Die Validierung eines neuen Verfahrens sowohl HER2 Immunhistochemie und HER2 Dual-Farbe Silber in-situ-Hybridisierung auf einer Folie für Magenkarzinom Tests kombiniert

Die Validierung eines neuen Verfahrens sowohl HER2 Immunhistochemie und HER2 Dual-Farbe Silber in situ Hybridisierung
auf einer Folie für Magenkarzinom Test
Zusammenfassung
Hintergrund
HER2-Status Beurteilung kombiniert, ist eine Voraussetzung für die Schaffung von eine geeignete Behandlungsstrategie bei Magenkrebs. Magenkrebs sind sehr heterogen und getrennte Bewertungen von Gen-Amplifikation und Protein-Expression führen zu Unsicherheiten in verschiedenen Klone lokalisiert und sind zeitaufwendig. Diese Studie bewertet die Äquivalenz des neuen Verfahrens sowohl Gen und Protein-Plattformen auf einer Folie zu kombinieren.
Methoden
Immunhistochemie (IHC) und HER2 Dual-Farbe Silber in-situ-Hybridisierung (SISH) als Einzelverfahren (IHC /SISH) und Gen-Protein-Plattform, beide Verfahren auf einer Folie (Gen /Protein) kombiniert wurden in zufällig gesammelt 100 Fälle von Adenokarzinom des Magens durchgeführt. Ergebnisse von IHC /SISH mit Gen /Proteinfärbung verglichen wurden.
Ergebnisse
96 von 100 Proben waren bewertbar. Im Gen /Protein-Färbung wurden Pathologen können Gen-Amplifikation und damit die Proteinexpression auf Einzelzellebene zu beurteilen. (; Kappa-Koeffizient κ = 1,0 Vereinbarung 100%) im Vergleich Studien Genamplifikation wurde in 14,6% sowohl konventionelle SISH und Gen /Protein-Plattform beobachtet. Die Proteinexpression Scores von IHC waren 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+) und 9,4% (3+). Die Protein-Expression von Gen /Protein-Methode waren: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) und 10,4% (3+) der Patienten. Es gab vollständige Konkordanz in IHC Beurteilung der Fälle mit Score 0 (100,0%; κ = 1). Hohe Konkordanzen sind in der Partitur gezeigt 1+ (98,96%; κ = 0,947) und 3+ (96,88%; κ = 0.825) Fälle und gute Konkordanz in 2+ Fällen (95,83%; κ = 0,728).
Schlussfolgerungen
Diese neue gemeinsame Plattform hat den Vorteil, dass sie sowohl Gen und das Protein-Status in der gleichen Krebszelle zu bewerten und von besonderem Interesse für die Forschung und Patientenversorgung sein kann. Artikel Kategorie
Krankheit Biomarker
.
Keywords Magenkrebs HER2 Immunohistochemistry Silber in situ Hybridisierung Gene-Proteinassay Background
Der HER2-Onkogen
(auch bezeichnet als HER2 /neu oder ErbB-2) auf dem Chromosom 17q21, kodiert für ein 185-kD Transmembran-Tyrosin-Kinase-Rezeptor, gehört zu der epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) -Familie von EGFR /HER1, HER2, HER3 und HER4 umfasst. HER2-Aktivierung spielt eine zentrale Rolle bei der Zellproliferation und Überlebens vermittelte weitgehend durch den RAS-MAPK Signalweg. Es hemmt auch den Zelltod durch die Phosphatidylinositol 3'-Kinase-AKT-mammalian target of Rapamycin (mTOR) Weg. HER2-Überexpression wurde in einer Vielzahl von soliden Tumoren berichtet [1-7]. Gene Amplifikationen sind selten bei anderen Krankheiten und Anti-HER2-Therapie derzeit überprüft wird nur in Brust- und Magenkrebs.
Basierend auf den Ergebnissen der ToGA Studie [8], Trastuzumab wurde für metastasiertem Adenokarzinom des Magens und des gastroösophagealen Übergang genehmigt Kombinationstherapie in den USA und Europa. Voraussetzung ist der Nachweis von HER2-Überexpression. In Europa wird dies durch ein IHC 3+ Ergebnis oder einem IHC definiert 2+ und FISH-positiv oder SISH Ergebnis (Verhältnis ≥ 2,0). IHC wurde die primäre Methode, weil IHC negativ oder wöchentlich als positiv bewertet (1+) Patienten von Trastuzumab in der ToGA Studie nicht profitieren, obwohl sie ISH positiv waren. In der Literatur gibt es jedoch erhebliche Unterschiede in der immunhistochemischen Positivität bestimmt. Hier variiert der Prozentsatz von HER2-positivem fortgeschrittenem Magen Adenokarzinome von Studie zu Studie, von 5% bis 30% [9], höchstwahrscheinlich aufgrund unterschiedlicher Analyseprotokolle und Interpretationskriterien.
