Validácia novej metódy kombinujúce oba HER2 imunohistochémia a HER2 dual-farba strieborná in situ hybridizácia na jednom snímku za karcinómu žalúdka testing

validáciu nový spôsob kombinujúci oba HER2 imunohistochémia a HER2 dual-farba strieborná in situ hybridizácia
na jednom šmykľavka pre žalúdočné testovanie karcinómu
abstraktné
pozadia
hodnotenie stavu HER2 je nevyhnutným predpokladom pre vytvorenie vhodnej stratégie liečby rakoviny žalúdka. Žalúdočné rakoviny sú veľmi rôznorodé a nezávislé vyhodnotenie amplifikácie génov a proteínov expresie vedie k neistotám v lokalizácii odlišnej klony a sú časovo náročné. Táto štúdia hodnotí rovnocennosť s novou metódou kombinujúci obe génov a proteínov platforiem na jednom snímku.
Metódy
imunohistochémia (IHC) a HER2 dual-farba strieborná in situ hybridizácia (Sish) ako jedinej metódy (IHC /Sish) a gén-proteín platforma kombináciou oboch metód na jednej snímke (gén /proteín) sa vykonávali na náhodne odobratých 100 prípadov adenokarcinóme žalúdka. Výsledky IHC /Sish boli porovnávané s farbením gen /proteín.
Výsledky
96 zo 100 vzoriek bolo vyhodnotiť. V farbenie gén /proteín, patológovia boli schopní posúdiť amplifikáciu génu a následné expresie proteínu na úrovni jednotlivých buniek. V porovnaní štúdiách amplifikácia génu bola pozorovaná u 14,6%, ako konvenčné Sish a proteín /gén platformy (Dohoda o 100%, Kappa-koeficient κ = 1,0). Expresia proteínu skóre podľa IHC bola 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+) a 9,4% (3+). Expresie proteínu metódou gén /proteín boli: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) a 10,4% (3+) pacientov. Tam boli kompletné konkordancia v posudzovaní IHC prípadov sa skóre 0 (100,0%; κ = 1). Vysoké konkordancia sú uvedené v skóre 1+ (98,96%; κ = 0,947) a 3+ (96,88%; κ = 0,825) prípady, and Good konkordancia v 2+ prípadoch (95,83%; κ = 0,728).
Závery
Tento nový kombinovaný platforma má tú výhodu, že je schopný vyhodnotiť aj gén a stav proteínu v rovnakej nádorové bunky a môžu byť obzvlášť zaujímavé pre výskum a pacienta starostlivosti.
Článok kategórii
chorôb biomarkerov.
kľúčové slová
rakovina žalúdka HER2 imunohistochémia striebro in situ hybridizácia Gene-proteínové testovacie pozadia
HER2 onkogén (označovaný aj ako HER2 /neu alebo ErbB-2) na chromozóme 17q21, kóduje transmembránový receptor tyrozínkinázy je 185 kD, ktorý patrí do rodiny epidermálneho rastového faktora (EGFR), pozostávajúce z EGFR /HER1, HER2, HER3, a HER4. Aktivácia HER2 zohráva ústrednú úlohu v bunkovej proliferácii a prežitie, z veľkej časti sprostredkovaná cez RAS-MAPK. To tiež zabraňuje bunkovej smrti prostredníctvom fosfatidylinozitol 3'-kinázy AKT-cicavčie cieľ rapamycínu (mTOR). Zvýšená expresia HER2 bola hlásená v rôznych pevných nádorov [1-7]. Génovej amplifikácie sú zriedkavé u iných chorôb a anti-HER2 terapia je v súčasnej dobe overený len v prsníku a karcinómov žalúdka.
Na základe výsledkov Toga štúdie [8] Na, trastuzumab bol schválený pre metastatický adenokarcinóm žalúdka a gastroezofageálneho spojenia v kombinovaná terapia v Spojených štátoch a Európe. Požiadavka je dôkazom zvýšenej expresie HER2. V Európe, to je definovaný IHC 3+ výsledkom alebo IHC 2+ a pozitívnom výsledku FISH alebo Sish (pomer ≥ 2,0). IHC bola považovaná za primárny metódou, pretože IHC negatívne alebo pozitívne týždenne (1+) pacientov nemala prospech z trastuzumabu v procese Toga, hoci oni boli ISH pozitívne. V literatúre je však existuje značná variácia v imunohistochemické pozitivity určené. Tu je percento HER2 pozitívne pokročilých žalúdočných adenokarcinómov sa líši od štúdie na štúdium, od 5% do 30%, [9], s najväčšou pravdepodobnosťou v dôsledku rôzne protokoly pre analýzu a kritérií s interpretáciou.
