La validación de un nuevo método que combina tanto HER2 inmunohistoquímica y plata de dos colores HER2 hibridación in situ en una diapositiva para las pruebas de carcinoma gástrico

La validación de un nuevo método que combina tanto HER2 inmunohistoquímica y plata de dos colores HER2 in situ
hibridación en una diapositiva para las pruebas de carcinoma gástrico
Resumen Antecedentes

evaluación del estado HER2 es un requisito previo para el establecimiento de una estrategia de tratamiento apropiado en el cáncer gástrico. Los cánceres gástricos son evaluaciones muy heterogéneas y separadas de amplificación de genes y la expresión de la proteína de plomo a la incertidumbre en la localización de clones distintos y están consumiendo tiempo. Este estudio evalúa la equivalencia del nuevo método que combina ambas plataformas de genes y proteínas en una diapositiva.
Métodos
inmunohistoquímica (IHC) y la plata de dos colores HER2 hibridación in situ (SISH) como métodos individuales (IHC /SISH) y la plataforma de gen-proteína de la combinación de ambos métodos en una diapositiva (gen /proteína) se realizaron en recogidas al azar 100 casos de adenocarcinoma gástrico. Los resultados de IHC /SISH se compararon con la tinción de genes /proteínas.
: Resultados de la 96 de 100 muestras fueron evaluables. En la tinción de gen /proteína, los patólogos fueron capaces de evaluar la amplificación de genes y la consiguiente expresión de la proteína a nivel de células individuales. En los ensayos de comparación, se observó amplificación de genes en el 14,6% en tanto, SISH convencional y la plataforma de genes /proteínas (un acuerdo del 100%; Kappa-coeficiente κ = 1,0). Expresión de proteínas puntajes por IHC eran el 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2 +), y el 9,4% (3+). La expresión de proteínas por el método de gen /proteína fueron: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2 +) y 10,4% (3+) de los pacientes. Había concordancias completas en IHC evaluación de los casos con puntuación de 0 (100,0%; k = 1). Los altos concordancias se muestran en la puntuación de 1+ (98.96%; κ = 0,947) y 3+ (96.88%; kappa = 0,825) casos y buenas concordancias en 2+ casos (95.83%; κ = 0,728).
Conclusiones
Esta novela combina tiene la ventaja de ser capaz de evaluar tanto los genes y el estado de proteínas en la misma célula de cáncer y pueden ser de especial interés para la investigación y el cuidado del paciente.
artículo
categoría de biomarcadores de enfermedades.
Palabras clave
cáncer HER2 inmunohistoquímica de plata gástrico hibridación in situ gen de la proteína de ensayo de fondo
El oncogén HER2 (también conocido como HER2 /neu o erbB-2) en el cromosoma 17q21, codifica un receptor transmembrana tirosina 185 kD-quinasa que pertenece a la familia de receptores del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) compuesto de EGFR /HER1, HER2, HER3, y HER4. activación HER2 desempeña un papel central en la proliferación celular y la supervivencia, en gran parte mediada a través de la vía RAS-MAPK. También inhibe la muerte celular a través del objetivo fosfatidilinositol 3'-quinasa AKT-de mamíferos de la vía de la rapamicina (mTOR). La sobreexpresión de HER2 se ha informado en una variedad de tumores sólidos [1-7]. amplificaciones de genes son raros en otras enfermedades y anti-HER2 terapia actualmente está validado sólo en cáncer de mama y gástrico.
