La validazione di un nuovo metodo che combina sia HER2 immunoistochimica e argento a due colori HER2 in ibridazione in situ su una diapositiva per il test carcinoma gastrico

La validazione di un nuovo metodo che combina sia HER2 immunoistochimica e argento a due colori HER2 in situ
ibridazione su uno scivolo per gastrico test carcinoma
Abstract
sfondo
valutazione dello stato HER2 è un prerequisito per la creazione di una strategia di trattamento appropriato nel cancro gastrico. tumori gastrici sono valutazioni molto eterogenee e separati di amplificazione genica e proteine ​​piombo espressione di incertezze nella localizzazione cloni distinti e richiedono molto tempo. Questo studio valuta l'equivalenza del nuovo metodo che combina entrambe le piattaforme geni e proteine ​​su una diapositiva
. Metodi
immunoistochimica (IHC) e argento a due colori HER2 ibridazione in situ (SISH) come metodi singoli (IHC /SISH) e la piattaforma gene-proteina che combina entrambi i metodi su una diapositiva (gene /proteine) sono stati eseguiti in modo casuale raccolti 100 casi di adenocarcinoma gastrico. I risultati di IHC /SISH sono stati confrontati con colorazione gene /proteina.
Risultati
96 su 100 campioni sono risultati valutabili. Nella colorazione gene /proteina, patologi erano in grado di valutare l'amplificazione genica e proteica conseguente a livello di singola cellula. Negli studi di confronto, l'amplificazione del gene è stata osservata nel 14,6% da entrambi, SISH convenzionale e la piattaforma di geni /proteine ​​(accordo al 100%; Kappa-coefficiente κ = 1.0). Proteine ​​espressione punteggi di IHC sono state 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+), e del 9,4% (3+). L'espressione proteica con metodo gene /proteine ​​erano: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) e 10,4% (3+) dei pazienti. C'erano concordanze complete nella valutazione IHC dei casi con punteggio 0 (100,0%; kappa = 1). Alte concordanze sono mostrati in punteggio 1+ (98.96%; κ = 0,947) e 3+ (96.88%; kappa = 0,825) casi e buone concordanze a 2+ casi (95,83%; κ = 0,728).
Conclusioni
Questo romanzo combinato ha il vantaggio di essere in grado di valutare sia gene e lo stato di proteine ​​nella stessa cellula tumorale e può essere di particolare interesse per la ricerca e la cura del paziente.
articolo categoria
malattia di biomarcatori.
parole
cancro gastrico HER2 immunoistochimica argento ibridazione in situ Gene-proteina saggio Sfondo
L'oncogene HER2 (noto anche come HER2 /neu o ErbB-2) sul cromosoma 17q21, codifica un recettore transmembrana tirosin chinasi 185-kD che appartiene alla famiglia del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) che comprende EGFR /HER1, HER2, HER3, e HER4. attivazione di HER2 gioca un ruolo centrale nella proliferazione cellulare e la sopravvivenza, in gran parte mediata attraverso la via RAS-MAPK. Inoltre inibisce la morte cellulare attraverso il phosphatidylinositol 3'-chinasi-AKT-mammiferi obiettivo di rapamicina (mTOR) percorso. HER2 è stata riportata in una varietà di tumori solidi [1-7]. amplificazioni del gene sono rari in altre malattie e la terapia anti-HER2 è attualmente convalidato solo in seno e tumori gastrici.
Sulla base dei risultati dello studio ToGA [8], trastuzumab è stato approvato per l'adenocarcinoma metastatico della giunzione gastroesofagea stomaco e in terapia di combinazione negli Stati Uniti e in Europa. Il requisito è la prova di HER2. In Europa, questo è definito da un risultato IHC 3+ o un IHC 2+ e FISH positivo o risultato SISH (rapporto ≥ 2,0). IHC era considerato il metodo principale perché IHC positivo negativo o settimanale (1+) pazienti non ha beneficiato di trastuzumab nel processo ToGA, anche se erano ISH positivi. In letteratura, tuttavia, vi è una notevole variazione della positività immunoistochimica determinata. Qui, la percentuale di HER2 adenocarcinoma gastrico avanzato positivi varia da uno studio all'altro, dal 5% al ​​30% [9], molto probabilmente a causa di diversi protocolli di analisi e criteri di interpretazione.