Prospektívnej substudies z dvoch adjuvans randomizovaných štúdiách trastuzumab oproti nil pri karcinóme prsníka preukázali, že približne 20% HER2 testoch vykonaných v inštitúciách na mieste (na oddelenie patológie pri liečbe webe primárneho podmienok) boli nesprávne, keď rovnaký vzorka bol prehodnotené vo vysokom objeme, centrálne laboratórium [10, 11 ].
na rozdiel od rakoviny prsníka, histopatológie rakoviny žalúdka, pokiaľ ide o HER2 je považovaný za viac heterogénne a fokálnej nadmerná expresia génové amplifikácie je často pozorovaný [12]. Z tohto dôvodu, ťažkosti pri určovaní stavu HER2 by mali byť výraznejšie ako u karcinómu prsníka. Celkovo možno povedať, vzala tieto výsledky do úvahy, sú potrebné viac spoľahlivé, reprodukovateľné a čas šetriace metódy pre hodnotenie stavu HER2 u karcinómu žalúdka. Len málo publikovaných štúdií kombinujúci IHC a in situ metódami hybridizácie (ale nie Sish) na jednej snímke boli vykonané [13 až 16]. Téza štúdie využité štandardné IHC a chromogénne alebo fluorescenčnej hybridizácie in situ (FISH) CISH alebo ako jednotlivé metódy a ich porovnanie so súčasným analýzy (v kombinácii na jeden snímok) a nájdené dobrú zhodu s výsledkami z jediného farbenie. Podľa našich najlepších vedomostí, ale neexistujú žiadne štúdie, ktoré sa priamo porovnať výsledky oboch imunohistochémia (IHC) a striebra in situ hybridizácia (Sish), keď každý z nich je použitý samostatne s výsledkami ich použitie v kombinácii v jedinom úseku v žalúdku karcinómy.
v tejto štúdii sa HER2 expresie proteínu a amplifikácia génu stav 100 žalúdočných adenokarcinómy a karcinómy esophagogastric križovatky boli skúmané konvenčné IHC a ISH jednotlivých metód (IHC /Sish) a paralelne s novou metódou kombinujúci obe metódy (gén /proteín). Cieľom tejto štúdie bolo vyhodnotiť rovnocennosť nového génu proteínu platformy v porovnaní jednotlivých metód farbenia.
Metódy
Pacienti a vzorky tkaniva
formalínu fixované do parafínu vložené vzorky nádorov (FFPE) zo 100 pacientov s žalúdočnými alebo gastroezofageálneho spojenia adenokarcinóm boli vybrané z archívu tkanív vzoriek v ústave patológie na Krankenhaus Nordwest. V rámci projektu bola vykonaná so súhlasom zodpovedného etického výboru. Pre každý prípad, boli použité štyri rôzne metódy farbenia podľa výrobcu sa FDA postupy: hematoxylínom a eosínu (H &E) pre hodnotenie vzorky primeranosti a potvrdiť histologický podtyp, imunohistochémia (IHC), pre vyhodnotenie proteínu HER2 výraz, striebro in situ hybridizácia (Sish) pre vyhodnotenie amplifikáciu génu a nový gén proteínu platformu, ktorá kombinuje IHC a Sish na jednom snímku.
Imunohistochémia
IHC bola vykonaná s FDA Ventana PATHWAY králičie monoklonálne protilátky 4B5 klon as UltraView DAB Detection Kit (Ventana) na benchmark XT automatizovaného nešpiniaca (Ventana, Tucson, AZ). Stručne, tkanivové rezy boli zbavené voskov s EZ Prep pri teplote 75 ° C a 76 ° C, teplo predbežne in Cell Conditioning 1 (CC1) pre získanie antigénu pri 76 ° C - 100 ° C, a potom inkubované s primárnou protilátkou anti-HER2 pre 16 min pri teplote 37 ° C po inaktivácii endogénnej peroxidázy za použitia UV-inhibítorom po dobu 4 minút pri teplote 37 ° C. Sklíčka bola inkubovaná so sekundárnou protilátkou s následným použitím HRP Univerzálny multimer počas 8 min. Protilátky boli zistené pomocou chromogén (pre 38 min). Pred montážou, rezy boli kontrastne farbené hematoxylínom II po dobu 4 minút a zmodranie činidlá po dobu 4 minút. Na podporu platnosti farbenie a identifikovať experimentálne artefakty, pozitívna kontrola bola zahrnutá v každom cykle.