Con base en los resultados del ensayo ToGA [8], trastuzumab fue aprobado para adenocarcinoma metastásico de la unión de estómago y en gastroesofágico la terapia de combinación en los EE.UU. y Europa. Requisito es una prueba de la sobreexpresión de HER2. En Europa, este está definido por un resultado IHC 3+ o un IHC 2 + y FISH positivo o resultado SISH (relación ≥ 2,0). IHC fue considerado como el principal método porque IHC positivo negativo o semanal (1+) pacientes no se benefició de trastuzumab en el juicio ToGA, aunque eran ISH positivo. En la literatura, sin embargo, hay una variación considerable en la positividad inmunohistoquímica determinado. En este caso, el porcentaje de HER2 adenocarcinomas gástricos avanzados positivos varía de un estudio a otro, del 5% al ​​30% [9], muy probablemente debido a diferentes protocolos de análisis y criterios de interpretación.
Sub-estudios prospectivos de dos de los ensayos aleatorizados adyuvantes de trastuzumab contra nula en el cáncer de mama demostró que aproximadamente el 20% de las pruebas de HER2 realizados en instituciones in situ (en el departamento de patología de la zona de tratamiento primario) no son correctos cuando se volvió a evaluar la misma muestra en un alto volumen, laboratorio central [10, 11 ].
a diferencia del cáncer de mama, la histopatología de cáncer gástrico en términos de HER2 se considera que es la sobreexpresión más heterogéneo y focal de la amplificación del gen se observa con frecuencia [12]. Por lo tanto, se espera que las dificultades para determinar el estado de HER2 a ser más pronunciada que en el cáncer de mama. En general, tomada en cuenta estos resultados, se necesitan métodos más fiables, reproducibles y de tiempo ahorrando para evaluar el estado de HER2 en cáncer gástrico. Se han realizado muy pocos estudios publicados que combinan IHC y los métodos in situ hibridación (pero no SISH) en una diapositiva [13-16]. Tesis estudios utilizados estándar IHC y cromogénicos o hibridación in situ fluorescente (FISH o CISH) como métodos individuales y los compararon con un análisis simultáneo (combinado en una diapositiva) y han encontrado una buena concordancia con los resultados de tinción única. A lo mejor de nuestro conocimiento, sin embargo, no existen estudios que comparan directamente los resultados de ambas técnicas de inmunohistoquímica (IHC) y la plata de hibridación in situ (SISH) cuando se usa cada uno por separado con los resultados de su uso en combinación en una sola sección en gástrica carcinomas.
en el presente estudio, la expresión de la proteína y la amplificación del gen HER2 estado de 100 adenocarcinomas gástricos y carcinomas de la unión esofagogástrica fueron examinados por IHC convencional y métodos individuales ISH (IHC /SISH) y en paralelo por el nuevo método que combina ambos métodos (genes /proteínas). El objetivo de este estudio fue evaluar la equivalencia de la nueva plataforma de gen-proteína en comparación con los métodos de tinción individuales.
Métodos
Pacientes y muestras de tejidos tumorales
muestras fijadas con formalina embebidos en parafina (FFPE) de 100 pacientes con adenocarcinoma gástrico o de la unión gastroesofágica fueron seleccionados de un archivo de muestras de tejido en el Instituto de Patología de Krankenhaus Nordwest. El proyecto se llevó a cabo con la autorización del comité de ética responsable. Para cada caso, cuatro métodos de tinción diferentes se utilizaron de acuerdo con las manufacturer's procedimientos aprobados por la FDA: hematoxilina y eosina (H & E) para evaluar la idoneidad de la muestra y para confirmar el subtipo histológico, inmunohistoquímica (IHC) para evaluar la proteína HER2 expresión, plata hibridación in situ (SISH) para evaluar la amplificación de genes y la novela plataforma gen de la proteína que combina IHC y SISH en una diapositiva.