Prospective Substudien von zwei der adjuvante randomisierten Studien von Trastuzumab gegen Null bei Brustkrebs gezeigt, dass etwa 20% der HER2-Assays bei vor-Ort-Institutionen durchgeführt (an der primären Pathologie-Abteilung des Behandlungsstelle) nicht korrekt waren, wenn die gleiche Probe neu bewertet wurde in einem hohen Volumen, Zentrallabor [10, 11 ].
im Gegensatz zu Brustkrebs ist die Histopathologie von Magenkrebs in Bezug auf HER2 als heterogener und fokale Überexpression von Gen-Amplifikation zu sein, wird häufig beobachtet [12]. Daher werden Schwierigkeiten bei der HER2-Status die voraussichtlich stärker ausgeprägt zu sein als bei Brustkrebs. Insgesamt belegen diese Ergebnisse berücksichtigt, zuverlässiger, reproduzierbarer und zeitsparenden Verfahren für den HER2-Status in Magenkrebs Beurteilung erforderlich sind. Nur wenige veröffentlichte Studien IHC und in-situ-Hybridisierungsverfahren kombiniert (aber nicht SISH) auf einer Folie durchgeführt wurden [13-16]. Thesen Studien Standard IHC eingesetzt und chromogene oder Fluoreszenz in situ Hybridisierung (CISH oder FISH) als einzelne Methoden und verglichen sie mit einer gleichzeitigen Analyse (auf einer Folie kombiniert) und fand eine gute Übereinstimmung mit den Ergebnissen der einzelnen Färbung. Zu bestem Wissen, jedoch gibt es keine Studien, die direkt Ergebnisse beider Immunhistochemie (IHC) zu vergleichen, und Silber in situ-Hybridisierung (SISH), wenn jeweils getrennt mit den Ergebnissen der mit ihnen in Kombination auf einem einzigen Abschnitt in Magen verwendet wird Karzinome. in der vorliegenden Studie wurde das HER2-Protein-Expression und Genamplifikation Status von 100 Magen-Adenokarzinome und Karzinomen des gastroösophagealen Übergang
wurden durch herkömmliche IHC und ISH einzelnen Methoden (IHC /SISH) und parallel nach dem neuen Verfahren untersucht die Kombination beide Verfahren (Gen /Protein). Das Ziel dieser Studie war es, die Äquivalenz des neuen Gens-Protein-Plattform im Vergleich zu den einzelnen Methoden zu bewerten.
Methoden
Patienten und Gewebeproben
Formalin-fixierte Paraffin eingebettete (FFPE) Tumorproben von 100 Patienten mit einem Adenokarzinom des Magens oder gastroösophagealen Übergang wurden von einer Gewebe Archiv von Proben am Institut für Pathologie am Krankenhaus Nordwest ausgewählt. Das Projekt wurde mit der Genehmigung der zuständigen Ethikkommission durchgeführt. Für jeden Fall wurden vier verschiedene Färbungsmethoden werden entsprechend den Hersteller FDA-genehmigten Verfahren: Hämatoxylin und Eosin (H & E) die Probe Angemessenheit zu beurteilen und die histologischen Subtyp, Immunhistochemie (IHC), um zu bestätigen das HER2-Protein zu bewerten Expression, Silber in situ-Hybridisierung (SISH), um die Gen-Amplifikation und das neue Gen-Protein-Plattform zu bewerten, die auf einer Folie IHC und SISH verbindet.
Immunohistochemistry
IHC wurde mit der FDA-zugelassenen Ventana PATHWAY rabbit monoklonaler Antikörper durchgeführt, 4B5 Klon und mit dem Ultra DAB Detection Kit (Ventana) auf einem BenchMark XT automatisiert Stainer (Ventana, Tucson, AZ). 100 ° C und dann mit dem Anti-HER2 primären Antikörper inkubiert - Die Gewebeschnitte wurden mit EZ Prep bei 75 ° C und 76 ° C, Wärme vorbehandelte in Cell Anlage 1 (CC1) zur Antigen-Retrieval bei 76 ° C entparaffiniert kurz, 16 min bei 37 ° C nach der Inaktivierung der endogenen Peroxidase unter Verwendung von UV-Inhibitor für 4 min bei 37 ° C. Die Objektträger wurden mit einem sekundären Antikörper, gefolgt von der Anwendung von HRP Universal-Multimer für 8 min inkubiert. Antikörper wurden mit Chromogen (für 38 min) nachgewiesen. Vor der Montage wurden die Objektträger mit Hämatoxylin II für 4 min und Bläu- Reagenz für 4 min gegengefärbt. Um die Gültigkeit der Färbung unterstützen und experimentelle Artefakte zu identifizieren, eine positive Kontrolle wurde in jedem Durchlauf.
