Validering av en ny metode som kombinerer både HER2 immunhistokjemi og HER2 dual-farge sølv in situ hybridisering på ett lysbilde for magekreft testing

Validering av en ny metode som kombinerer både HER2 immunhistokjemi og HER2 dual-farge sølv in situ
hybridisering på ett lysbilde for magekreft testing
Abstract
Bakgrunn
HER2 status vurdering er en forutsetning for etablering av en egnet behandlingsstrategi i magekreft. Mage kreft er svært heterogene og separate evalueringer av genamplifisering og protein uttrykk fører til usikkerhet i lokalisere forskjellige kloner og er tidkrevende. Denne studien evaluerer Verdigheten av ny metode som kombinerer både gen og protein plattformer på ett lysbilde
. Metoder
Immunohistochemistry (IHC) og HER2 dual-farge sølv in situ hybridisering (SISH) som enkle metoder (IHC /SISH) og gen-protein plattform kombinere begge metodene på en lysbilde (gen /protein) ble utført i tilfeldig innsamlede 100 tilfeller av adenokarsinom i ventrikkel. Resultater av IHC /SISH ble sammenlignet med gen /protein flekker.
Resultater
96 av 100 prøver var assessable. I genet /proteinfarging, patologer var i stand til å vurdere genamplifisering og påfølgende protein ekspresjon på celle-nivået. I sammenligning studier ble genamplifisering observert hos 14,6% av både konvensjonell SISH og gen /protein-plattform (avtale 100%, Kappa-koeffisient κ = 1.0). Protein uttrykk poeng ved IHC var 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+), og 9,4% (3+). Protein ekspresjon av genet /protein-metode var: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) og 10,4% (3+) av pasientene. Det var fullstendig konkordanser i IHC vurdering av tilfeller med stillingen 0 (100,0%, κ = 1). Høye konkordanser er vist i poengsum 1+ (98,96%, κ = 0,947) og 3+ (96,88%, κ = 0,825) tilfeller og gode konkordanser i 2 + tilfeller (95,83%, κ = 0,728).
Konklusjoner
Denne nye kombinerte plattformen har fordelen av å være i stand til å evaluere både genet og proteinet status i den samme kreftcelle, og kan være av spesiell interesse for forskning og pasientens pleie.
artikkel kategori
Disease Biomarker.
nøkkelord
Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP HER2 Immunhistokjemi sølv in situ hybridisering Gene-proteinanalyse Bakgrunn
HER2-onkogen (også referert til som HER2 /neu eller erbB-2) på kromosom 17q21, koder for et 185 kD-transmembrane tyrosinkinase reseptor som hører til den epidermale vekstfaktor-reseptor (EGFR) familie består av EGFR /HER1, HER2, HER3, HER4 og. HER2 aktivering spiller en sentral rolle i celle spredning og overlevelse, i stor grad formidlet gjennom RAS-MAPK veien. Det hemmer også celledød gjennom phosphatidylinositol 3'-kinase-AKT-mammalian target of rapamycin (mTOR) veien. Økt forekomst av HER2 har blitt rapportert i en rekke solide svulster [1-7]. Gene amplifikasjoner er sjeldne i andre sykdommer og anti-HER2-behandling er for tiden godkjent bare i bryst og mage kreft.
Basert på resultatene fra togaprøve [8], ble trastuzumab godkjent for metastatisk adenocarcinom i magen og gastroøsofageal knutepunkt i kombinasjonsbehandling i USA og Europa. Kravet er bevis på økt forekomst av HER2. I Europa er dette definert av en IHC 3+ resultat eller en IHC 2+ og positiv FISH eller SISH resultat (ratio ≥ 2,0). IHC ble ansett som den primære metoden fordi IHC negativ eller ukentlig positive (1+) pasienter ikke dra nytte av trastuzumab i toga rettssaken, selv om de var ISH positive. I litteraturen er det imidlertid betydelig variasjon i den immunhistokjemiske positivitet bestemt. Her har andelen av HER2 positive avanserte mage adenokarsinomer varierer fra studie til studie, fra 5% til 30% [9], mest sannsynlig på grunn av ulike analyseprotokoller og fortolkningskriterier.