Silver in situ hybridizácia
dvojfarebný Sish bola vykonaná v súlade s inform HER2 Dual ISH DNAProbe koktail a Kit UltraView Sish DNP Detection /Ultraview RED ISH DIG Detection Kit pre HER2 a Chr 17. kvantifikáciu a riadenie (Ventana /Roche). Obe sondy boli značené s 2,4-dinitrofenol (DNP) a digoxigeninem (DIG). Sklíčka tkanivá boli zbavené voskov s EZ Prep pri teplote 65 ° C-76 ° C a zahrieva sa vopred ošetrí EZ Prep-zriedeného Cell kondicionér 2 (CC2) pri 90 ° C, s následným štiepením proteázou s ISH proteázy 3 po dobu 16 minút pri teplote 37 ° C. Genómovej DNA úseky tkaniva a nick-preložené HER2 a Chr 17 sondy boli spoločne denaturované tepelným spracovaním po dobu 20 minút pri 80 ° C s následným hybridizačný krok po dobu 6 hodín pri 44 ° C. HER2 signály boli detekované s použitím králičie anti-DNP protilátky po dobu 20 minút pri teplote 37 ° C a inkubované s HRP-konjugovanou kozí anti-králičí protilátkou počas 16 minút pri teplote 37 ° C po troch 8 min prísnosti prania. Signál bol detekovaný ako ložísk striebra s octan strieborný, hydrochinónu a peroxidu vodíka. Pre Chr 17 detekcie bola sklíčka inkubovaná s myšou anti-DIG protilátky po dobu 20 minút pri teplote 37 ° C a s AP-konjugovanou kozí anti-myší protilátky po dobu 24 minút pri teplote 37 ° C. CHR 17 Signál bol vyvinutý ako red dot farbenie s rýchlym červeným a naftol fosfátu. Sklíčka bola nakoniec kontrastne hematoxylínom II a zmodranie činidlo pred montážou.
Protein /gén
platforma Gene /proteín kombinujúci IHC a Sish na jednom snímku. K podpore platnosť farbenie a identifikovať experimentálne artefakty, pozitívna kontrola bol zaradený do každej farbenie run.For proteínu HER2 a HER2 /Chr 17 hybridizácii boli použité Kit iView DAB Detection a UltraView detekcie súpravy. Vzorky boli zafarbené za niekoľko testovacích podmienok realizovať optimálne protokol potrebný na dosiahnutie výsledkov IHC /Sish farbenie porovnateľné s individuálnou IHC a Sish testovanie. Optimalizácia sa vykonáva v laboratóriu Ventana (Roche) a čiastočne na vlastnú prácu. Optimálne výsledky boli dosiahnuté vykonaním postupu IHC pred zákrokom Sish.
Vzorky boli zbavené voskov s EZ Prep pri teplote 72 ° C v 6 cykloch. Na farbenie proteínu HER2, tkanivové rezy boli tepelne vopred v CC1 pre získanie antigénu pri 95 ° C a potom inkubované s primárnou protilátkou anti-HER2 pri teplote 37 ° C počas 48 minút po inaktivácii endogénnej peroxidázy za použitia UV-inhibítorom po dobu 4 min pri teplote 37 ° C. Sklíčka bola inkubovaná s biotinylizované sekundárnou protilátkou s následným použitím HRP-konjugovaným streptavidínom počas 8 min. Medi zvyšuje DAB reakcie bol použitý pre vizualizáciu proteínu. Pre HER2 génu a CHR 17 farbenie, vzorky boli tepelne ošetrené EZ Prep-zriedeného CC2 pri teplote 90 ° C počas štyroch cyklov nasleduje štiepenie proteázou s ISH proteázy 2 za 12 minút pri teplote 37 ° C. Sondy boli denaturované počas 4 minút pri teplote 80 ° C a hybridizovány po dobu 6 hodín pri 44 ° C za použitia kokteilu DNP- a DIG-značených sond. HybClear roztok sa pridá k blokovať interakciu medzi DNP a uloženie DAB v priebehu hybridizácie. Génové signály boli detekované s použitím králičie anti-DNP protilátky po dobu 16 minút pri teplote 37 ° C a inkubované s HRP-konjugovanou kozí anti-králičí protilátkou počas 16 minút pri teplote 37 ° C po štyroch 8 min prísnosti prania. Signál bol vyvinutý strieborných nálezísk s octan strieborný, hydrochinónu a peroxidu vodíka. Pre Chr 17 detekcie bola sklíčka inkubovaná s myšou anti-DIG protilátky po dobu 16 minút pri teplote 37 ° C a s AP-konjugovanou kozí anti-myší protilátky po dobu 24 minút pri teplote 37 ° C. CHR 17 Signál bol vyvinutý ako red dot farbenie s rýchlym červeným a naftol fosfátu. Pred montážou, šmykľavky boli kontrastne hematoxylínom II po 8 minút a zmodranie činidlo pre 4 min.
