Validacija nove metode, ki združuje tako HER2 imunohistokemično in HER2 dual-srebrni barvi in ​​situ hibridizacije na eno stekelce za raka želodca testing

validacija nove metode, ki združuje tako HER2 imunohistokemično in HER2 dual-srebrni barvi in ​​situ
hibridizacije na enem tobogan za želodčne testiranje karcinoma
Abstract
Ozadje
ocene stanja HER2 je predpogoj za vzpostavitev ustrezne strategije zdravljenja raka želodca. Želodca raka so zelo raznolike in ločene ocene genov ojačevanje in proteinsko izražanja vodi do negotovosti pri lokalizaciji različni kloni in je zamudno. Ta študija ocenjuje enakovrednosti nove metode, ki združuje genov in beljakovin platforme na ene strani.
Metode
imunohistokemija (IHK) in HER2 dual-srebrni barvi in ​​situ hibridizacija (SISH) kot posameznih metod (IHC /SISH) in gen-protein platforma kombinacija obeh metod na eni prosojnici (genov /proteinov) so bile izvedene v naključno zbranih 100 primerih adenokarcinomom želodca. Rezultati IHC /SISH so bile v primerjavi s genov /proteinov barvanjem.
Rezultati
96 od 100 vzorcev je bilo mogoče oceniti. V genske /proteinske obarvanja z so patologi sposoben oceniti gena ojačanja in posledično ekspresijo proteinov v celični ravni. V primerjalnih študijah je bila pomnožitev gena opazili pri 14,6% tako, konvencionalno SISH in genske platformo /beljakovin (dogovor 100%; Kapa-koeficient κ = 1,0). Beljakovinski izraz partiture IHC je bilo 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+) in 9,4% (3+). Protein izražanje z metodo genske /proteinske bile: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) in 10,4% (3+) bolnikov. Bilo je popolna Skladnosti pri oceni IHC primerov s rezultata 0 (100,0%; κ = 1). Visoke Skladnosti so prikazani na rezultat 1+ (98,96%; κ = 0,947) in 3+ (96,88%; κ = 0.825) primerih in dobre soglasij v 2+ primerih (95,83%; κ = 0,728).
Sklepi
Ta nova združena platforma ima to prednost, da lahko ovrednoti tako gen in status beljakovin v istem rakave celice in je lahko posebnega pomena za raziskave in bolnikove oskrbe.
Člen kategorijo
bolezni biomarkerjev.
ključne besede
Rak želodca HER2 imunohistokemija Silver in situ hibridizacija Gene beljakovin testa Ozadje
HER2 onkogena (imenovan tudi HER2 /neu ali erbB-2) na kromosomu 17q21, kodira 185-kD transmembranski tirozin kinaze receptorja, ki spada v družino epidermalni rastni faktor receptor (EGFR), ki sestoji iz EGFR /HER1, HER2, HER3 in HER4. aktivacija HER2 igra osrednjo vlogo v celično proliferacijo in preživetje, predvsem posredovanega preko RAS-MAPK poti. Prav tako zavira celično smrt s fosfatidilinozitol 3'-kinaza-AKT sesalcev cilj rapamicina (mTOR) poti. HER2 čezmernim so poročali v različnih solidnih tumorjev [1-7]. Gene ojačitve so redki pri drugih boleznih in anti-HER2 terapije je trenutno veljavna samo v prsih in želodcu raka.
Na osnovi rezultatov preskušanja Toga [8], je trastuzumab odobren za metastatskim adenokarcinomom želodca in gastroezofagealnem prehodu v kombinirano zdravljenje v ZDA in Evropi. Zahteva je dokaz čezmernega izražanja HER2. V Evropi je to določeno z IHC 3+ rezultat ali IHC 2+ in pozitivno FISH ali rezultat SISH (razmerje ≥ 2,0). IHC je zdelo glavni način, ker IHC negativna ali tedensko pozitiven (1+) bolnikov ni koristi od trastuzumabom v toga sojenja, čeprav so bili ISH pozitiven. V literaturi pa obstajajo velike razlike v imunohistokemičnim pozitivnosti določena. Tu je odstotek HER2 pozitivnih naprednih želodčnega adenokarcinoma razlikuje od študija za študij, od 5% do 30% [9], najverjetneje zaradi različnih analiz protokolov in meril tolmačenja.