Potensielle substudier fra to av adjuvant randomiserte studier av trastuzumab versus null i brystkreft viste at ca 20% av HER2 analyser utført ved institusjoner på stedet (ved primærbehandling stedets patologi avdeling) var feil når den samme prøven ble re-evaluert i et høyt volum, sentralt laboratorium [10, 11 ].
motsetning brystkreft, er histopatologi av magekreft i form av HER2 ansett for å være mer heterogene og fokal overekspresjon av genamplifisering er hyppig observert [12]. Derfor er vanskeligheter med å bestemme HER2 status forventet å være mer markert enn i brystkreft. Totalt sett, tatt disse resultatene i betraktning, er mer pålitelige, reproduserbare og tidssparende metoder for å vurdere den HER2 status på magekreft nødvendig. Bare noen få publiserte studier som kombinerer IHC og in situ hybridisering metoder (men ikke SISH) på ett lysbilde har blitt utført [13-16]. Avhandlinger studiene benyttet standard IHC og kromogene eller fluorescens in situ hybridisering (CISH eller FISH) som enkeltmetoder og sammenlignet dem med en simultan analyse (kombinert på ett lysbilde) og funnet god samsvar med resultatene av enkelt flekker. Så langt vi kjenner til, men det finnes ingen studier som direkte sammenlign resultatene av både immunhistokjemi (IHC) og sølv in situ hybridisering (SISH) når hver brukes separat med resultatene av å bruke dem i kombinasjon på en enkelt seksjon i mage Kreftsvulster.
i denne studien ble det HER2 protein uttrykk og genamplifikasjon status på 100 mage adenokarsinomer og karsinomer i esophagogastric krysset undersøkt av konvensjonell IHC og ISH enkle metoder (IHC /SISH) og parallelt med ny metode som kombinerer begge metoder (-gen /protein). Hensikten med denne studien var å vurdere likeverdighet i det nye genet-protein plattform i forhold til de enkelte fargemetoder.
Metoder
Pasienter og vevsprøver
formalinfiksert parafin-embedded (FFPE) tumorprøver fra 100 pasienter med mage eller gastroøsofageal krysset adenokarsinom ble valgt ut fra en vev arkiv av prøvene ved institutt for patologi ved Krankenhaus Nordwest. Prosjektet ble utført med tillatelse fra ansvarlig etikk komité. For hvert tilfelle ble fire forskjellige fargemetoder brukes i henhold til produsentens FDA-godkjente prosedyrer: hematoxylin og eosin (H & E) for å vurdere prøven dekningen og å bekrefte histologisk subtype, immunhistokjemi (IHC) for å evaluere HER2 protein uttrykk, sølv in situ hybridisering (SISH) for å evaluere genamplifikasjon og romanen gen-protein plattform som kombinerer IHC og SISH på ett lysbilde.
Immunohistochemistry
IHC ble utført med FDA-godkjente Ventana PATHWAY kanin monoklonalt antistoff 4B5 klone og med Ultra DAB Detection Kit (Ventana) på en Benchmark XT automatisert Stainer (Ventana, Tucson, AZ). Kort sagt ble vevssnittene deparaffinized med EZ Prep ved 75 ° C og 76 ° C, varme forbehandlet i celle Conditioning 1 (CC1) for antigen gjenfinning ved 76 ° C - 100 ° C, og deretter inkubert med anti-HER2-primær antistoff for 16 minutter ved 37 ° C etter inaktivering av det endogene peroksidase ved hjelp av UV-inhibitor i 4 min ved 37 ° C. Glassene ble inkubert med et sekundært antistoff, etterfulgt av påføring av HRP Universal-multimer i 8 min. Antistoffer ble påvist ved anvendelse av kromogen (for 38 min). Før du monterer, ble lysbilder kontra med hematoksylin II for 4 min og bluing reagens for 4 min. For å støtte gyldigheten av flekker og identifisere eksperimentelle gjenstander, ble en positiv kontroll inkludert i hver kjøring.