inmunohistoquímica
IHC se realizó con el anticuerpo monoclonal de conejo CAMINO Ventana aprobado por la FDA clon 4B5 y con el Kit de Detección UltraView DAB (Ventana) en un centro de tinción automatizada Benchmark XT (Ventana, Tucson, AZ). Brevemente, las secciones de tejido se desparafinaron con EZ Prep a 75 ° C y 76 ° C, el calor tratan previamente en la célula acondicionado 1 (CC1) para la recuperación de antígenos en 76 ° C - 100 ° C y después se incubaron con el anticuerpo primario anti-HER2 para 16 min a 37 ° C después de la inactivación de la peroxidasa endógena usando UV-inhibidor durante 4 min a 37 ° C. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario seguido de la aplicación de HRP universal multímero de 8 min. Los anticuerpos fueron detectados utilizando cromógeno (a 38 min). Antes de montar, las diapositivas se counterstained con hematoxilina II durante 4 minutos y azulado reactivo durante 4 min. Para apoyar la validez de tinción e identificar artefactos experimentales, un control positivo se incluyó en cada ejecución.
Silver hibridación in situ
SISH color dual se realizó de acuerdo a la INFORM cóctel HER2 Dual ISH DNAProbe y Kit UltraView SISH detección DNP /UltraView ROJO ISH Kit de detección DIG para HER2 y Chr 17 de cuantificación y el procedimiento (Ventana /Roche). Ambas sondas se marcaron con 2,4-dinitrofenol (DNP) y digoxigenina (DIG). Los portaobjetos de tejidos se desparafinaron con EZ Prep a 65 ° C-76 ° C y el calor pretratados con diluido-Prep EZ Acondicionador Cell 2 (CC2) a 90 ° C seguido por la digestión de la proteasa con ISH proteasa 3 de 16 min a 37 ° C. Las secciones de tejido ADN genómico y las sondas HER2 y Chr 17 desplazamiento de la mella fueron co-desnaturalizado por tratamiento térmico durante 20 min a 80 ° C seguido de una etapa de hibridación durante 6 horas a 44 ° C. Las señales de HER2 se detectaron usando anticuerpo anti-DNP de conejo durante 20 min a 37 ° C y se incubaron con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP durante 16 min a 37 ° C después de tres lavados de rigurosidad 8 min. La señal se detectó como depósitos de plata con acetato de plata, hidroquinona y peróxido de hidrógeno. Para Chr 17 de detección, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-DIG ratón durante 20 min a 37 ° C y con un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con AP durante 24 min a 37 ° C. La señal de Chr 17 fue desarrollado como tinción con punto rojo rápido fosfato de rojo y naftol. Las diapositivas fueron finalmente contraste con hematoxilina II y azulado reactivo antes del montaje.
Genes /proteínas
génica plataforma /la combinación de proteínas IHC y SISH en una diapositiva. Para apoyar la validez de tinción e identificar artefactos experimentales, un control positivo se incluyó en cada tinción de proteínas HER2 y run.For para HER2 /Chr 17 de la hibridación, se utilizaron el Kit de Detección iVIEW DAB y kits de detección UltraView. Las muestras se tiñeron con arreglo a varios de condiciones de ensayo para poner en práctica un protocolo óptimo necesario para lograr resultados IHC /SISH de tinción comparables a los de las pruebas de IHC y SISH individual. La optimización se realizó en el laboratorio de Ventana (Roche) y en parte en el propio trabajo. Los resultados óptimos se logran realizando el procedimiento de IHC antes del procedimiento SISH.