Bodoči substudies iz dveh adjuvans randomiziranih preskušanj trastuzumab primerjavi nil pri raku dojke so pokazale, da je bilo približno 20% HER2 testov, opravljenih v institucijah na kraju samem (na oddelku patologije spletnega primarno zdravljenje v) napačna, ko je bil isti vzorec ponovno ovrednotiti v velikem obsegu, centralni laboratorij [10, 11 ].
razliko od raka na dojki, je histopatologija raka želodca v smislu HER2 šteje za bolj heterogena in osrednja prekomerno genske ojačanja je pogosto opaziti [12]. Zato so težave pri določanju statusa HER2 pričakuje, da bodo večje kot pri raku dojk. Na splošno je treba te rezultate upoštevati potrebne bolj zanesljive, ponovljive in čas varčujejo metode za presojo statusa HER2 pri raku želodca. Opravljene so bile le malo objavljenih študij, ki združujejo IHC in situ metode hibridizacije (vendar ne SISH) na ene strani [13-16]. Teze študije uporabljeni standardni IHC in kromogenskih ali fluorescenčna in situ hibridizacija (CISH ali FISH) z enojnimi metod in jih v primerjavi s hkratno analizo (kombiniran na ene strani) in našli dobro skladnost z rezultati samim barvanjem. Kolikor nam je znano, pa ni študije, ki so neposredno primerjali rezultate obeh imunohistokemiji (IHC) in srebra in situ hibridizacija (SISH), ko je vsaka uporabljajo ločeno z rezultati, ki jih uporabljajo v kombinaciji na enem odseku v želodcu karcinomov.
v tej študiji so HER2 proteina izraz in pomnožitev gena status 100 želodca adenokarcinoma in karcinomov esophagogastric križišču pregledal konvencionalno IHC in študij v posameznih metod (IHC /SISH) in vzporedno z novo metodo, ki združuje obe metodi (gen /beljakovin). Cilj te raziskave je bil oceniti enakovrednost novo platformo gen beljakovin v primerjavi s posameznimi metodami barvanja.
Metode
Bolniki in vzorce tkiva
formalin-osnovna-parafin vgrajeni (FFPE) vzorcih tumorjev od 100 bolnikov z razjedo ali gastroezofagealnem prehodu adenokarcinom so bili izbrani iz arhiva tkiva vzorcev na inštitutu za patologijo na Krankenhaus Nordwest. Projekt je bil izveden z dovoljenjem pristojnega etičnega odbora. Za vsak primer smo uporabili štiri različne metode za barvanje po manufacturer's FDA odobrila postopkov: Hematoxylin in eozinom (H &E), da oceni ustreznost vzorca in za potrditev histološki podtip, imunohistokemija (IHK) za oceno HER2 proteina izraz, srebro in situ hibridizacija (SISH) za oceno amplifikacijo gena in gen beljakovin platformo roman, ki združuje IHC in SISH na ene strani.
Imunohistokemija
IHC je bila izvedena z FDA odobrila Ventana poti, zajec monoklonska protitelesa 4B5 klon in Detection Kit za ultraVIEW DAB (Ventana) na Benchmark XT avtomatizirano Stainer (Ventana, Tucson, AZ). Na kratko, so odseki tkiva deparaffinized z EZ Prep pri 75 ° C in 76 ° C, toplotno obdelamo v Cell Conditioning 1 (CC1) za pridobivanje antigena pri 76 ° C - 100 ° C in nato inkubirali z anti-HER2 primarno protitelo za 16 min pri 37 ° C po inaktivaciji endogenega peroksidaze z uporabo UV-inhibitor 4 minute pri 37 ° C. Drsniki inkubiramo s sekundarno protitelo, čemur sledi uporabi HRP Universal multimer za 8 minut. Protitelesa so odkrili s pomočjo kromogen (po 38 min). Pred montažo so drsi jih nasprotno s hematoksilinom II za 4 minute in bluing reagent za 4 minute. Za podporo veljavnost barvanja in ugotoviti eksperimentalnih artefakte, je bila pozitivna kontrola, vključenih v vsako vožnjo.