Silver in situ hybridisering
Dual farge SISH ble utført i henhold til INFORM HER2 Dual ISH DNAProbe cocktail og Ultra SISH DNP Detection Kit /Ultra RED ISH DIG Detection Kit for HER2 og Chr 17 kvantifisering og prosedyre (Ventana /Roche). Begge prober ble merket med 2,4-dinitrofenol (DNP) og digoksigenin (DIG). Vevet Glassene ble deparaffinized med EZ Prep ved 65 ° C-76 ° C og varme forbehandlet med EZ Prep-fortynnet Cell Conditioner 2 (CC2) ved 90 ° C etterfulgt av protease nedbrytning med ISH Protease 3 til 16 minutter ved 37 ° C. De genomiske DNA-vevssnitt og nick-translatert HER2 og Chr 17 prober ble ko-denaturert ved varmebehandling i 20 minutter ved 80 ° C etterfulgt av et trinn hybridisering i 6 timer ved 44 ° C. HER2-signaler ble detektert ved bruk av kanin-anti-DNP-antistoff i 20 minutter ved 37 ° C og inkubert med et HRP-konjugert geite-anti-kanin-antistoff i 16 minutter ved 37 ° C etter tre 8 min stringens vaskinger. Signalet ble påvist som sølvrestene med sølvacetat, hydrokinon og hydrogenperoksyd. For Chr 17 deteksjon, ble platene inkubert med mus-anti-DIG-antistoff i 20 minutter ved 37 ° C og med et AP-konjugert geit-anti-mus-antistoff i 24 minutter ved 37 ° C. Chr 17 signal ble utviklet som red dot flekker med rask rød og naftol fosfat. Glassene ble endelig kontra med hematoksylin II og bluing reagent før montering.
Gene /protein
Gene /protein plattform kombinerer IHC og SISH på ett lysbilde. For å støtte gyldigheten av flekker og identifisere eksperimentelle gjenstander, ble en positiv kontroll inkludert i hver run.For HER2 protein flekker og for HER2 /Chr 17 hybridisering, ble det iView DAB Detection Kit og Ultra Detection Kits brukt. Prøvene ble beiset under flere av analysebetingelser for å gjennomføre en optimal protokoll for å oppnå IHC /SISH fargingsresultater kan sammenlignes med de av individuell IHC og SISH testing. Optimaliseringen ble utført i laboratoriet av Ventana (Roche) og delvis på eget arbeid. Optimale resultater ble oppnådd ved å utføre IHC prosedyre før SISH prosedyren.
Prøvene ble deparaffinized med EZ Prep ved 72 ° C i 6 sykluser. For HER2 proteinfarging, vevssnittene ble varme forbehandlet i CC1 for antigen gjenfinning ved 95 ° C og deretter inkubert med anti-HER2-primær antistoff ved 37 ° C i 48 min etter inaktivering av det endogene peroksidase ved hjelp av UV-inhibitor i 4 minutter ved 37 ° C. Glassene ble inkubert med et biotinylert sekundært antistoff, etterfulgt av påføring av HRP-konjugert streptavidin i 8 min. En kobber forsterket DAB reaksjonsblandingen ble brukt for å visualisere proteinet. For HER2-genet og CHR 17 flekker, prøvene ble varme forbehandlet med EZ Prep-fortynnet CC2 ved 90 ° C i fire sykluser etterfulgt av protease-spalting med ISH Protease 2 i 12 min ved 37 ° C. Probene ble denaturert i 4 min ved 80 ° C og hybridisert i 6 timer ved 44 ° C ved hjelp av en cocktail av DNP og DIG-merkede prober. HybClear oppløsning ble tilsatt for å blokkere interaksjonen mellom DNP og DAB-innskudd i løpet av hybridiseringen. Genet signaler ble detektert ved bruk av kanin-anti-DNP-antistoff i 16 minutter ved 37 ° C og inkubert med et HRP-konjugert geite-anti-kanin-antistoff i 16 minutter ved 37 ° C etter fire 8 min stringens vaskinger. Signalet ble utviklet av sølv innskudd med sølvacetat, hydrokinon og hydrogenperoksyd. For Chr 17 deteksjon, ble platene inkubert med mus-anti-DIG-antistoff i 16 minutter ved 37 ° C og med et AP-konjugert geit-anti-mus-antistoff i 24 minutter ved 37 ° C. Chr 17 signal ble utviklet som red dot flekker med rask rød og naftol fosfat. Før du monterer, ble lysbilder kontra med hematoksylin II for 8 min og bluing reagens for 4 min.