Las muestras fueron desparafinados con EZ Prep a 72 ° C en 6 ciclos. Para HER2 tinción de proteínas, las secciones de tejido se trataron previamente calor en CC1 para la recuperación de antígenos a 95 ° C y después se incubaron con el anticuerpo primario anti-HER2 a 37 ° C durante 48 min después de la inactivación de la peroxidasa endógena usando UV-inhibidor para 4 min a 37 ° C. Los portaobjetos se incubaron con un anticuerpo secundario biotinilado seguido por la aplicación de estreptavidina conjugada con HRP para 8 min. Una reacción DAB cobre mejorada se utiliza para visualizar la proteína. Para gen HER2 y CHR 17 tinción, las muestras fueron tratados previamente con calor CC2 diluida-Prep EZ a 90 ° C durante cuatro ciclos, seguido de digestión con proteasa con ISH Proteasa 2 durante 12 min a 37 ° C. Las sondas se desnaturalizaron durante 4 min a 80 ° C y se hibridaron durante 6 horas a 44 ° C usando un cóctel de sondas marcadas con DIG DNP y. Se añadió solución HybClear para bloquear la interacción entre el DNP y el depósito DAB durante la hibridación. Las señales de genes se detectaron usando anticuerpo anti-DNP de conejo durante 16 min a 37 ° C y se incubaron con un anticuerpo anti-conejo de cabra conjugado con HRP durante 16 min a 37 ° C después de cuatro lavados de rigurosidad 8 min. La señal fue desarrollado por el depósito de plata con acetato de plata, hidroquinona y peróxido de hidrógeno. Para Chr 17 de detección, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-DIG del ratón para el 16 min a 37 ° C y con un anticuerpo anti-ratón de cabra conjugado con AP durante 24 min a 37 ° C. La señal de Chr 17 fue desarrollado como tinción con punto rojo rápido fosfato de rojo y naftol. Antes de montar, las diapositivas se counterstained con hematoxilina II durante 8 minutos y azulado reactivo durante 4 min. Opiniones sobre Patología México La muestras fueron interpretados de forma independiente por un patólogo (AB) y un biólogo entrenado en la histología cáncer gástrico (DW). Los observadores recibieron las muestras al azar, es decir SISH, IHC, y método combinado no se evaluaron en asociación con la otra, pero por separado para cada paciente. Consenso de ambos revisores fue encontrado después de cada evaluación. Dado que los resultados discordantes entre ambos métodos pueden ser el resultado de la variabilidad intra-observador en lugar de las diferencias en la calidad de la tinción, los casos discordantes fueron reevaluados por un tercer observador que desconocía los resultados de la primera evaluación, pero evaluado los casos discordantes (métodos) en asociación con otros. Por último, se estableció un consenso entre el tercer observador y los observadores primarios.
Los resultados IHC se han analizado utilizando el sistema de puntuación propuesto para el cáncer gástrico por Hofmann et al. [17] y Rüschoff et al. [18]: 0, no reactividad o reactividad membranosa en < 10% de las células tumorales; 1+, la reactividad membranosa débil /apenas perceptible en > 10% de las células tumorales; 2+, débil a moderada reactividad membranosa completa, lateral o basolateral en > 10% de las células tumorales; y 3+, fuerte reactividad membranosa completa, lateral o basolateral en ≥ 10% de las células tumorales. Hoteles en sish resultados, el número total de HER2 y el cromosoma 17 señales fueron contados en al menos 20 núcleos de las células del tumor en dos zonas diferentes. Las relaciones HER2 /Chr 17 fueron interpretados de acuerdo con el sistema de puntuación FISH ToGA para la determinación de HER2 en el cáncer gástrico y la unión gastroesofágica (UGE) de la siguiente manera: < 2,0, el gen HER2 no amplificada; ≥ 2,0, gen HER2 amplificado [17]. Un recuento promedio de seis o más se considera como amplificado. El análisis estadístico
Francia El análisis fue exploratorio, sin cálculos del tamaño de la muestra o de hipótesis predefinidas. El número de 100 pacientes se consideró suficiente para realizar las pruebas estadísticas propuestas. Las correlaciones entre IHC /SISH y el gen /proteína se estimó utilizando Cohen coeficiente kappa (к). La interpretación valor de kappa por Altmann [19] se utilizó: к > 0,81, muy buen acuerdo; 0,61 hasta 0,80, buen acuerdo; Moderado acuerdo 0.41-0.60; 0,40 a 0,21, acuerdo justo; ≪ 0.20, una ligera coincidencia. Los análisis estadísticos se realizaron utilizando el software WinStat (R.Fitch Software, versión 2009.1).