Potenziali sottostudi da due dei coadiuvanti randomizzati prove di trastuzumab rispetto a zero nel cancro al seno ha dimostrato che circa il 20% dei test HER2 eseguite presso le istituzioni in loco (presso il Dipartimento di patologia del sito di trattamento primario) erano corretto quando lo stesso esemplare è stato rivalutato in un volume alto, laboratorio centrale [10, 11 ].
differenza cancro al seno, l'istopatologia di cancro gastrico in termini di HER2 è considerato sovraespressione più eterogenea e focale di amplificazione genica, è frequente [12]. Pertanto, difficoltà nel determinare lo status di HER2 dovrebbero essere più pronunciato rispetto al cancro al seno. Nel complesso, questi risultati presi in considerazione, sono necessari metodi riproducibili e ora risparmiare più affidabili per valutare lo stato HER2 nel carcinoma gastrico. sono stati condotti pochi studi pubblicati, che conciliano IHC e nei metodi di ibridazione in situ (ma non SISH) su un vetrino [13-16]. Tesi studi utilizzati standard di IHC e cromogenici o ibridazione in situ fluorescente (CISH o FISH) come metodi singoli e li hanno confrontati con una analisi simultanea (combinato su una diapositiva) e abbiamo trovato un buon accordo con i risultati di un'unica colorazione. Per quanto a nostra conoscenza, però, non ci sono studi che mettono a confronto direttamente i risultati di entrambi immunoistochimica (IHC) e l'argento ibridazione in situ (SISH) quando ciascuno viene utilizzato esclusivamente con i risultati del loro utilizzo in combinazione in una singola sezione in gastrica carcinomi.
nel presente studio, l'espressione della proteina e l'amplificazione del gene HER2 stato di 100 adenocarcinomi gastrici e carcinomi della giunzione esofago-gastrica sono stati esaminati da IHC convenzionale e metodi singoli ISH (IHC /SISH) e in parallelo con il metodo del romanzo che unisce entrambi i metodi (gene /proteina). Lo scopo di questo studio era di valutare l'equivalenza della nuova piattaforma gene-proteina rispetto ai metodi di colorazione singoli.
Metodi
Pazienti e campioni di tessuto
campioni tumorali fissati in formalina e inclusi in paraffina (FFPE) da 100 pazienti con adenocarcinoma gastrico o giunzione gastroesofagea sono stati selezionati da un archivio di tessuto di campioni presso l'Istituto di Patologia presso Krankenhaus Nordwest. Il progetto è stato eseguito con l'autorizzazione del comitato etico competente. Per ogni caso, quattro diversi metodi di colorazione sono stati utilizzati secondo le del produttore di procedure approvati dalla FDA: ematossilina e eosina (H & E) per valutare l'adeguatezza del campione e per confermare il sottotipo istologico, immunoistochimica (IHC) per valutare la proteina HER2 espressione, argento ibridazione in situ (SISH) per valutare l'amplificazione genica e la piattaforma gene-proteina romanzo che combina IHC e SISH su una diapositiva.
immunoistochimica
IHC è stata eseguita con il percorso anticorpi di coniglio monoclonale Ventana approvato dalla FDA 4B5 clone e con il UltraView DAB Detection Kit (Ventana) su un coloratore XT BenchMark automatizzato (Ventana, Tucson, AZ). Brevemente, sezioni di tessuto sono stati deparaffinate con EZ Prep a 75 ° C e 76 ° C, calore pretrattati in Cell condizionata 1 (CC1) per il recupero dell'antigene a 76 ° C - 100 ° C e poi incubate con l'anticorpo primario anti-HER2 per 16 min a 37 ° C dopo inattivazione della perossidasi endogena con UV-inibitore per 4 min a 37 ° C. I vetrini sono stati incubati con un anticorpo secondario seguito dall'applicazione di HRP universale Multimer per 8 min. Gli anticorpi sono stati rilevati utilizzando cromogeno (per 38 minuti). Prima del montaggio, vetrini sono stati di contrasto con ematossilina II per 4 min e brunitura reagente per 4 min. Per sostenere la validità della colorazione e identificare gli artefatti sperimentali, un controllo positivo è stato incluso in ogni seduta.