Recenziu Patológia
Vzorky boli nezávisle interpretovaná patológom (AB) a biológ vyškoleným v žalúdku histológia rakoviny (DW). Pozorovatelia dostali vzorky náhodne, tj. Sish, IHC a kombinovaná neboli hodnotené v spojení spolu navzájom, ale zvlášť pre každého pacienta. Zhoda oboch recenzentov bol nájdený po každom vyhodnotení. Vzhľadom k tomu, nesúhlasné výsledky oboch metód môže byť výsledkom variabilite medzi pozorovateľa skôr než rozdiely v kvalite farbenie, nesúhlasné prípady prehodnotené tretej pozorovateľa, ktorý bol oslepený na základe výsledkov prvého hodnotenia, ale hodnotené nesúhlasné prípady (metódy) v spojení s ostatnými. A konečne, konsenzus vznikla medzi tretím pozorovateľom a primárnych pozorovateľov.
Výsledky IHC boli interpretované pomocou skórovacej systém navrhnutý pre rakovinu žalúdka tým, Hofmann a kol. [17] a Rüschoff et al. [18]: 0, žiadna reaktivita alebo reakcia na membráne < 10% nádorových buniek; 1+ Slabé /ťažko rozoznateľné reakcie na membráne u > 10% nádorových buniek; 2+, slabý až stredne kompletné, bočné alebo basolateral reakcie na membráne > 10% nádorových buniek; a 3+, silný kompletné, bočné alebo bazolaterální reakcie na membráne ≥ 10% nádorových buniek. Br &Sish výsledky, celkové počty HER2 a chromozómu 17 signály boli počítané v najmenej 20 nádorových bunkových jadier v dvoch rôznych miestach. Pomery HER2 /Chr 17 boli interpretované v súlade s Toga FISH bodovacieho systému pre testovanie HER2 v žalúdku a gastroezofageálneho spojenia (ġej) karcinómu takto: < 2.0, HER2 gén amplifikovaný nie je; ≥ 2,0, HER2 gén amplifikovaný [17]. Priemerný počet šiestich alebo viac bolo považované za zosilnený.
Štatistická analýza
Analýza bola explorativní bez preddefinovaných výpočty veľkosti hypotézy alebo vzoriek. Celkový počet 100 pacientov bolo považované za dostatočné na vykonanie navrhovaných štatistické testy. Korelácia medzi IHC /Sish a proteín /gén sa odhadli pomocou Cohen 's kappa koeficient (к). Výklad kappa hodnoty podľa Altmann [19] bol použitý: к > 0,81, veľmi dobrá zhoda; 0,61 - 0,80, dobrá zmluva; 0,41-0,60 mierne dohody; 0,40 - 0,21, spravodlivé dohody; ≪ 0,20, mierne dohody. Štatistické analýzy boli vykonané pomocou softvéru WinStat (R.Fitch Software, verzia 2009.1).
Výsledky
charakteristiky pacienta
deväťdesiatich šiestich prípadov 100 pacientov bolo vyhodnotiť. Jeden prípad bol vylúčený z dôvodu absencie nádorových buniek a troch prípadoch pre chudobných signálov v jedinom Sish farbenie.