Resultados Características de los pacientes

noventa y seis de los 100 casos de pacientes fueron evaluables. Uno de los casos fue excluido debido a la ausencia de células tumorales y tres casos de señales de pobres en la tinción SISH sola. México La mayoría de los pacientes eran de sexo masculino (67,7%) y ≥ 65 años de edad (70,8%) (Tabla 1). La cohorte consta de pacientes con adenocarcinoma de medio de estómago distal (50,0%) o UGE (45,8%) con más casos de Lauren`s intestinal (67,7%) que los tumores difusa (28,1%). La clasificación de la mayoría de las muestras fue de G3 (50,0%) seguido de G2 (39,6%) y los tumores clasificados como G2-3 (10,4%). 85,7% de los pacientes resecados (n = 28) mostró metástasis en los ganglios linfáticos (N etapas) y 64,3% no mostró metástasis a distancia (etapa M). En la mitad de los pacientes resecados, se observó el estadio del tumor T3, seguido por T2 en el 28,6%, 14,3% en T1 y T4 etapa en el 7,1% de las características patients.Table 1 correspondientes del paciente, y la positividad de HER2 por subgrupos

total n = 96 (%) guía empresas positividad * (IHC 3+ o SISH +) sola n (%) guía empresas positividad * (IHC 3+ o SISH +) combi n (%)
Sexo Femenino

27 (28,1) página 2 (7.4)
1 (3,7)
Hombre
65 (67,7): perfil 11 (16,9) página 11 (16,9)
Desconocido página 4 (4.2) Estrellas: 3 (75,0) página 3 (75,0)
Edad
18-94 años (mediana 69)
≥ 65
68 (70,8) página 12 (17,6) página 11 (16,2) Hotel < 65
28 (29,2) página 4 (14,3) página 4 (14,3)
la localización del tumor primario
Mediados de estómago distal
48 (50,0) página 5 (10,4)
4 (8.3)
UGE
44 (45,8) página 8 (18,2) página 8 (18,2): perfil no hay información página 4 (4.2) página 3 (75,0) página 3 (75,0)
clasificación de Lauren
Difuso
27 (28,1) página 3 (11.1) página 2 (7.4)
Mixta página 4 (4.2)
1 (25,0)
1 (25,0)
intestinal
65 (67,7) página 12 (18,5) página 12 (18,5)
Biopsia /resección
Biopsia
68 (70,8)
10 (14,7) página 9 (13.2)
resección
28 (29,2) página 6 (21,4) página 6 (21,4)
estadio T (n = 28)
T 1 página 4 (14,3)
0 0

T 2 página 8 (28,6) página 2 (25.0) página 2 (25.0)
T 3 página 14 (50,0) página 4 (28,6) página 4 (28,6)
T 4 página 2 (7.1)
0 0

estadio N (n = 28)
N +
24 (85,7) página 5 (20,8) página 5 (28,8)
N - página 4 (14,3)
1 (25,0)
1 (25,0)
M fase (n = 28)
M + página 5 (17,9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M -
18 (64,3) página 3 (16,7) Estrellas: 3 (16,7)
Mx página 5 (17,9) página 2 (40.0) página 2 (40.0)
clasificación
G2
38 (39,6) página 6 (15,8) página 6 (15,8)
G2-3
10 (10,4) página 2 (20.0) página 2 (20.0)
G3
48 (50,0) página 8 (16,7) página 7 (14,6)
abreviaciones
: IHC
inmunohistoquímica, SISH sobre silver hibridación in situ T
tumor primario, N
ganglios linfáticos, M
metástasis * definen como IHC 3+ o ≥2.0 SISH.
P
= 1 para todas las comparaciones entre IHC /SISH y métodos de genes /proteínas (Fisher también se presenta la prueba exacta).
En la Tabla 1, la positividad de HER2 por subgrupos. No se observaron diferencias significativas en la positividad de HER2 en comparación con los subgrupos y diferentes métodos.