Silver in situ hibridizacija
Dual barvni SISH je bila izvedena v skladu z INFORM HER2 Dual ISH DNAProbe koktajl in ultraVIEW SISH DNP Detection Kit /ultraVIEW RED ISH DIG Detection Kit za HER2 in Chr 17 kvantifikacije in postopku (Ventana /Roche). Obe sondi bili označeni z 2,4-dinitrofenol (DNP) in digoksigeninom (DIG). Drsniki tkiva smo deparaffinized z EZ Prep pri ° C 65 ° 76 C-in toplotno obdelamo z EZ Prep razredčeni celic balzam 2 (CC2) pri 90 ° C, čemur sledi proteaze digestijo z ISH proteaza 3 za 16 minut pri 37 ° C. genomske odseki DNK tkiva in nick-prevedeni HER2 in CHR17 sonde so se sočasno denaturirali s toplotno obdelavo za 20 minut pri 80 ° C, čemur sledi korak hibridizacije za 6 ur pri 44 ° C. HER2 signali so bile ugotovljene s pomočjo kunčjega anti-DNP protitelo 20 minut pri 37 ° C in inkubirali s HRP-konjugiranimi kozje anti-kunčje protitelo za 16 min pri 37 ° C po treh 8 min strogosti opere. Signal je bil zaznan kot srebrne depozite z srebrno acetat, hidrokinona in vodikovega peroksida. Za CHR17 odkrivanje, so drsi inkubirali z miško anti-DIG protitelesa za 20 minut pri 37 ° C in pri AP-konjugiranim kozjim protitelesa proti mišjim za 24 minut pri 37 ° C. Za človekove pravice 17 signal je bil razvit kot red dot barvanjem s hitrim rdečim in naftolne fosfat. Diapozitivi so bili končno jih nasprotno z hematoksilinom II in bluing reagent pred montažo.
Gene /beljakovine
Gene /beljakovine platforma, ki združuje IHC in SISH na eno stekelce. Za podporo veljavnost barvanja in ugotoviti eksperimentalnih artefakte, je bila pozitivna kontrola, vključenih v vsako run.For HER2 proteina barvanjem in za HER2 /Chr 17 hibridizacije, so bili uporabljeni Kit IVIEW DAB Odkrivanje in kompleti zaznavanje ultraVIEW. Vzorce smo obarvali v skladu z več testnimi pogoji za izvajanje optimalnega protokola, potrebne za doseganje rezultatov IHC /SISH obarvanja, primerljive s tistimi iz posameznega IHC in SISH testiranja. Optimizacija je bila izvedena v laboratoriju Ventana (Roche) in deloma v lastno delo. Optimalni rezultati so bili v 6 ciklih dosežemo z izvedbo postopka IHC pred postopkom SISH.
Vzorci so bili deparaffinized z EZ Prep pri 72 ° C. Za HER2 proteina obarvanjem, so odseki tkiva toplotno obdelamo v CC1 za pridobivanje antigenov pri 95 ° C in nato inkubiramo z anti-HER2 primarnega protitelesa pri 37 ° C za 48 minut po inaktivaciji endogenega peroksidaze z uporabo UV-inhibitor za 4 min pri 37 ° C. Drsniki inkubiramo z biotiniliranega sekundarnega protitelesa, ki mu sledi uporabi HRP-konjugirano streptavidin za 8 minut. Bakreni okrepljeno reakcija DAB je bil uporabljen za vizualizacijo beljakovin. Za gena HER2 in CHR 17 obarvanjem bili vzorci toplotno obdelamo z EZ Prep razredčeni CC2 pri 90 ° C za štiri cikle sledijo proteaze digestijo z ISH proteaza 2 za 12 min pri 37 ° C. Sonde smo denaturirali 4 minute pri 80 ° C in hibridiziramo v teku 6 ur pri 44 ° C ob uporabi koktajl DNP- in DIG-označenih sond. HybClear raztopino dodamo, da blokirajo interakcijo med DNP in deponiranje DAB med hibridizacijo. Genski signali so bile ugotovljene s pomočjo kunčjega anti-DNP protitelo 16 minut pri 37 ° C in inkubirali s HRP-konjugiranimi kozje anti-kunčje protitelo za 16 min pri 37 ° C po štirih 8 min strogosti opere. Signal je bil razvit s srebrno depozit s srebrovim acetat, hidrokinona in vodikovega peroksida. Za CHR17 odkrivanje, so drsi inkubirali z miško anti-DIG protitelesa za 16 minut pri 37 ° C in pri AP-konjugiranim kozjim protitelesa proti mišjim za 24 minut pri 37 ° C. Za človekove pravice 17 signal je bil razvit kot red dot barvanjem s hitrim rdečim in naftolne fosfat. Pred montažo, so diapozitivi jih nasprotno s hematoksilinom II za 8 minut in bluing reagent za 4 min.