Väčšina pacientov boli muži (67,7%) a vo veku 65 rokov (70,8%) (tabuľka 1). Kohorta pozostáva z pacientov s adenokarcinóm stredné až distálneho žalúdka (50,0%) alebo ġej (45,8%) s viac prípadov Lauren`s črevnej (67,7%) než rozptýlených nádorov (28,1%). Triedenie väčšiny vzoriek bol G3 (50,0%) a následne G2 (39,6%) a nádory klasifikované ako G2-3 (10,4%). 85,7% z vyňatých pacientov (n = 28) ukázala, lymfatických uzlín (N stupeň) a 64,3% nevykazoval žiadne vzdialených metastáz (stupeň M). V polovici resekcii pacientov, nádor T3 etapa bola pozorovaná, nasledovaný T2 v 28,6%, T1 na 14,3% a T4 fáze 7,1% charakteristík patients.Table 1 pacienta a HER2 pozitivity podľa podskupín

Celková n = 96 (%)
pozitivita * (IHC 3+ alebo Sish +) single n (%)
pozitivita * (IHC 3+ alebo Sish +) combi n (%)
Sex
Žena
27 (28,1)
2 (7.4)
1 (3,7)
Muž
65 (67,7)
11 (16,9)
11 (16,9)
Neznámy
4 (4,2) Sims 3 (75,0) Sims 3 (75,0)
Vek
18-94 rokov Pár (medián 69)
≥ 65
68 (70,8)
12 (17,6)
11 (16,2) Hotel < 65
28 (29,2)
4 (14,3)
4 (14,3)
primárne lokalizácia nádoru
strednej k distálnej žalúdočnej
48 (50,0)
5 (10,4)
4 (8,3)
ġej
44 (45,8)
8 (18,2)
8 (18,2)
neurčené
4 (4,2) Sims 3 (75,0) Sims 3 (75,0)
Lauren klasifikácie
Difúzna
27 (28,1) Sims 3 (11,1)
2. (7.4)
zmiešané
4. (4.2)
1 (25,0)
1 (25,0)
črevnej
65 (67,7)
12 (18,5)
12 (18,5)
biopsia /resekcii
biopsia
68 (70,8)
10 (14,7)
9 (13,2)
resekcia
28 (29,2)
6 (21,4)
6 (21,4)
T etapa (n = 28)
T 1
4 (14,3)
0
0
T 2
8 (28,6)
2 (25.0)
2 (25.0)
T 3
14 (50,0)
4 (28,6)
4 (28,6)
T 4
2 (7.1)
0
0
N etapa (n = 28)
N +
24 (85,7)
5 (20,8)
5 (28,8)
N -
4 (14,3)
1 (25,0)
1 (25,0)
M fáza (n = 28)
M +
5 (17,9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M -
18 (64,3) Sims 3 (16,7) Sims 3 (16,7)
Mx
5 (17,9)
2 (40,0)
2 (40,0)
Triedenie
G2
38 (39,6)
6 (15,8)
6 (15,8)
G2-3
10 (10,4)
2 (20.0)
2 (20.0)
G3
48 (50,0)
8 (16,7)
7 (14,6)
Skratky
: IHC
imunohistochémia, Sish
striebra in situ hybridizácia T
primárny nádor, N
lymfatické uzliny, m
metastázy * definovaná ako IHC 3+ alebo Sish ≥2.0.
P
= 1 pre všetky porovnania medzi IHC /Sish a metódy gén /proteín (Fisher presný test).
V tabuľke 1 je HER2 pozitivita podľa podskupín je zobrazená tiež. Žiadny významný rozdiel bol zaznamenaný u HER2-pozitivity v porovnaní s podskupín a rôznymi metódami.
Výsledky farbenia na expresiu proteínu HER2 a amplifikácie génu (Single metódy farbenia)
Protein Expression skóre pri vyšetrení metódou IHC boli 0 a 1 + na 70,8% a 10,4% pacientov (tabuľka 2). boli zosilnené 2,9% skóre 0 a 10,0% bodovanie 1 + prípadov. V 9,4% prípadov, mierny výraz (skóre 2 +) s 44,4% amplifikovaných prípadoch bola zistená. 9,4% zo zafarbených vzoriek vykazovali silný výraz (skóre 3 +) s 77,8% zosilnené prípadov. Obrázok 1 ukazuje, reprezentatívne výsledky z jednotlivých staining.Table 2 výsledkov farbenia na expresiu proteínu HER2 a amplifikácia génu
jedinú metódu
kombinovaná
IHC skóre
IHC (n = 96)
Sish ≥ 2,0
IHC (n = 96)
Sish ≥ 2,0
n (%)

n (%)
n (%)
n (%)
0
68 (70,8)
2 (2,9)
68 (70,8)
2 (2,9)
1+
10 (10,4)
1 (10,0)
11 (11,5)
1 (9,1)
2+
9 (9,4)
4 (44,4)
7 (7.3)
2 (28.6)
3+
9 (9,4)
7 (77,8)
10 (10.4)
9 (90,9)
Skratky
: IHC
imunohistochémia, Sish
striebra in situ hybridizácia
Obrázok 1 zástupca výsledky rôznych metód farbenia .. Črevné tumor (hematoxylínom a eosínu (H &E), A.1, 20x) sa IHC 3+ (imunohistochémia (IHC), A.2, 20x gén /proteín, A.4, 20x) a zosilnenie (strieborná in situ hybridizácia (Sish), A.3, 40x gén /proteín, A.4, 20x). IHC skóre 0 (IHC, B.2, 20x gén /proteín, B.4, 40x), typ črevnej (H & E, B1, 20x) a zosilnenie (Sish, B.3, 40x; proteín /gén , B.4, 40x).