Pathology gjennomgang
Prøvene ble uavhengig tolket av en patolog (AB) og en biolog trent i magekreft histologi (DW). Observatørene fikk prøvene tilfeldig, dvs. SISH, IHC, og kombinerte metode ble ikke evaluert i forbindelse med hverandre, men separat for hver enkelt pasient. Konsensus av både lesere ble funnet etter hver evaluering. Fordi uharmoniske resultater mellom begge metoder kan være et resultat av intra-observatørvariasjon snarere enn forskjeller i fargekvalitet, uharmoniske saker ble revurdert av en tredje observatør som var blindet til resultatene av den første evalueringen, men evaluert uharmoniske tilfeller (metoder) i forbindelse med hverandre. Endelig enighet ble etablert mellom tredje observatør og de primære observatører.
IHC resultater ble tolket med scoring ordningen foreslått for magekreft ved Hofmann et al. [17] og Rüschoff et al. [18]: 0, ingen reaktivitet eller membran reaktivitet i < 10% av tumorceller; 1+, svak /knapt merkbar membran reaktivitet i > 10% av tumorceller; 2+, svak til moderat komplett, lateral eller basolateral membran reaktivitet i > 10% av tumorceller; og 3+, sterk fullført, lateral eller basolateral membran reaktivitet i ≥ 10% av tumorcellene.
I SISH resultater, ble det totale antall HER2 og kromosom 17 signaler som telles i minst 20 tumorcellekjerner i to forskjellige områder. De HER2 /Chr 17 forhold ble tolket i samsvar med toga FISH scoring ordning for HER2-testing i mage og gastroøsofageal krysset (GEJ) kreft som følger: < 2.0, HER2 genet ikke forsterket; ≥ 2,0, HER2 gen forsterkes [17]. En gjennomsnittlig telling av seks eller flere ble ansett som forsterket.
Statistisk analyse
analysen var utforskende med ingen forhåndsdefinerte hypotese eller sample size beregninger. Antallet av 100 pasienter ble ansett tilstrekkelig til å utføre den foreslåtte statistiske tester. Sammenhenger mellom IHC /SISH og gen /protein ble estimert ved hjelp Cohen's kappa koeffisient (к). Kappa tolkningen av Altmann [19] ble brukt: к > 0,81, veldig god avtale, 0,61 til 0,80, god avtale; 0,41 til 0,60 moderat enighet; 0,40 til 0,21, rettferdig avtale; ≪ 0,20, svak avtale. Statistiske analyser ble utført ved hjelp av WinStat programvare (R.Fitch Software, versjon 2009.1).
Resultater
Pasient egenskaper
Nitti seks av de 100 pasient tilfellene var assessable. Ett tilfelle ble ekskludert på grunn av fravær av tumorceller og tre tilfeller for dårlige signaler i én SISH farging.