Pathology pregled
Vzorci so bili neodvisno razlaga patologa (AB) in biolog usposobljen želodca histologijo raka (DW). Opazovalci prejetih vzorcev naključno, tj SISH, IHC in kombinirana metoda, niso bili ovrednoteni v povezavi s seboj, vendar ločeno za vsakega bolnika. Soglasje obeh recenzentov je bilo po vsakem ocenjevanju. Ker lahko neskladne rezultate med obema metodama je posledica variabilnosti znotraj opazovalca in ne razlike v kakovosti barvanja, so neskladne primeri prevrednotijo ​​tretja opazovalec, ki je bil slep na podlagi rezultatov ocenjevanja na prvi, ampak ocenijo neskladne primerov (metode) v povezavi s seboj. Nazadnje je bilo soglasje, sklenjen med tretjo opazovalca in primarnih opazovalcev.
Rezultati IHC smo interpretirali s pomočjo sistema točkovanja predlagan za raka želodca, ki Hofmann et al. [17] in Rüschoff sod. [18]: 0, ni reaktivnost ali membranska reaktivnost v < 10% tumorskih celic; 1+, šibek /komaj zaznaven membranska reaktivnost v > 10% tumorskih celic; 2+, šibko do zmerno popolno, bočni ali basolateral membranskih reaktivnost v > 10% tumorskih celic; in 3+, močan popolna, stranskih ali basolateral membranska reaktivnost pri ≥ 10% tumorskih celic.
V SISH rezultatov, skupno število HER2 in kromosomske 17 signali šteje v vsaj 20 tumorskih celic jeder v dveh različnih področjih. Razmerja HER2 /Chr 17 so se razlagajo v skladu s FISH sistem točkovanja Toga za testiranje HER2 v želodca in gastroezofagealni križišča (gej) raka, kot sledi: < 2,0, HER2 gen ne pomnožili; ≥ 2,0, HER2 gena dopolnjena [17]. Povprečno število šest ali več, je štela pomnožili.
Statistična analiza
Analiza je bila raziskovalna brez vnaprej določenih izračunov velikosti hipotezo ali vzorcev. Število 100 bolnikov je zadostovalo za izvedbo predlaganih statistične teste. Korelacije med IHC /SISH in gena /proteina, so bili ocenjeni s pomočjo Cohen's kapa koeficient (к). Razlaga kappa vrednost, ki jo Altmann [19] je bila uporabljena: к > 0.81, zelo dober sporazum; 0,61-0,80, dober sporazum; 0,41-0,60 zmerno sporazum; 0,40-0,21, pošten dogovor; ≪ 0,20, rahlo sporazum. Statistične analize so bile opravljene z uporabo WinStat programske opreme (R.Fitch Software, Version 2009,1).
Rezultati
značilnosti pacientov
devetdeset šest primerov, 100 bolnikov je bilo mogoče oceniti. En primer je bil izključen, ker ni tumorskih celic in treh primerih za slabe signale na enotnem SISH obarvanjem.