Gene /proteín (kombinovaná farbenie)
proteín Expression skóre metódou gén /proteín boli 0, 1+, 2+, 3+ a v 70,8%, 11,5%, 7,3 % a 10,4% (tabuľka 2). Tam bolo 2,9% /9,1% zosilnený prípady vzoriek s výsledkom 0 /1+. 28,6% zosilňované prípady ukazujú na strednej farbenie (skóre 2+). Vzorky s vysokou expresiou (3+) zobrazenej na amplifikáciu génu 90,9%. Príklady farbenie gén /proteín je znázornený na obrázku 1.
Vyhodnotenie súhlasných a nesúhlasných prípadoch
posúdenie IHC farbenie v konvenčnom jeden a spôsobu gén /proteín nie vždy odhaliť zhodné výsledky; dohody oboch metód boli tiež uvedené v tabuľke 3 Tam bolo veľmi dobré konkordancia vo výsledkoch amplifikovaných prípadov (Dohoda o 100,0%, Kappa-koeficient κ = 1), rovnako ako skóre 0 (100%, κ = 1), skóre 1+ ( 98,96%; κ = 0,947) a 3+ vzorky nádorových skóre (96,88%; κ = 0,825) u oboch metód. Prípady s skóre 2+ ukázali menšiu zhoda, aj keď stále dobré (95,83%; κ = 0,728). Zhoda medzi celkovým HER2 pozitivity (definovaná ako IHC 3+ alebo Sish +) v štandardnom alebo novou metódou bola veľmi dobrá (98,69%; κ = 0,963; 17,7% vs. 16,7%) Tabuľka 3 Konkordancia medzi jednotlivými metódami a kombinovaného génu /proteínu. metódy
Single kombinácii vs.
Zhoda
Kappa-Koeficient к
dohoda Altmann [[15]]
Sish zosilnený
100 %
1
Veľmi dobrý
IHC skóre 0
100%
1
Veľmi dobrý
IHC skóre 1+
98,96%
0,947
Veľmi dobrý
IHC skóre 2+
95.83%
0,728
dobrý
IHC skóre 3+
96.88%
0,825
Veľmi dobrý
Skratky
: IHC
imunohistochémia, Sish
striebra in situ hybridizácia.
Tam bolo dvanásť rozchádzajú prípadov pred novým analýzou pomocou tretej pozorovateľom (dáta nie sú uvedené). Po opätovnej zhodnotenie tretím pozorovateľom, rozchádzajú výsledky zostali v štyroch vzorkách nádorov. Bolo zistené, že intraobservační variabilita Dôvodom pre osem rozporných prípadoch v priebežnej analýzy. Výsledky záverečného nesúhlasných výsledkov sú uvedené v tabuľke 4.Table 4 Detailné hodnotenie nesúhlasných výsledkov medzi metódami
Jednotlivé metódy
kombinovaná
Case
histológia (Lauren)
IHC (Score)
Sish (≥ 2,0 /< 2,0)
IHC (Score)
Sish (≥ 2,0 /< 2,0)
6693
aj
2+
≥2.0
3+
≥2.0
9924
aj
2+
< 2,0
1+ Hotel < 2,0
20209
aj
2+
≥2.0
3+
≥2.0
1057
d
3+ Hotel < 2,0
2+ Hotel < 2,0
Skratky
:. IHC
imunohistochémia, Sish
striebra in situ hybridizácia
Diskusia
Cieľom tejto štúdie bolo zhodnotiť uskutočniteľnosť nových gén /proteín plošiny v porovnaní jednotlivých metód farbenia v žalúdku adenokarcinómy a karcinómy esophagogastric križovatky.