Silber in-situ-Hybridisierung
Doppelfarbe SISH wurde nach dem INFORM HER2 Dual-ISH DNAProbe Cocktail durchgeführt und Ultra SISH DNP Detection Kit /Ultra RED ISH DIG Detection Kit für HER2 und Chr 17 Quantifizierung und Verfahren (Ventana /Roche). Beide Sonden wurden mit 2,4-Dinitrophenol (DNP) und Digoxigenin (DIG) markiert. Die Gewebeschnitte wurden mit EZ Prep bei 65 ° C-76 ° C und Wärme vorbehandelt mit EZ Prep-verdünnten Zell Conditioner 2 (CC2) bei 90 ° C, gefolgt von Protease-Verdau mit ISH Protease 3 für 16 min bei 37 ° C entparaffiniert. Die genomische DNA Gewebeschnitten und die Nick-Translation-HER2 und Chr 17 Sonden wurden co-denaturiert durch Wärmebehandlung für 20 min bei 80 ° C durch einen Hybridisierungsschritt bei 44 ° C für 6 h folgte. Die HER2-Signale wurden für 20 min bei 37 ° C und 16 min mit einem HRP-konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper inkubiert Antikörper Kaninchen-anti-DNP nachgewiesen unter Verwendung von bei 37 ° C nach drei 8 min Stringenz Wäschen. Das Signal wurde als Silberlagerstätten mit Silberacetat, Hydrochinon und Wasserstoffperoxid nachgewiesen. 17 Chr Detektion wurden die Objektträger mit Maus-anti-DIG-Antikörper für 20 min bei 37 ° C und mit einem AP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-Antikörper für 24 min bei 37 ° C inkubiert. Der 17 Chr Signal wurde mit schnell rot und Naphtholphosphat als roter Punkt Färbung entwickelt. Die Objektträger wurden schließlich mit Hämatoxylin II und Bläu- Reagenz vor der Montage.
Gene /Protein
Gene /Protein-Plattform kombiniert IHC und SISH auf einer Folie gegengefärbt. Um die Gültigkeit der Färbung unterstützen und experimentelle Artefakte zu identifizieren, eine positive Kontrolle wurde in jedem run.For HER2-Protein-Färbung enthalten und für HER2 /Chr 17 Hybridisierung der iVIEW DAB Detection Kit und Ultra Nachweis-Kits verwendet wurden. Die Proben wurden unter mehreren Assaybedingungen gefärbt eine optimale Protokoll zu implementieren, benötigt IHC /SISH Färbeergebnisse zu Test diejenigen einzelner IHC und SISH vergleichbar zu erzielen. Die Optimierung wurde im Labor von Ventana (Roche) und teilweise in eigenen Arbeiten durchgeführt. Optimale Ergebnisse wurden durch die Durchführung der IHC-Verfahren vor dem SISH Verfahren erreicht.