Večina bolnikov je bilo moških (67,7%) in za ≥ 65 let (70,8%) (tabela 1). Kohorta sestavljen bolnikov z adenokarcinomom na sredini distalne želodec (50,0%) ali gej (45,8%), z več primerov Lauren`s črevesju (67,7%) kot difuzne tumorjev (28,1%). Razvrščanje večine vzorcev je G3 (50,0%), čemur sledi G2 (39,6%) in tumorji razvrščene kot G2-3 (10,4%). 85,7% od odstranjenimi bolnikov (n = 28) je pokazala, bezgavko metastaze (N fazi) in 64,3% ni pokazala nobenih oddaljenih zasevkov (M faza). V polovici reseciranih bolnikov opazili oder T3 tumor, sledila T2 na 28,6%, T1, v 14,3% in stopnjo T4 na 7,1% značilnosti patients.Table 1 pacienta in HER2 pozitivnosti po podskupinah

Skupno n = 96 (%)
pozitivnosti * (IHK 3+ ali SISH +) z enim n (%)
pozitivnosti * (IHK 3+ ali SISH +) combi n (%)
Sex
Ženski
27 (28,1)
2 (7.4)
1 (3.7)
Moški
65 (67,7)
11 (16,9)
11 (16,9)
neznana
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
Starost
18-94 let (mediana 69)
≥ 65
68 (70,8)
12 (17,6)
11 (16,2)
< 65
28 (29,2)
4 (14,3)
4 (14,3)
primarne lokacije tumorja
Mid na distalni želodčne
48 (50,0)
5 (10.4)
4 (8.3)
gej
44 (45,8)
8 (18.2)
8 (18.2)
Ni določeno
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
razvrstitev Lauren
razpršenih
27 (28,1)
3 (11,1)
2 (7.4)
Mešani
4 (4.2)
1 (25,0)
1 (25,0)
Črevesne
65 (67,7)
12 (18,5)
12 (18,5)
biopsija /resekcijo
Biopsy
68 (70,8)
10 (14,7)
9 (13,2)
resekcijo
28 (29,2)
6 (21,4)
6 (21,4)
stopnjo T (n = 28)
T 1
4 (14,3)
0
0
T 2
8 (28,6)
2 (25,0)
2 (25,0)
T 3
14 (50,0)
4 (28,6)
4 (28,6)
T 4
2 (7.1)
0
0
faza N (n = 28)
N +
24 (85,7)
5 (20.8)
5 (28.8)
N -
4 (14,3)
1 (25,0)
1 (25,0)
faza M (n = 28)
M +
5 (17.9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M -
18 (64,3)
3 (16,7)
3 (16,7)
Mx
5 (17,9)
2 (40,0)
2 (40,0)
Grading
G2
38 (39,6)
6 (15,8)
6 (15,8)
G2-3
10 (10,4)
2 (20,0)
2 (20,0)
G3
48 (50,0)
8 (16,7)
7 (14,6)
Kratice
: IHC
imunohistokemija, SISH
srebra in situ hibridizacija T
primarni tumor, n
bezgavke, m
metastaz * opredeljena kot IHC 3+ ali SISH ≥2.0.
P
= 1 za vse primerjave med IHC /SISH in metodami genske /beljakovin (Fisher predstavljena je tudi natančni test).
V tabeli 1, HER2 pozitivnosti po podskupinah. Ni bistvene razlike so opazili pri HER2 pozitivnosti v primerjavi podskupin in različnih metod.
Barvanjem rezultate za HER2 proteina izražanja in genske ojačanje (enojni metode za barvanje)
Protein izražanja rezultati po IHC bilo 0 in 1 + na 70,8% in 10,4% bolnikov (tabela 2). ojačamo 2,9% od točk 0 in 10,0% za rezultat 1 + primerih. V 9,4% primerov, zmerno izraz (rezultat 2 +) z 44,4% pomnoženih primerov je bila odkrita. 9,4% obarvanih vzorcev je pokazala močan izraz (rezultat 3 +) z 77,8% pomnoženih primerih. Slika 1 kaže reprezentativnih rezultatov iz posameznih staining.Table 2 barvanjem rezultatov za HER2 proteina izražanja in genske ojačanje
enotnega načina
kombinirane metode
IHC oceno
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2,0
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2,0
n (%)

n (%)
n (%)
n (%)
0
68 (70,8)
2 (2.9)
68 (70,8)
2 (2.9)
1+
10 (10,4)
1 (10,0)
11 (11,5)
1 (9.1)
2+
9 (9.4)
4 (44,4)
7 (7.3)
2 (28,6)
3+
9 (9.4)
7 (77,8)
10 (10.4)
9 (90,9)
Kratice
: IHC
imunohistokemija, SISH
srebra v situ hibridizacija
Slika 1 predstavnik rezultatov različnih metod barvanja.. Črevesne tumor (hematoksilin in eozin (H & E), A.1, 20x) z IHC 3+ (imunohistokemija (IHK), A.2, 20x, gen /protein, A.4, 20x) in pomnoževanje (srebro in situ hibridizacija (SISH), A.3, 40x, gen /protein, A.4, 20x). IHC rezultat 0 (IHC, B.2, 20x, gen /protein, B.4, 40x), črevesne tip (H & E, B.1, 20x) in ojačanje (SISH, B.3, 40x, gen /protein , B.4, 40x).