hodnotiteľných vzoriek 28,1% ukázala rozptýlené, 4,2 % zmiešané a 67,7% črevnej histologický typ. Väčšina pacientov bolo vo veku 65 rokov (70,8%) a muži (67,7%). Miera adenokarcinómom ġej alebo stredu ihriska distálnej žalúdka bol podobný (45,8% vs. 50,0%). Pri štandardnej metóde, 17,7% pacientov bolo HER2 pozitívne. Väčšina HER2-pozitívnych nádorov boli črevné histológie a boli lokalizované v križovatke GE, to dobre koreluje s údajmi z literatúry [20, 21]. Celkovo možno povedať, založený na pacienta a charakteristiky nádoru, rovnako ako HER2 pozitivity, hodnotená skupina je reprezentatívna kolektívne.
Síce značné skúsenosti pre HER2 analýzou IHC a ISH rakoviny prsníka je k dispozícii, nie je isté, či môžu byť priamo prevedená na karcinómy gastrointestinálneho traktu. Expresie proteínu HER2, na rozdiel od karcinómu prsníka, je heterogénne a často fokálne vyjadrený. Fox et al. [12]. stanovený stav HER2 u 100 vzoriek tkanív diagnostikovaná s pokročilou rakovinou žalúdka alebo rakoviny esophagogastric križovatky v rôznych laboratóriách, aby si overili svoje zápasy. K tomu, IHC a CISH (chromogénnej in situ hybridizácia) alebo Sish boli aplikované. Tam bola dobrá zhoda medzi jednotlivými laboratóriami ohľadom CISH alebo Sish, ale bol pozorovaný mierny zhoda pre všetky IHC skóre. Na základe výsledkov vyšetrovania základe názor autora bolo, že stanovenie statusu HER2 na základe IHC, nasledovaný ISH (európska norma) nie je optimálne stratégie vyhodnotenia a odporučil vykonávať obe metódy farbenia [12]. Iná štúdia [22] testovali amplifikácie HER2 a expresiu u 148 pacientov s pokročilým karcinómom žalúdka u IHC a FISH /Sish. Boli zistené pozitívne prípady HER2 iba 10% z IHC v porovnaní s 18% až 22% v in situ hybridizácia. A to nielen preto, že to bolo ľahšie reprodukovať, autor navrhuje in situ hybridizácia technikou ako lepší prístup pre určenie pozitivitu HER 2 [22]. Avšak, na základe tógu štúdii [8], pacienti s ISH kladné, ale IHC negatívne alebo týždenne (1+) pozitívna nádory nemala prospech z trastuzumabu. Z tohto dôvodu je použitie rýb alebo Sish ako primárny a jedinú metódu sa neodporúča v Európe a IHC je stále považovaný za primárny spôsobu hodnotenia v mnohých krajinách.
Podľa nášho najlepšieho vedomia, ale neexistujú žiadne štúdie, ktoré priamo porovnať výsledky oboch imunohistochémia (IHC) a striebra in situ hybridizácia (Sish), keď každý z nich je použitý samostatne s výsledkami ich použitie v kombinácii v jedinom úseku v žalúdočných karcinómov. Pre vizualizáciu RNA a DNA cieľov in situ, existujú rôzne spôsoby značenia sond pomocou fluorescenčného chromogénneho, alebo striebornou detekciu. Všetky predchádzajúce štúdie s nastavením porovnateľné s našou analýze použité chromogénne alebo fluorescenčnej hybridizácie in situ (FISH) alebo CISH. Downs-Kelly et al. [14] kombinovaná štandardná IHC s ukladaním kovového striebra zo strany EnzMetTM na mikroskopické sústavy tkanív (TMA) z karcinómov prsníka a porovnal výsledky IHC a fluorescenčnej in situ hybridizácia (FISH), keď hral sám. V inej štúdii autori skutočne použitá kombinácia IHC a striebro in situ hybridizácia (Sish) v TMA prsníka a vzoriek s karcinómom žalúdka, ale v porovnaní s výsledkami získanými pomocou IHC a fluorescenčnej in situ hybridizácia (FISH) ako jediné farbenie [16]. Reisenbichler et al. [15] uvádzajú výsledky porovnania IHC a chromogénnych in situ hybridizácia (CISH) ako jednotlivé farbenie s duálnym testu IHC /CISH. Súčasné vyhodnotenie kombinácia proteínov a génových na jednu snímku ponúkol vysoko reprodukovateľné a veľmi robustný metódu s dobrými delenia.