Argento ibridazione in situ
SISH doppio colore è stata eseguita secondo la INFORM cocktail HER2 doppio ISH DNAProbe e Kit UltraView SISH DNP Detection /UltraView RED ISH DIG Detection Kit per HER2 e Chr 17 quantificazione e la procedura (Ventana /Roche). Entrambe le sonde sono stati etichettati con 2,4-dinitrofenolo (DNP) e digossigenina (DIG). I vetrini di tessuto sono stati deparaffinate con EZ Prep a 65 ° C-76 ° C e calore pretrattati con EZ Prep-diluito cellulare condizionatore 2 (CC2) a 90 ° C seguita dalla proteasi digestione con ISH Protease 3 per 16 min a 37 ° C. Le sezioni di tessuto DNA genomico e le sonde HER2 e Chr 17 nick-tradotti sono stati co-denaturato mediante trattamento termico per 20 minuti a 80 ° C seguita da una fase di ibridazione per 6 ore a 44 ° C. I segnali HER2 sono stati rilevati utilizzando coniglio anti-DNP anticorpi per 20 min a 37 ° C e incubate con HRP-coniugato anticorpi di capra anti-coniglio per 16 min a 37 ° C dopo tre lavaggi 8 min stringenza. Il segnale è stato rilevato come depositi d'argento con acetato di argento, idrochinone e perossido di idrogeno. Per Chr 17 di rilevamento, i vetrini sono stati incubati con il mouse anticorpo anti-DIG per 20 min a 37 ° C e con un anticorpo anti-topo di capra AP-coniugato per 24 min a 37 ° C. Il segnale Chr 17 è stato sviluppato come punto rosso colorazione con rosso e veloce naftolo fosfato. I vetrini sono stati, infine, di contrasto con ematossilina II e brunitura reagente prima del montaggio.
Gene /proteina
piattaforma /proteine ​​Gene combinando IHC e SISH su una diapositiva. Per sostenere la validità della colorazione e identificare gli artefatti sperimentali, un controllo positivo è stato incluso in ogni colorazione della proteina HER2 run.For e per HER2 /Chr 17 ibridazione, sono stati utilizzati il ​​kit iVIEW DAB rilevamento e UltraView Detection kit. I campioni sono stati colorati con diversi delle condizioni di saggio per implementare un protocollo ottimale necessario per raggiungere risultati IHC /SISH colorazione paragonabili a quelle dei singoli test IHC e SISH. L'ottimizzazione è stata eseguita nel laboratorio di Ventana (Roche) e in parte in proprio lavoro. Risultati ottimali sono stati ottenuti eseguendo la procedura IHC prima della procedura SISH.
campioni sono stati deparaffinate con EZ Prep a 72 ° C in 6 cicli. Per la colorazione della proteina HER2, sezioni di tessuto sono stati calore pretrattati in CC1 per il recupero dell'antigene a 95 ° C e poi incubate con l'anticorpo primario anti-HER2 a 37 ° C per 48 min dopo inattivazione della perossidasi endogena con UV-inibitore per 4 min a 37 ° C. I vetrini sono stati incubati con un anticorpo secondario biotinilato seguita dall'applicazione di streptavidina HRP-coniugato per 8 min. Una reazione DAB rame migliorato è stato usato per visualizzare la proteina. Per HER2 gene e CHR 17 colorazione, i campioni sono stati pretrattati con calore CC2 EZ Prep-diluito a 90 ° C per quattro cicli seguiti dalla proteasi digestione con proteasi ISH 2 per 12 min a 37 ° C. Le sonde sono state denaturate per 4 minuti a 80 ° C e ibridizzati per 6 ore a 44 ° C usando un cocktail di sonde DNP- e DIG-etichettati. soluzione HybClear inserito bloccare l'interazione tra il DNP e il deposito DAB durante l'ibridazione. I segnali di geni sono stati rilevati utilizzando coniglio anti-DNP anticorpi