Gene /beljakovine (kombinirana metoda madeži)
protein izražanja rezultatov po metodi genov /proteinov bilo 0, 1+, 2+ in 3+ v 70,8%, 11,5%, 7,3 % in 10,4% (tabela 2). Je bilo 2,9% /9,1% pomnožili primerov v vzorcih z rezultatom 0 /1+. 28,6% dopolnjena primerih pokazala zmerno obarvanje (rezultat 2+). Vzorce z visoko izražanja (3+), je razvidno iz 90,9% genov ojačanja. Primeri genov /proteinov madeži so dokazali na sliki 1.
Vrednotenje skladnih in neharmoničnega primerih
oceno IHC obarvanje v konvencionalne eno in metode genov /proteinov ni vedno razkrije so skladnih rezultatov; so bili navedeni tudi dogovori obeh metod v tabeli 3 je bilo zelo dobri Skladnosti v rezultatih pomnoženih primerih (sporazum 100,0%; Kapa-koeficient κ = 1), kot tudi ocena 0 (100%; κ = 1), ocena 1+ ( 98,96%, κ = 0,947) in rezultat 3+ tumorskih vzorcev (96,88%; κ = 0,825), v obeh metod. Primeri z rezultatom 2+ pokazala manj konkordančno, čeprav je še vedno dobra (95,83%; κ = 0,728). Skladnost med splošnim HER2 pozitivnosti (opredeljeno kot IHK 3+ ali SISH +) v standardni ali nov postopek je bil zelo dober (98,69%; κ = 0,963; 17,7% v primerjavi s 16,7%) Tabela 3 Skladnosti med posameznimi metodami in kombinirano gena /proteina. metode
enotnega kombinacijo vs
Skladnost
Kapa-koeficient к
sporazum Altmann [[15]]
SISH ojačani
100 %
1
Zelo dobro
IHC rezultat 0
100%
1
Zelo dobro
rezultat IHC 1+
98.96%
0.947
Zelo dobro
ocena IHC 2+
95,83%
0,728
Good
rezultat IHK 3+
96.88%
0.825
Zelo dobro
Kratice
: IHC
imunohistokemično, SISH
srebra in situ hibridizacija.
je bilo dvanajst neskladnih primerov pred ponovno analizo s strani tretje opazovalec (podatki niso prikazani). Po ponovnem ovrednotenju tretji opazovalec, neskladnih rezultati ostali v štirih vzorcih tumorja. Razlog za osem neskladnih primerih v vmesni analizi je bilo ugotovljeno, da je variabilnost znotraj opazovalec. Rezultati končnih neharmoničnega rezultati so prikazani v tabeli 4.Table 4 Podrobne ocene neharmoničnega rezultatov med metodami
Posamezne metode
kombinirane metode
Case
Histologija (Lauren)
IHC (Score)
SISH (≥ 2,0 /< 2,0)
IHC (Score)
SISH (≥ 2,0 /< 2,0)
6693
i
2+
≥2.0
3+
≥2.0
9924
i
2+
< 2,0
1+
< 2,0
20.209
i
2+
≥2.0
3+
≥2.0
1057
d
3+
< 2,0
2+
< 2,0
Kratice
. IHC
imunohistokemija, SISH
srebra v situ hibridizacija
Razprava
cilj te raziskave je bil oceniti izvedljivost nove platforme genov /proteinov v primerjavi z metodami detekcije enega obarvanje v želodcu adenokarcinome in karcinomov esophagogastric križišču.