Die Proben wurden entparaffiniert mit EZ Prep bei 72 ° C in 6 Zyklen. Für HER2-Protein-Färbung wurden die Gewebeschnitte Wärme für Antigen-Retrieval bei 95 ° C in CC1 vorbehandelt und dann mit dem Anti-HER2 primärem Antikörper bei 37 ° C für 48 min nach der Inaktivierung der endogenen Peroxidase unter Verwendung von UV-Inhibitor für 4 min inkubiert bei 37 ° C. Die Objektträger wurden mit einem biotinylierten sekundären Antikörper, gefolgt von der Anwendung von HRP-konjugiertes Streptavidin für 8 min inkubiert. Eine Kupfer verbesserte DAB-Reaktion wurde verwendet, um das Protein sichtbar zu machen. Für HER2-Gens und 17 CHR Färbung wurden die Proben wärme vorbehandelt mit EZ-Prep verdünnt CC2 bei 90 ° C für vier Zyklen durch Protease-Verdau folgte mit ISH Protease 2 für 12 min bei 37 ° C. mit einem Cocktail von DNP und DIG-markierten Sonden Die Sonden wurden für 4 min bei 80 ° C denaturiert und für 6 h bei 44 ° C hybridisiert. HybClear Lösung wurde hinzugefügt, um die Wechselwirkung zwischen dem DNP und dem DAB Ablagerung während der Hybridisierung zu blockieren. Die Gen-Signale wurden für 16 min bei 37 ° C und 16 min mit einem HRP-konjugierten Ziegen-anti-Kaninchen-Antikörper inkubiert Antikörper Kaninchen-anti-DNP nachgewiesen unter Verwendung von bei 37 ° C nach vier 8 min Stringenz Wäschen. Das Signal wurde durch die Silber-Lagerstätte mit Silberacetat, Hydrochinon und Wasserstoffperoxid entwickelt. 17 Chr Detektion wurden die Objektträger mit Maus-anti-DIG-Antikörper für 16 min bei 37 ° C und mit einem AP-konjugiertem Ziegen-anti-Maus-Antikörper für 24 min bei 37 ° C inkubiert. Der 17 Chr Signal wurde mit schnell rot und Naphtholphosphat als roter Punkt Färbung entwickelt. Vor der Montage wurden die Objektträger mit Hämatoxylin II für 8 min und Bläu- Reagenz für 4 min gegengefärbt.
Pathologie
Die Proben unabhängig von einem Pathologen interpretiert wurden (AB) und Biologe bei Magenkrebs Histologie trainiert (DW). Die Beobachter erhielten die Proben zufällig, das heißt SISH, IHC, und kombinierte Verfahren wurden in Verbindung miteinander, aber separat für jeden Patienten nicht ausgewertet. Konsens beider Rezensenten wurde nach jeder Auswertung gefunden. Da diskordanten Ergebnisse zwischen den beiden Methoden kann ein Ergebnis von intra-observer Variabilität und nicht als Unterschiede in der Qualität der Färbung, diskordanten Fällen durch einen dritten Beobachter neu bewertet wurden, die auf die Ergebnisse der ersten Auswertung geblendet wurde, sondern bewertet die diskordanten Fälle (Methoden) in Verbindung miteinander. Schließlich Konsens wurde zwischen dem dritten Beobachter und den primären Beobachter etabliert.
Die Ergebnisse IHC interpretiert wurden die Bewertungsschema verwendet für Magenkrebs von Hofmann vorgeschlagen et al. [17] und Rüschoff et al. [18]: 0, keine Reaktivität oder membranartige Reaktivität in < 10% der Tumorzellen; 1+, schwach /kaum wahrnehmbare membranöse Reaktivität in > 10% der Tumorzellen; 2+, schwach vollständig, seitlich oder basolateralen membranöse Reaktivität in >bis mäßig; 10% der Tumorzellen; und 3+, stark vollständig, seitlich oder basolateralen membranöse Reaktivität bei ≥ 10% der Tumorzellen.
SISH Ergebnisse, die Gesamtzahl der HER2 und Chromosom 17 Signale wurden in mindestens 20 Tumorzellkerne in zwei verschiedenen Bereichen gezählt. Die HER2 /Chr 17-Verhältnisse wurden in Übereinstimmung mit dem ToGA FISH Bewertungsschema zur Behandlung von HER2-Tests in Magen- und gastro-Kreuzung (GEJ) Krebs wie folgt interpretiert: < 2.0, HER2-Gen nicht verstärkt; ≥ 2,0, HER2-Gen amplifiziert [17]. Eine durchschnittliche Zählung von sechs oder mehr wurde als verstärkt betrachtet.
Statistische Analyse
Die Analyse wurde explorative ohne vordefinierte Hypothese oder Stichprobengröße Berechnungen. Die Zahl von 100 Patienten wurden als ausreichend angesehen, die vorgeschlagenen statistischen Tests durchzuführen. Die Korrelationen zwischen IHC /SISH und Gen /Protein wurden unter Verwendung von Cohen's kappa-Koeffizient (к) geschätzt. Die Kappa-Wert Interpretation von Altmann [19] wurde verwendet: к > 0,81, eine sehr gute Übereinstimmung; 0,61-0,80, gute Übereinstimmung; 0,41-0,60 moderate Vereinbarung; 0,40-0,21, faire Vereinbarung; ≪ 0,20, eine geringe Übereinstimmung. Statistische Analysen wurden mit WinStat Software durchgeführt (R.Fitch Software, Version 2009.1).
Ergebnisse

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