per 16 min a 37 ° C e incubate con HRP-coniugato anticorpi di capra anti-coniglio per 16 min a 37 ° C dopo quattro lavaggi stringenza 8 min. Il segnale è stato sviluppato mediante il deposito di argento con acetato di argento, idrochinone e perossido di idrogeno. Per Chr 17 di rilevamento, i vetrini sono stati incubati con il mouse anticorpo anti-DIG per 16 min a 37 ° C e con un anticorpo anti-topo di capra AP-coniugato per 24 min a 37 ° C. Il segnale Chr 17 è stato sviluppato come punto rosso colorazione con rosso e veloce naftolo fosfato. Prima del montaggio, vetrini sono stati di contrasto con ematossilina II per 8 min e brunitura reagente per 4 min. Recensione
Patologia
I campioni sono stati interpretati in modo indipendente da un patologo (AB) e un biologo esperto in istologia cancro gastrico (DW). Gli osservatori ricevuto i campioni a caso, cioè SISH, IHC e metodo combinato non sono stati valutati in associazione tra loro, ma separatamente per ogni paziente. Consenso di entrambi i revisori è stato trovato dopo ogni valutazione. Poiché i risultati discordanti tra i due metodi possono essere il risultato di variabilità intra-osservatore piuttosto che differenze nella qualità della colorazione, casi discordanti sono stati rivalutati da un terzo osservatore che era a conoscenza i risultati della prima valutazione, ma valutato i casi discordanti (metodi) in associazione tra loro. Infine, il consenso è stato stabilito tra il terzo osservatore e gli osservatori primarie.
I risultati IHC sono stati interpretati utilizzando lo schema di punteggio proposto per cancro gastrico da Hofmann et al. [17] e Rüschoff et al. [18]: 0, nessuna reattività o reattività membranoso in < 10% delle cellule tumorali; 1+, debole /appena percettibile reattività di membrana a > 10% delle cellule tumorali; 2+, debole a moderata completo, laterale o basolaterale reattività membranosa a > 10% delle cellule tumorali; e 3+, forte completo, laterale o basolaterale reattività di membrana in ≥ 10% delle cellule tumorali.
Nei risultati SiSh, il numero totale di HER2 e cromosoma 17 i segnali sono stati contati in almeno 20 nuclei delle cellule tumorali in due aree diverse. I HER2 /Chr 17 rapporti sono stati interpretati in conformità con lo schema di punteggio FISH ToGA per il test HER2 nella giunzione gastrico e gastroesofageo cancro (GEJ) come segue: < 2.0, HER2 gene non amplificato; ≥ 2.0, HER2 gene amplificato [17]. Un conteggio medio di sei o più è stato considerato come amplificato. Analisi statistica

L'analisi è stata esplorativa con nessuna ipotesi o campione calcoli delle dimensioni predefinite. Il numero di 100 pazienti è stato ritenuto sufficiente per eseguire i test statistici proposti. Le correlazioni tra IHC /SISH e geni /proteine ​​sono stati stimati utilizzando Cohen's coefficiente kappa (к). L'interpretazione valore di kappa da Altmann [19] è stato utilizzato: к > 0,81, molto buon accordo; 0,61-0,80, buon accordo; 0,41-0,60 accordo moderata; ,40-,21, Giusto accordo; ≪ 0.20, leggera accordo. Le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando il software WinStat (R.Fitch Software, versione 2009.1).
Risultati
Le caratteristiche dei pazienti
novanta sei dei 100 casi di pazienti erano valutabili. Un caso è stato escluso a causa della assenza di cellule tumorali e tre i casi per i segnali poveri del singolo colorazione SISH.