Fleste pasientene var menn (67,7%) og ≥ 65 år (70,8%) (tabell 1). Kohorten består av pasienter med adenokarsinom i midten distal magen (50,0%) eller GEJ (45,8%) med flere tilfeller av Lauren`s tarm (67,7%) enn diffuse tumorer (28,1%). Graderingen av flertallet av prøvene var G3 (50,0%), etterfulgt av G2 (39,6%) og svulster klassifisert som G2-3 (10,4%). 85,7% av resected pasienter (n = 28) viste lymfeknutemetastase (N scenen) og 64,3% viste ingen fjernmetastaser (M scenen). I halvparten av de resected pasientene, ble T3 tumorstadium observert, etterfulgt av T2 på 28,6%, T1 på 14,3% og T4 stadium i 7,1% av patients.Table 1 pasientens egenskaper og HER2 positivitet undergrupper

Total n = 96 (%)
Positivitet (IHC 3+ eller SISH +) enkelt n (%)
Positivitet (IHC 3+ eller SISH +) combi n (%)
Sex
Kvinne
27 (28,1)
2 (7,4)
1 (3,7)
Mann fra 65 (67,7)
11 (16,9)
11 (16,9)
Unknown
4 (4,2)
3 (75,0)
3 (75,0)
Age
18-94 år (median 69)
≥ 65
68 (70,8)
12 (17,6)
11 (16,2)
< 65
28 (29,2)
fire (14,3)
fire (14,3)
primær tumor plassering
Midt i distal magen
48 (50,0)
5 (10,4)
4 (8,3)
GEJ
44 (45,8)
8 (18,2)
8 (18,2)
Ikke spesifisert
4 (4,2)
3 (75,0)
3 (75,0)
Lauren klassifisering
Diffuse
27 (28,1)
3 (11,1)
2 (7,4)
Blandet
4 (4,2)
1 (25,0)
1 (25,0)
Tarm
65 (67,7)
12 (18,5)
12 (18,5)
Biopsi /reseksjon
Biopsi
68 (70,8)
10 (14,7)
9 (13,2)
reseksjon
28 (29,2)
6 (21,4)
6 (21,4)
T scenen (n = 28)
T 1
fire (14,3)
0
0
T 2
8 (28,6)
2 (25,0)
2 (25,0)
T 3
14 (50,0)
fire (28,6)
fire (28,6)
T 4
2 (7,1)
0
0
N scenen (n = 28)
N +
24 (85,7)
5 (20,8)
5 (28,8)
N -
fire (14,3)
1 (25,0)
1 (25,0)
M scenen (n = 28)
M +
5 (17,9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M -
18 (64,3)
3 (16,7)
3 (16,7)
Mx
5 (17,9)
2 (40.0)
2 (40.0)
Gradering
G2
38 (39,6)
6 (15,8)
6 (15,8)
G2-3
10 (10,4)
2 (20,0)
2 (20.0)
G3
48 (50,0)
8 (16,7)
7 (14,6)
Forkortelser
: IHC
immunhistokjemi, SISH
sølv in situ hybridisering T
primærtumor, N
lymfeknuter, M
metastaser * definert som IHC 3+ eller SISH ≥2.0.
P
= 1 for alle sammenligninger mellom IHC /SISH og gen /protein metoder (Fisher eksakte test).
i tabell 1 HER2 positivitet undergrupper er også presentert. Ingen signifikant forskjell ble notert i HER2 positivitet i forhold til undergrupper og ulike metoder.