Resultados de la tinción de expresión de la proteína HER2 y amplificación de genes (métodos de tinción individuales)
puntuaciones de expresión de la proteína por IHC fueron 0 y 1 + en el 70,8% y 10,4% de los pacientes (Tabla 2). 2,9% de la puntuación de 0 y el 10,0% de la puntuación de 1 + casos fueron amplificados. En el 9,4% de los casos, una expresión moderada (puntuación 2 +) con el 44,4% de los casos se detectó amplificados. 9,4% de las muestras teñidas mostró una expresión fuerte (puntuación de 3 +) con el 77,8% de los casos amplificados. La Figura 1 muestra los resultados representativos de un solo staining.Table 2 resultados de la tinción de expresión de la proteína HER2 y amplificación del gen
método único
método combinado
IHC puntuación
IHC (n = 96) guía empresas SISH ≥ 2,0
IHC (n = 96) guía empresas SISH ≥ 2,0
n (%)

n (%)
n (%)
n (%)
0
68 (70,8) página 2 (2.9)
68 (70,8) página 2 (2.9)
1+
10 (10,4)
1 (10,0) página 11 (11,5)
1 (9.1)
2 +
9 (9.4) página 4 (44,4) página 7 (7.3) página 2 (28.6)
3+ página 9 (9.4) página 7 (77,8) 10
(10.4) página 9 (90,9)
abreviaciones
: IHC
inmunohistoquímica, SISH sobre silver hibridación in situ
Figura 1 resultados representativos de los diferentes métodos de tinción.. tumor intestinal (hematoxilina y eosina (H & E), A.1, 20x) con IHC 3+ (inmunohistoquímica (IHC), A.2, 20x; gen /proteína, A.4, 20x) y la amplificación (plata in situ hibridación (SISH), A.3, 40x; gen /proteína, A.4, 20x). IHC puntuación de 0 (IHC, B.2, 20x; gen /proteína, B.4, 40x), tipo intestinal (H & E, B.1, 20x) y la amplificación (SISH, B.3, 40x; genes /proteínas , B.4
genes /proteínas (método de tinción combinada, 40x).)
expresión de la proteína por el método de las puntuaciones de genes /proteínas eran 0, 1+, 2+, 3+ y en el 70,8%, 11,5%, 7,3 % y 10,4% (Tabla 2). Hubo 2,9% /9,1% de los casos amplificado en muestras con puntuación de 0/1 +. 28,6% de los casos amplificados mostraron una tinción moderada (puntuación de 2+). Las muestras con alta expresión (3 +) mostraron amplificación de genes en 90,9%. Los ejemplos de tinción de genes /proteínas se demuestran en la Figura 1.
Evaluación de los casos concordantes y discordantes
La evaluación de la tinción IHC en el único convencional y el método gen /proteína no siempre revelan resultados congruentes; acuerdos de ambos métodos también se enumeran en la Tabla 3 Había muy buenas concordancias en los resultados de los casos amplificados (acuerdo 100,0%; Kappa-coeficiente κ = 1), así como puntuación de 0 (100%; κ = 1), la puntuación de 1+ ( 98.96%; κ = 0,947) y la puntuación de 3+ muestras de tumores (96,88%; κ = 0,825) en ambos métodos. Los casos con puntuación de 2 + mostraron una menor concordancia, aunque sigue siendo bueno (95.83%; κ = 0,728). La concordancia entre la positividad de HER2 en general (definido como IHC 3+ o SISH +) en el método estándar o novela era muy bueno (98.69%; κ = 0,963; 17,7% vs. 16,7%) Tabla 3 concordancias entre los métodos individuales y gen /proteína combinada. métodos
combinación vs individual
Concordancia
Kappa-Coeficiente к
Acuerdo Altmann [[15]]
SISH amplifica
100 %
1

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