od ocenljivih vzorcev 28,1% pokazala razpršeno, 4.2 % mešano in 67,7% črevesni histološki tip. Večina bolnikov je bilo starih (70,8%) in moške (67,7%), ≥ 65 let. Stopnja adenokarcinomom gej ali srednje do distalnega želodec je bila podobna (45,8% proti 50,0%). Pri standardni metodi je bilo 17,7% bolnikov HER2 pozitiven. Večina HER2 pozitivnih tumorjev so bile črevesne histologijo in so lokalizirani v GE križišču, to dobro ujema s podatki iz literature [20, 21]. Na splošno, na podlagi značilnosti bolnikov in tumorskih kot tudi HER2 pozitivnosti, ocenjevani skupina je predstavnik kolektiva.
Čeprav veliko izkušenj za analizo HER2 po IHC in ISH za raka na dojki, je na voljo, ni gotovo, ali jih je mogoče neposredno prenesejo karcinomov prebavnem traktu. Ekspresijo HER2 proteina, za razliko od raka dojke, je heterogena in pogosto focally izrazita. Fox sod. [12]. določi status HER2 v 100 vzorcev tkiv diagnosticiranih z napredovalim rakom želodca ali raka na esophagogastric križišča v različnih laboratorijih za testiranje svoje tekme. Za to, IHK in CISH (kromogeni hibridizacije in situ) ali SISH bila uporabljena. Tam je bil dober dogovor med različnimi laboratoriji glede CISH ali SISH, vendar so ugotovili zmerno skladnost vseh IHC rezultate. Na podlagi rezultatov preiskave, je mnenje avtorja, da je določitev statusa HER2, ki temelji na IHC, sledi ISH (evropski standard) ni optimalna strategija ocenjevanja in priporočil opravljanje obeh metod obarvanja [12]. Druga študija [22] testirali HER2 ojačanje in izražanja pri 148 bolnikih z napredovalim želodca karcinomom po IHC in FISH /SISH. Pozitivni primeri HER2 so odkrili pri samo 10% od IHC v primerjavi s 18% do 22% v situ hibridizacija. Ne samo zato, ker je bilo lažje za reprodukcijo, avtor predlagal situ hibridizacije tehniki kot boljši pristop za določanje HER2-pozitivnosti [22]. Vendar pa glede na sojenju TOGA [8], bolniki z ISH pozitivno pa IHC negativna ali tedensko (1+) pozitivnih tumorjev ni imela koristi od trastuzumaba. Zato je uporaba FISH ali SISH kot primarni in edini način ni priporočljivo v Evropi in IHC še vedno šteje kot glavni način ocenjevanja v številnih državah.
Kolikor nam je znano, pa ni študije, ki neposredno primerjavo rezultatov obeh imunohistokemično (IHK) in srebra in situ hibridizacijo (SISH), ko je vsaka uporabljena ločeno z rezultati, ki jih uporabljajo v kombinaciji na enem odseku v želodcu karcinomov. Za vizualizacijo RNK in DNK cilje in situ, obstajajo različni načini sond označevanje uporabo fluorescence, kromogeno ali srebrno odkrivanje. Vse prejšnje študije z nastavitvami primerljive z našo analizo uporabljajo kromogenske ali fluorescenčna in situ hibridizacija (CISH ali FISH). Padce-Kelly et al. [14] kombinirana standardna IHC z odlaganjem kovinskega srebra, ki ga EnzMetTM na mikromrež tkiva (TMA) od karcinomov dojke in primerjali rezultate IHC in fluorescenčne hibridizacije in situ (FISH), ko opravljajo sami. V drugi študiji so avtorji dejansko uporabili kombinacijo IHC in srebro v situ hibridizacija (SISH) v TMA dojke in vzorcev z rakom želodca, vendar je v primerjavi z rezultati, dobljenimi z IHC in fluorescence in situ hibridizacija (FISH) kot enotnega obarvanje [16]. Reisenbichler sod. [15] poroča rezultate primerjave IHC in kromogenske in situ hibridizacije (CISH) z enojnimi stainings z dvojnim testom IHC /CISH. Hkratno vrednotenje beljakovin in genskih kombinacij na enem diapozitivu ponudil visoko ponovljivo in zelo robustno metodo z dobrimi soglasij.