La maggior parte dei pazienti era di sesso maschile (67,7%) e ≥ 65 anni (70,8%) (Tabella 1). La coorte è costituito da pazienti con adenocarcinoma del mezzo a stomaco distale (50,0%) o GEJ (45,8%), con più casi di Lauren`s intestinale (67,7%) rispetto ai tumori diffuso (28,1%). La classificazione della maggioranza dei campioni era G3 (50,0%) seguita da G2 (39,6%) e tumori classificati come G2-3 (10,4%). 85,7% dei pazienti sottoposti a resezione (n = 28) ha mostrato metastasi linfonodali (N stadio) e il 64,3% non ha mostrato metastasi a distanza (stadio M). Nella metà dei pazienti sottoposti a resezione, è stata osservata stadio T3 del tumore, seguita da T2 in 28,6%, T1 nel 14,3% e la fase di T4 nel 7,1% delle caratteristiche del paziente e patients.Table 1 HER2 positività per sottogruppi

totale n = 96 (%)
positività * (IHC 3+ o SISH +) singolo n (%)
positività * (IHC 3+ o SISH +) combi n (%)
sesso femminile

27 (28,1) Pagina 2 (7.4)
1 (3.7)
Maschio
65 (67,7)
11 (16,9)
11 (16,9)
Unknown
4 (4.2) Pagina 3 (75.0) Pagina 3 (75.0)
Età
18-94 anni (mediana 69)
≥ 65
68 (70,8)
12 (17,6)
11 (16.2)
< 65
28 (29,2) Pagina 4 (14,3) Pagina 4 (14,3)
localizzazione del tumore primario
Metà di distale dello stomaco
48 (50.0)
5 (10.4)
4 (8.3)
GEJ
44 (45,8) Pagina 8 (18,2) Pagina 8 (18,2)
Non specificato
4 (4.2) Pagina 3 (75.0) Pagina 3 (75.0)
classificazione Lauren
Diffondere le
27 (28,1) Pagina 3 (11.1) Pagina 2 (7.4)
misto 4 (4.2)
1 (25,0)
1 (25,0)
intestinale
65 (67,7)
12 (18,5)
12 (18,5)
Biopsia /resezione
biopsia
68 (70.8)
10 (14,7)
9 (13,2)
resezione
28 (29.2)
6 (21,4)
6 (21,4)
stadio T (n = 28)
T 1 Pagina 4 (14,3)
0 0

T 2 Pagina 8 (28,6) Pagina 2 (25,0) Pagina 2 (25,0)
T 3
14 (50.0) Pagina 4 (28,6) Pagina 4 (28,6)
T 4 Pagina 2 (7.1)
0 0

fase N (n = 28)
n +
24 (85,7)
5 (20,8)
5 (28,8)
n - Pagina 4 (14,3)
1 (25,0)
1 (25,0) M
fase (n = 28)
M +
5 (17,9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M -
18 (64,3) Pagina 3 (16,7) Pagina 3 (16,7)
Mx
5 (17,9) Pagina 2 (40.0) Pagina 2 (40.0)
classificazione
G2
38 (39,6)
6 (15,8)
6 (15,8)
G2-3
10 (10.4) Pagina 2 (20.0) Pagina 2 (20.0)
G3
48 (50.0) Pagina 8 (16,7)
7 (14,6)
Abbreviazioni
: IHC
immunoistochimica, SISH
argento ibridazione in situ T
tumore primario, N
linfonodi, M
metastasi * definito come IHC 3+ o SISH ≥2.0.
P
= 1 per tutti i confronti tra IHC /SISH e metodi di gene /proteina (Fisher del test esatto).
Nella Tabella 1 la positività HER2 per sottogruppi è anche presentato. Nessuna differenza significativa è stata osservata nel HER2 positività rispetto ai sottogruppi e metodi diversi.