Pre testovanie platnosti nové farbenie génu /proteínu v porovnaní so štandardizovaným IHC a Sish, že konkordancia boli vypočítané na základe koeficientu kappa. V súlade s pokynmi ASCO /CAP pre rakovinu prsníka, nová skúška by mala viac ako 95% zhodu s overenou referenčným testu [23]. V našej štúdii, nová metóda ukázala konkordancií nad 95%, pokiaľ ide o všetky výsledky testov. Tam bolo veľmi dobré konkordancia vo výsledkoch amplifikácie génu, rovnako ako skóre 0 (každý s 100% súhlas), skóre 1+ (98,96%) a dohoda skóre 3+ vzorky nádorov (96,88% dohoda). Prípady s skóre 2+ ukázali menej súhlasné výsledky, aj keď stále dobré (95,83% zhoda). Ťažkostí v prípadoch, s miernym výrazom v hodnotenia a klasifikácie sú známe v literatúre. Tafe et al. [24]. ukázali, že existujú problémy s priradením konečné skóre v hodnotení IHC z dôvodu nedostatku v spoľahlivé oddelení prípadov s HER2 skóre 1 + 2 alebo +. Tieto kategórie môže byť obmedzený subjektivitou a zlá reprodukovateľnosť. Fenomén, ktorý sa nesúhlasné výsledky sú pozorované u pacientov s nízkou expresiou HER2, ktorí niekedy majú stále amplifikáciu génu HER2, bolo hlásených u rakoviny pažeráka [24-26]. Najpravdepodobnejším dôvodom pre tento nesúlad je vo vnútri nádoru heterogenita stavu HER2 v žalúdku alebo karcinómu ġej [17, 27, 28]. V našej štúdii, nesúhlasné výsledky IHC boli pozorované u štyroch pacientov, ale to viedlo ku klinicky relevantný rozdiel vo HER2 pozitivity vo jedného pacienta (pacienti7). Pacient mal difúzny typ karcinómu žalúdka. Vyhodnotenie difúznych nádorov sa zdá byť ťažšie, ako sú nádory črevné typu [29, 30]. Podľa Rüschoff et al. [18]. iba 5% z týchto nádorov vykazujú pozitivitu HER 2; pečatný prsteň karcinómy sú negatívne. HER2 amplifikácie je extrémne vzácna v difúznym karcinómu žalúdka, ktorá je spojená s abnormálne E-cadherin expresie [13, 31-33].
Sish je pomerne nová metóda pre detekciu amplifikácie génu HER2. Početné štúdie potvrdili vysokú zhodu s ostatnými in situ hybridizácia metódami, ako je CISH a ryby [34]. V porovnaní s IHC, ISH vykazuje vyššiu citlivosť a špecifickosť a vyššia reprodukovateľnosť. Toto tvrdenie môže byť potvrdená porovnaním zhodu amplifikovaných prípadov v našich metód. Výsledky ukázali veľmi dobrú zhodu medzi oboma metódami (100,0%; к = 1). Okrem toho je ISH je menej citlivé než IHC v dôsledku relatívnej stability DNA v porovnaní s rozdielmi v fixácie a spracovania tkaniva.
V súčasnej dobe pracuje na rozšírenej štúdie, ktoré hodnotia, či táto nová metóda je spojená so znížením inter-pozorovateľa variabilita pri určovaní stavu HER2 u karcinómu žalúdka. Táto štúdia tiež obsahuje zložku pri pohľade na dobu potrebnú pre správu konečných výsledkov. Výsledky budú predložené do časopisu ako písmeno či pôvodnej správy, akonáhle sú k dispozícii.
Závery
V tejto štúdii sme jasne ukázali, že pomocou kombinovanej metódy na vykonanie expresie proteínu HER2 a amplifikáciu génu na jednej snímke môže priniesť výsledky podobné tým, za použitia každej metódy jednotlivo v kontrolovanej štúdii vykonáva tri nezávislé pozorovateľa. Všetci autori čítať a schválená konečná rukopis.

• Dlhodobé účinky laparoskopickej rukáve gastrektómii proti Roux-en-Y žalúdočnej bypass pre liečbu pacientov s diabetes mellitus 2. typu čínskeho typu s body mass indexom 28-35 kg /m2
• Polymorfizmy TGFB1 a VEGF génov a prežitia pacientov s rakovinou žalúdka