Za preverjanje veljavnosti novega gena /proteina barvanjem v primerjavi s standardnim IHC in SISH so bili izračunani Skladnosti glede na koeficient kapa. V skladu s smernicami ASCO /SKP za raka na dojki, je treba nov preizkus pokaže več kot 95% skladnost z validirano referenčno testu [23]. V naši raziskavi je nova metoda pokazala soglasij nad 95%, izraženo v vseh testnih rezultatov. Tam so bili zelo dobri Skladnosti v rezultatih genov pomnoževanja ter ocena 0 (vsaka s 100% soglasjem), točkovanje 1+ (98,96% sporazum) in točkovanje 3+ tumorskih vzorcev (96,88% sporazum). Primeri z rezultatom 2+ pokazala manj skladnih rezultatov, čeprav je še vedno dobra (95,83% sporazum). Težave pri primerih z zmerno izražanja v oceno in razvrstitev so znani v literaturi. Tafe sod. [24]. je pokazala, da so bile težave pri dodeljevanju končni rezultat pri oceni IHC zaradi pomanjkanja v zanesljivo ločevanje primerih z rezultatom HER2 1 + ali 2 +. Te kategorije se lahko omeji s subjektivnostjo in slabe ponovljivosti. Pojav, da se upoštevajo neskladne rezultate pri bolnikih z nizko izražanja HER2, ki včasih še imajo amplifikacijo gena HER2, so poročali v raka na požiralniku [24-26]. Najverjetnejši razlog za to neskladje je znotraj tumorja heterogenost statusa HER2 želodčnega ali gej raka [17, 27, 28]. V naši raziskavi smo v štirih bolniki neskladne rezultate IHC, ki pa so privedle do klinično pomembnih razlik v HER2 pozitivnosti v enem bolniku samo (# pacient 1057). Bolnik je imel raka na želodcu razpršeno tipa. Zdi se, da je težje kot tumorji črevesne tipa [29, 30] Ovrednotenje razpršenih tumorjev. Po Rüschoff et al. [18]. le 5% teh tumorjev kažejo HER2-pozitivnosti; pečatni prstan karcinoma so negativni. HER2 ojačanje je zelo redka difuzni raka želodca, ki je povezana z nenormalnim E-kadherina izražanja [13, 31-33].
SISH je relativno nova metoda za odkrivanje pomnoževanje gena HER2. Številne študije so potrdile visoko skladnost z drugo v situ metode hibridizacije kot CISH in FISH [34]. V primerjavi z imunohistokemijo, ISH kaže večjo občutljivost in specifičnost in višjo ponovljivost. Ta izjava se lahko potrdi s primerjavo mora biti skladnost pomnoženih primerov v naših metodah. Rezultati so pokazali zelo dobro ujemanje med obema metodama (100,0%; к = 1). Poleg tega je ISH je manj občutljiva kot IHC zaradi relativno stabilnost DNA v primerjavi z razlikami v tkiva posnetka in predelavi.
Trenutno delamo na razširjeni študiji oceni, ali je ta nova metoda, povezane z zmanjšanjem medsebojne opazovalca variabilnost pri določanju statusa HER2 pri raku želodca. Ta študija vsebuje tudi komponento videti v času, ki je potreben za poročanje končne rezultate. Rezultati bodo predloženi v reviji kot črka ali izvirno poročilo, takoj ko so na voljo.
Sklepe
V tej študiji smo jasno pokazali, da uporabi kombiniran način za opravljanje HER2 beljakovin izražanja in amplifikacijo gena na enem diapozitivu lahko rezultati, podobne tistim, ki uporabljajo vsako metodo posebej v nadzorovani študiji o izvajanju treh neodvisnih opazovalcev. Vsi avtorji prebrali in potrdil končni rokopis.

• Dolgoročni učinki laparoskopsko rokav želodca v primerjavi Roux-en-Y želodčni bypass za zdravljenje kitajski tip bolnikov z diabetesom 2 boleznijo z indeksom telesne mase 28-35 kg /m2
• Polimorfizem TGFB1 in VEGF genov in preživetje bolnikov z rakom želodca