Risultati di colorazione per l'espressione della proteina HER2 e amplificazione genica (metodi di colorazione singoli)
punteggi espressione della proteina da IHC erano 0 e 1 + a 70,8% e 10,4% dei pazienti (Tabella 2). 2,9% del punteggio 0 e 10,0% del punteggio 1 + casi sono stati amplificati. Nel 9,4% dei casi, un'espressione moderata (punteggio 2 +) con il 44,4% dei casi è stata rilevata amplificati. 9,4% dei campioni macchiati mostrava un'espressione forte (punteggio 3 +) con 77,8% dei casi amplificati. La figura 1 mostra risultati rappresentativi da singoli staining.Table 2 risultati di colorazione per l'espressione della proteina HER2 e l'amplificazione del gene
metodo singolo
metodo combinato
IHC Score
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2.0
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2.0
n (%)

n (%)
n (%)
n (%)
0
68 (70,8) Pagina 2 (2.9)
68 (70.8) Pagina 2 (2.9)
1+
10 (10.4)
1 (10.0)
11 (11.5)
1 (9.1)
2+
9 (9.4) Pagina 4 (44,4) Pagina 7 (7.3) Pagina 2 (28.6)
3+
9 (9.4) Pagina 7 (77,8)
10 (10.4)
9 (90,9)
Abbreviazioni
: IHC
immunoistochimica, SISH
argento ibridazione in situ
Figura 1 risultati rappresentativi dei differenti metodi di colorazione.. tumore intestinale (ematossilina e eosina (H & E), A.1, 20x) con IHC 3+ (immunoistochimica (IHC), A.2, 20x; gene /proteina, A.4, 20x) e l'amplificazione (argento in situ ibridazione (SISH), A.3, 40x; gene /proteina, A.4, 20x). IHC punteggio 0 (IHC, B.2, 20x; gene /proteina, B.4, 40x), tipo intestinale (H & E, B.1, 20x) e l'amplificazione (SISH, B.3, 40x; gene /proteina , B.4, 40x).
gene /proteina (metodo di colorazione combinato)
punteggi espressione della proteina con il metodo del gene /proteine ​​erano 0, 1+, 2+, 3+ e nel 70,8%, 11,5%, 7,3 % e del 10,4% (Tabella 2). Ci sono stati 2,9% /9,1% amplificato casi in campioni con punteggio 0/1 +. 28,6% dei casi amplificati hanno mostrato una colorazione moderata (punteggio di 2+). I campioni con elevata espressione (3+) hanno mostrato nel 90,9% amplificazione genica. Esempi di colorazione gene /proteina sono dimostrati in Figura 1.
valutazione dei casi concordanti e discordanti
La valutazione della colorazione IHC nel singolo convenzionale e il metodo gene /proteine ​​non sempre rivelare i risultati congruenti; contratti di entrambi i metodi sono stati anche riportati nella tabella 3 C'erano ottimi concordanze nei risultati dei casi amplificati (accordo 100,0%; Kappa-coefficiente κ = 1), così come il punteggio 0 (100%; κ = 1), il punteggio 1+ ( 98.96%; κ = 0,947) e il punteggio 3+ campioni tumorali (96.88%; κ = 0,825) in entrambi i metodi. I casi con punteggio 2+ mostrato meno concordanza, anche se ancora buona (95.83%; κ = 0,728). La concordanza tra la positività complessiva HER2 (definito come IHC 3+ o SISH +) nel metodo standard o romanzo era molto buono (98.69%; κ = 0,963; 17,7% vs. 16,7%) Tabella 3 Concordanze tra i metodi singoli e Gene /proteina combinata. metodi
combinazione singolo vs.
Concordanza
Kappa-Coefficiente к
accordo Altmann [[15]]
SISH amplificato
100 %
1 Molto buona qualità IHC punteggio 0
100%
1 Molto buona qualità punteggio IHC 1+
98.96%
0,947
Molto buona qualità punteggio IHC 2+
95.83%
0.728
buona qualità punteggio IHC 3+
96.88%
0,825
Molto buona qualità Abbreviazioni
: IHC
immunoistochimica, SISH
argento ibridazione in situ.
ci sono stati dodici casi discrepanti prima di ri-analisi di un terzo osservatore (dati non riportati). Dopo ri-valutazione da parte di un terzo osservatore, i risultati discrepanti sono rimasti in quattro campioni di tumore. La ragione per gli otto casi discrepanti per l'analisi ad interim è risultato essere variabilità intra-osservatore. Risultati dei risultati discordanti finali sono riportati nella tabella 4 4.Table valutazione dettagliata dei risultati discordanti tra i metodi
metodi singole
metodo
caso
combinato Istologia (Lauren)
IHC (Score)
SISH (≥ 2.0 /< 2.0)
IHC (Score)
SISH (≥ 2.0 /< 2.0)
6693
i
2+
≥2.0
3+
≥2.0
9924
i
2+
< 2.0
1+
< 2.0
20209
i
2+
≥2.0
3+
≥2.0
1057
d
3+
< 2.0
2+
< 2.0
Abbreviazioni
:. IHC
immunoistochimica, SISH
argento ibridazione in situ
Discussione
lo scopo di questo studio era di valutare la fattibilità di una nuova piattaforma di geni /proteine ​​rispetto ai metodi di colorazione singoli in adenocarcinomi gastrici e carcinomi della giunzione esofago-gastrica.