Farging resultater for HER2 protein uttrykk og genamplifikasjon (enkle fargemetoder)
Protein uttrykk score ved IHC var 0 og 1 + i 70,8% og 10,4% av pasientene (tabell 2). 2,9% av poengsummen 0 og 10,0% av poengsummen 1 + saker ble forsterket. I 9,4% av tilfellene, en moderat uttrykk (skår 2 +) med 44,4% forsterkede tilfeller ble oppdaget. 9,4% av de fargede prøvene viste et sterkt uttrykk (skår 3 +) med 77,8% forsterket tilfeller. Figur 1 viser representative resultater fra enkelt staining.Table 2 Farging resultater for HER2 protein uttrykk og genamplifikasjon Book Enkel metode Book Kombinert metode Book IHC Score
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2,0
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2,0
n (%)

n (%)
n (%)
n (%)
0
68 (70,8)
2 (2,9)
68 (70,8)
2 (2,9)
1+
10 (10,4)
1 (10,0)
11 (11,5)
1 (9,1)
2+
9 (9,4)
fire (44,4)
7 (7,3)
2 (28.6)
3+
9 (9,4)
7 (77,8)
10 (10.4)
9 (90,9)
Forkortelser
: IHC
immunhistokjemi, SISH
sølv in situ hybridisering
Figur 1 Representative resultatene av de ulike fargemetoder.. Intestinal tumor (hematoxylin og eosin (H & E), A.1, 20x) med IHC 3+ (immunhistokjemi (IHC), A.2, 20x, gen /protein, A.4, 20x) og forsterkning (sølv in situ hybridisering (SISH), A.3, 40x, gen /protein, A.4, 20x). IHC 0 poeng (IHC, B.2, 20x, gen /protein, B.4, 40x), intestinal type (H & E, B.1, 20x) og forsterkning (SISH, B.3, 40x, gen /protein , B.4, 40x).
Gene /protein (kombinert fargemetode)
protein uttrykk poeng ved gen /protein metode var 0, 1+, 2+ og 3+ i 70,8%, 11,5%, 7,3 % og 10,4% (tabell 2). Det var 2,9% /9,1% forsterket tilfeller i prøver med stillingen 0/1 +. 28,6% forsterket tilfeller viste en moderat farging (poengsum 2+). Prøver med høyt uttrykk (3+) viste i 90,9% genamplifikasjon. Eksempler på gen /protein flekker er vist i Figur 1.
Evaluering av konkordant og uharmoniske tilfeller
Vurderingen av IHC flekker i den konvensjonelle enkelt og genet /protein metoden ikke alltid avsløre kongruente resultater; avtaler av begge metoder ble også oppført i tabell 3 Det var veldig gode konkordanser i resultatene av forsterkede tilfeller (avtale 100,0%, Kappa-koeffisient κ = 1), samt med 0 (100%, κ = 1), poengsum 1+ ( 98,96%, κ = 0,947) og scorer 3+ tumorprøver (96,88%, κ = 0,825) i begge metodene. Saker med poengsum 2+ viste mindre samstemmighet, men fortsatt god (95,83%, κ = 0,728). Samsvar mellom den generelle HER2 positivitet (definert som IHC 3+ eller SISH +) i standard eller ny metode var veldig bra (98,69%, κ = 0,963; 17,7% vs. 16,7%) Tabell 3 Konkordanser mellom enkeltmetoder og kombinert gen /protein. metoder
Enkelt vs. kombinasjon
Concordance
Kappa-Coefficient к
avtalen Altmann [[15]]
SISH forsterket
100 %
1 Meget god
IHC 0 poeng
100%
1 Meget god
IHC poengsum 1+
98,96%
0,947
Veldig god
IHC poengsum 2+
95,83%
0,728
god
IHC poengsum 3+
96,88%
0,825
Meget bra
Forkortelser
: IHC
immunhistokjemi, SISH
sølv in situ hybridisering.
Det var tolv avvikende tilfeller før re-analyse av en tredje observatør (data ikke vist). Etter re-evaluering av en tredje observatør, forble avvikende resultater i fire tumorprøver. Årsaken til de åtte avvikende tilfeller i interimanalyse ble funnet å være intra-observatør variabilitet. Resultater av de endelige uharmoniske Resultatene er vist i tabell 4.Table 4 Detaljert evaluering av uharmoniske resultater mellom metoder Book Enkle metoder Book Kombinert metode
sak
histologi (Lauren)
IHC (Score)
SISH (≥ 2,0 /< 2,0)
IHC (Score)
SISH (≥ 2,0 /< 2,0)
6693
jeg
2+
≥2.0
3+
≥2.0
9924
jeg
2+
< 2,0
1+
< 2,0
20209
jeg
2+
≥2.0
3+
≥2.0
1057
d
3+
< 2,0
2+
< 2,0
Forkortelser
. IHC
immunhistokjemi, SISH
sølv in situ hybridisering
diskusjon
Målet med denne studien var å vurdere muligheten for nye genet /protein plattform i forhold til de enkelte fargemetoder i mage adenokarsinomer og karsinomer i esophagogastric krysset.
