese af GC. RegIV ekspression blev snævert begrænset i noncancerous væv [35, 36]. RegIV ekspression var markant højere i patienter med peritoneal metastase sammenlignet med dem uden peritoneal metastase. RegIV kunne fremskynde peritoneal metastaser i GC og niveauer i skyllevæsker kunne tjene som en god markør for peritoneal metastaser [37-39]. RegIV kan fungere som et serum biomarkør for GC-patienter og hæmmer 5-FU-induceret apoptose ved induktion af Bcl-2 og dihydropyrimidindehydrogenase [40].
I den aktuelle undersøgelse identificerede vi MIR-24 som en potentiel opstrøms regulator af RegIV. Første, overekspression af MIR-24 faldt aktiviteten af ​​et luciferase reportergen indeholdende 3'UTR af RegIV, mens mutation af "frø Region" steder i 3'UTR af RegIV afskaffet den regulerende virkning af MIR-24. Det modsatte resultat blev opnået, da vi brugte anti-miR-24. For det andet humane GC væv udtrykte signifikant lavere niveauer af MIR-24 end ikke-tumorvæv, mens GC væv indeholder signifikant højere niveauer af RegIV protein end ikke-tumorvæv. Tredje, overekspression af MIR-24 nedreguleret RegIV på proteinniveauet, mens nedregulering af MIR-24 steg RegIV proteinniveauet. For det fjerde overekspression af miR-24 var signifikant relateret til spredning og metastaser, hvilket indikerer en funktionel overlapning med RegIV. Alle disse resultater viser, at RegIV kan være en direkte målgen af ​​MIR-24 i GC.
Carcinogenese er en serie af sekventielle hændelser, herunder frigørelse, migration, lokal invasion, angiogenese, intravasation, overlevelse i kredsløbet, ekstravasation og genvækst i forskellige organer [41, 42]. Her viste vi, at MIR-24 kunne regulere carcinogenese af GC gennem modulering proliferation, migration og lokal invasion. Endvidere antyder muligheden for MIR-24 som et terapeutisk mål i GC, vores beviser. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå de detaljerede mekanismer i miR-24 i GC carcinogenese og som en potentiel terapeutisk tilgang fuldt.
Metoder
Etisk erklæring
Skriftligt informeret samtykke blev indsamlet fra alle deltagere, og forsøgsprotokollen blev godkendt af den etiske komité i Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Alle mus eksperimenter blev godkendt af Animal Care (Permit.120.810) og brug Udvalg og gennemføres i overensstemmelse med de officielle anbefalinger for Pleje og laboratoriebrug Dyr af Ruijin Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine.
Cellelinjer
De humane GC cellelinier SNU-1, SNU-16, NCI-N87, og KATO III blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC). De cellelinier SGC-7901, MKN-28, BGC-823, MKN-45, og AGS blev købt fra Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences. Den udødeliggjort normale maveslimhinden epitelial cellelinje (GES-1) var en gave fra Prof. Feng Bi (Huaxi Medical University, Chengdu, Sichuan-provinsen, PR China). Den embryoniske nyrecellelinie 293 T blev bevaret i vores laboratorium og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO 2. Alle GC-celler blev dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS i en fugtig inkubator med 5% CO 2 ved 37 ° C. Salg Vævsprøver
Primære cancer væv og parrede tilstødende ikke-tumorvæv blev opsamlet fra patienter med GC gennemgik radikale gastrektomi ved Institut for Kirurgi, Ruijin Sygehus, Shanghai Jiao Tong University School of Medicine. De tilstødende normale væv blev opnået i løbet af 5 cm fra den primære cancer. Vævsprøver blev straks snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret i køleskab ved -80 ° C. Væv til immunohistokemi blev fikseret i 4% paraformaldehyd og paraffin-indstøbt. Klinisk-patologisk data blev revideret, og TNM mellemstationer klassificering var baseret på kriterierne i amerikansk fælles udvalg om kræft (AJCC, 6. udgave). Alle prøver blev verificeret ved patologisk undersøgelse.
RNA-isolering og QRT-PCR
Totalt RNA blev isoleret fra vævsprøver og cellelinjer under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Ekspressionsniveauerne af miRNA blev evalueret ved brug af Hairpin-itTM miRNA qPCR kvantificeringskit (GenePharma, Shanghai, PR China) ved at følge fabrikantens protokol. U6 lille nukleare RNA (RNU6B; GenePharma) blev anvendt til normalisering. Den relative ekspression forhold af MIR-24 i hver sammenkoblet tumor- og ikke-tumorvæv blev beregnet under anvendelse af 2 -ΔΔCT metode. MIR-24 ekspressionsniveauet blev defineret som opreguleret når den relative ekspression forholdet var > 1, og defineret som nedreguleret, når den relative ekspression forholdet var < 1. Alle forfattere læst og godkendt den endelige manuskript.

• Gastric versus post-pylorus fodring: en systematisk gennemgang
• Utility af intranasal Ketamin og Midazolam til at udføre gastrisk aspirater hos børn: en dobbeltblind, placebokontrolleret, randomiseret studie