dei campioni valutabili 28,1% ha mostrato una diffusa, 4.2 % un misto e 67,7% di un tipo istologico intestinale. La maggior parte dei pazienti era ≥ 65 anni (70,8%) e maschile (67,7%). Il tasso di adenocarcinoma del GEJ o medio a stomaco distale era simile (45,8% vs. 50,0%). Nel metodo standard, il 17,7% dei pazienti erano HER2 positivo. La maggior parte dei tumori HER2-positivi erano di istologia intestinale e sono stati localizzati nella giunzione GE, questo correla bene con i dati della letteratura [20, 21]. Nel complesso, sulla base di paziente e del tumore caratteristiche nonché la positività di HER2, il gruppo valutato è un collettivo rappresentativo.
Nonostante una notevole esperienza per l'analisi HER2 da IHC e ISH per il cancro al seno è disponibile, non è certo se possono essere direttamente trasferito al carcinomi del tratto gastrointestinale. L'espressione della proteina HER2, a differenza di carcinoma della mammella, è eterogenea e spesso focally pronunciato. Fox et al. [12]. determinato lo status di HER2 in 100 campioni di tessuto con diagnosi di cancro allo stomaco avanzato o il cancro della giunzione esofago-gastrica in diversi laboratori per testare le loro partite. Per questo, IHC e CISH (ibridazione in situ) o SISH sono stati applicati. C'era un buon accordo tra i diversi laboratori per quanto riguarda CISH o SISH, ma è stata osservata concordanza moderato per tutti gli spartiti IHC. Sulla base dei risultati dell'inchiesta, secondo l'autore è che la determinazione dello status HER2 basato su IHC, seguita da ISH (norma europea) non è una strategia di valutazione ottimale e consigliabile eseguire entrambi i metodi di colorazione [12]. Un altro studio [22] testato l'amplificazione HER2 e di espressione in 148 pazienti con carcinoma gastrico avanzato da IHC e FISH /SISH. casi HER2 positivi sono stati rilevati solo nel 10% dei IHC rispetto al 18% al 22% nel ibridazione in situ. Non solo perché era più facile da riprodurre, l'autore ha proposto la tecnica di ibridazione in situ come approccio migliore per determinare la positività HER2 [22]. Tuttavia, sulla base del processo TOGA [8], i pazienti con ISH positivi ma IHC negativo o settimanale (1+) tumori positivi non hanno tratto beneficio da trastuzumab. Pertanto, l'uso di pesce o SISH come metodo primario e solo non è raccomandato in Europa e IHC è ancora considerato come il metodo di valutazione primaria in molti paesi.
Per quanto a nostra conoscenza, però, non ci sono studi che confrontare i risultati di entrambi immunoistochimica (IHC) e argento ibridazione in situ (SISH) quando ciascuno viene usato separatamente i risultati di essere utilizzati in combinazione in una singola sezione in carcinomi gastrici. Per visualizzare RNA e DNA target in situ, ci sono diversi modi di sonde di etichettatura utilizzando la fluorescenza, la rilevazione cromogenica o argento. Tutti gli studi precedenti con le impostazioni paragonabili alla nostra analisi utilizzati cromogeno o ibridazione in situ fluorescente (CISH o FISH). Downs-Kelly et al. [14] combinato di serie IHC con una deposizione di argento metallico da EnzMetTM su un microarray tissutale (TMA) di carcinomi della mammella e confrontato i risultati di IHC e ibridazione in situ fluorescente (FISH) quando eseguita da sola. In un altro studio, gli autori hanno infatti usato la combinazione di IHC e argento ibridazione in situ (SISH) in TMA del seno e campioni di cancro gastrico, ma in confronto i risultati di quelli ottenuti con IHC e ibridazione in situ fluorescente (FISH) come singola colorazione [16]. Reisenbichler et al. [15] hanno riportato i risultati del confronto di IHC e ibridazione in situ (CISH) come singole colorazioni con il duplice test IHC /CISH. La valutazione simultanea di combinazioni geni e proteine ​​su una singola diapositiva offerto un metodo altamente riproducibile e molto robusto con buone concordanze.