av evaluerbare prøvene 28,1% viste en diffus, 4.2 % en blandet og 67,7% en intestinal histologisk type. Flertallet av pasientene var ≥ 65 år (70,8%) og mannlige (67,7%). Satsen for adenokarsinom av GEJ eller midten distal magen var lik (45,8% vs. 50,0%). I standardmetoden, 17,7% av pasientene var HER2-positiv. Flertallet av HER2-positive tumorer var av intestinal histologi og ble lokalisert i den GE krysset, dette korrelerer godt med data fra litteraturen [20, 21]. Totalt sett, basert på pasientens og tumor egenskaper samt HER2 positivitet, er evaluert gruppen en representant kollektiv.
Selv betydelig erfaring for HER2 analyse av IHC og ISH for brystkreft er tilgjengelig, er det usikkert om de kan være direkte overføres til karsinomer i mage-tarmkanalen. Ekspresjonen av HER2-protein, i motsetning til i brystkarsinom, er heterogen og ofte fokalt uttalt. Fox et al. [12]. bestemmes HER2 status i 100 vevsprøver diagnostisert med avansert magekreft eller kreft i esophagogastric krysset i forskjellige laboratorier for å teste sine kamper. For dette, IHC og CISH (kromogen in situ hybridisering) eller SISH ble brukt. Det var en god overensstemmelse mellom de ulike laboratoriene om CISH eller SISH, men ble observert moderat samstemmighet for alle IHC score. Basert på resultatene av undersøkelsen, forfatterens mening var at en bestemmelse av HER2 status basert på IHC, etterfulgt av ISH (europeisk standard) er ikke en optimal evaluering strategi og anbefalte utføre begge fargemetoder [12]. En annen studie [22] testet HER2 forsterkning og uttrykk i 148 pasienter med avansert magekreft ved IHC og FISH /SISH. Positive HER2 tilfeller ble detektert i bare 10% av IHC, sammenlignet med 18% til 22% i in situ hybridisering. Ikke bare fordi det var lettere å reprodusere, forfatteren foreslås det in situ hybridisering teknikk som bedre metode for bestemmelse av HER2-positivitet [22]. Men basert på TOGA rettssaken [8], pasienter med ISH positiv men IHC negativ eller ukentlig (1+) positive tumorer ikke dra nytte av trastuzumab. Derfor er bruk av FISH eller SISH som den primære og eneste metoden ikke anbefales i Europa og IHC er fortsatt betraktet som den primære evalueringsmetode i mange land.
Så langt vi kjenner til, men det er ingen studier som direkte sammenligne resultatene fra både immunhistokjemi (IHC) og sølv in situ hybridisering (SISH) når hver benyttes separat med resultatene av å anvende dem i kombinasjon på en enkelt seksjon i gastriske karsinomer. For å visualisere RNA og DNA-mål i situ, det er forskjellige måter merking sonder bruker fluorescens, kromogen eller sølv gjenkjenning. Alle tidligere studier med innstillinger kan sammenlignes med vår analyse brukt kromogen eller fluorescens in situ hybridisering (CISH eller FISH). Downs-Kelly et al. [14] kombinert standard IHC med deponering av metallisk sølv av EnzMetTM på en vev microarray (TMA) av brystcarsinomer og sammenlignet resultatene av IHC og fluorescens in situ hybridisering (FISH) når utført alene. I en annen studie, har forfatterne faktisk brukt en kombinasjon av IHC og sølv in situ hybridisering (SISH) i TMA av bryst og mage kreft prøver, men sammenlignet resultatene fra de som oppnås ved IHC og fluorescens in situ hybridisering (FISH) som singel flekker [16]. Reisenbichler et al. [15] rapporterte resultatene av sammenligningen av IHC og kromogen in situ hybridisering (CISH) som enkelt stainings med den doble analysen IHC /CISH. Den samtidige evaluering av protein og genkombinasjoner på et enkelt lysbilde tilbudt en meget reproduserbar og svært robust metode med gode konkordanser.