Per testare la validità della nuova colorazione gene /proteina rispetto standardizzata IHC e SISH, le concordanze sono stati calcolati in base al coefficiente kappa. Secondo le linee guida ASCO /PAC per il cancro al seno, un nuovo test dovrebbe mostrare più del 95% concordanza con un saggio di riferimento convalidato [23]. Nel nostro studio, il nuovo metodo ha mostrato concordanze superiore al 95% in termini di tutti i punteggi dei test. Ci sono stati molto buoni concordanze nei risultati di amplificazione genica, nonché il punteggio 0 (ognuno con un accordo al 100%), punteggio 1+ (accordo 98.96%) e di campioni di punteggio 3+ tumorali (accordo 96.88%). I casi con punteggio 2+ hanno mostrato risultati meno concordanti, anche se ancora buona (accordo di 95.83%). Difficoltà casi con espressione moderata nella valutazione e classificazione sono noti in letteratura. TAFE et al. [24]. hanno dimostrato che vi sono difficoltà assegnando un punteggio finale nella valutazione della IHC per mancanza nella separazione affidabile dei casi con un punteggio HER2 di 1 + o 2 +. Queste categorie potrebbero essere limitati dalla soggettività e scarsa riproducibilità. Il fenomeno che i risultati discordanti sono stati osservati nei pazienti con bassa espressione di HER2, che a volte hanno ancora amplificazione del gene HER2, è stata riportata in cancro esofageo [24-26]. La ragione più probabile per questa discordanza è intra-tumorale eterogeneità dello status di HER2 nel carcinoma gastrico o GEJ [17, 27, 28]. Nel nostro studio, i risultati discordanti IHC sono stati osservati in quattro pazienti, ma questi hanno portato a una differenza clinicamente rilevante nella positività di HER2 in un solo paziente (pazientei7). Il paziente aveva diffuso tipo di cancro gastrico. La valutazione dei tumori diffusi sembra essere più difficile di quanto tumori intestinali di tipo [29, 30]. Secondo Rüschoff et al. [18]. solo il 5% di questi tumori HER2 mostrano positività; carcinomi a cellule anello con sigillo sono negativi. amplificazione HER2 è estremamente raro in carcinoma gastrico diffuso che è associato con espressione anormale E-caderina [13, 31-33].
La SISH è relativamente nuovo metodo per la rilevazione della amplificazione del gene HER2. Numerosi studi hanno confermato una elevata concordanza con altri metodi di ibridazione in situ come CISH e FISH [34]. Rispetto alla IHC, ISH mostra una maggiore sensibilità e specificità e riproducibilità superiore. Questa affermazione può essere confermata confrontando la concordanza dei casi amplificati nei nostri metodi. I risultati hanno rivelato un ottimo accordo tra i due metodi (100,0%; к = 1). Inoltre, la ISH è meno sensibile IHC a causa di una relativa stabilità del DNA rispetto alle differenze di fissazione dei tessuti e la lavorazione.
Stiamo attualmente lavorando su uno studio esteso valutare se questo nuovo metodo è associato ad una riduzione di inter-osservatore variabilità nella determinazione dello stato HER2 nel carcinoma gastrico. Questo studio include anche una componente guardando il tempo necessario per riportare i risultati finali. I risultati saranno presentati alla rivista come lettera o un rapporto originale, non appena sono disponibili
. Conclusioni
In questo studio, abbiamo chiaramente dimostrato che utilizzando il metodo combinato per eseguire l'espressione della proteina HER2 e amplificazione genica una singola diapositiva può produrre risultati simili a quelli con ogni metodo singolarmente in uno studio controllato attuazione tre osservatori indipendenti. Tutti gli autori hanno letto e approvato il manoscritto finale.

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