Å teste gyldigheten av den nye gen /protein flekker forhold til det standardiserte IHC og SISH ble konkordanser beregnet basert på kappa koeffisient. Ifølge ASCO /CAP retningslinjer for brystkreft, bør en ny test viser mer enn 95% samstemmighet med en validert henvisning analyse [23]. I vår studie viste den nye metoden konkordanser over 95% i forhold til alle testresultater. Det var svært gode konkordanser i resultatene av genamplifisering samt med 0 (hver med 100% enighet), score 1+ (98,96% enighet) og scorer 3+ tumorprøver (96,88% enighet). Saker med resultatet viste 2+ mindre samstemmige resultater, men fortsatt god (95,83% enighet). Vanskeligheter i tilfeller med moderat ekspresjon i vurderingen og klassifisering er kjent i litteraturen. Tafe et al. [24]. viste at det var vanskeligheter med å tildele et sluttresultat i evalueringen av IHC på grunn av mangel på pålitelig separasjon av tilfeller med en HER2-score på 1 + 2 eller +. Disse kategoriene kan være begrenset av subjektivitet og dårlig reproduserbarhet. Fenomenet som uharmoniske resultater er observert hos pasienter med lav HER2 uttrykk, som noen ganger fortsatt har HER2 genamplifisering, er rapportert hos kreftfaren [24-26]. Den mest sannsynlige årsak til denne uoverensstemmelse er intra-tumor heterogenitet av HER2-status i magekreft eller GEJ [17, 27, 28]. I vår studie ble uharmoniske IHC resultater observert i fire pasienter, men disse har ført til en klinisk relevant forskjell i HER2 positivitet i en pasient bare (pasienti7). Pasienten hadde diffuse typen magekreft. Evalueringen av diffuse tumorer synes å være vanskeligere enn tarm typen svulster [29, 30]. Ifølge Rüschoff et al. [18]. bare 5% av disse svulstene viser HER2 positivitet; signet ring karsinomer er negative. HER2-amplifikasjon er ekstremt sjeldne i diffus gastrisk karsinom som er assosiert med unormal E-cadherin uttrykk [13, 31-33].
SISH er en relativt ny metode for påvisning av forsterkningen av HER2-genet. Tallrike studier bekrefter et høyt samsvar med andre in situ hybridisering metoder som CISH og FISH [34]. Sammenlignet med IHC, viser ISH en høyere sensitivitet og spesifisitet og en høyere reproduserbarhet. Denne uttalelsen kan bekreftes ved å sammenligne samsvar med forsterkede saker i våre metoder. Resultatene viste en veldig god avtale mellom begge metodene (100,0%, к = 1). Videre er ISH mindre følsom enn IHC på grunn av en relativ stabilitet av DNA i forhold til forskjeller i vev fiksering og behandling.
Vi jobber for tiden med en utvidet studie vurdere om denne nye metoden er assosiert med en reduksjon av inter-observatør variabilitet i fastsettelse av HER2-status i magekreft. Denne studien innbefatter også en komponent som ser på den tid som trenges til å rapportere resultater. Resultatene vil bli sendt til tidsskriftet som brev eller en opprinnelige rapporten, så snart de er tilgjengelige
. Konklusjoner
I denne studien har vi klart vist at bruk av den kombinerte metoden for å utføre HER2 protein uttrykk og genamplifisering på en enkelt side kan gi resultater som ligner på de som bruker hver metode enkeltvis i en kontrollert studie gjennomføre tre uavhengige observatører. Alle forfattere lese og godkjent den endelige manuskriptet.

• Langtidseffekter av laparoskopisk sleeve gastrektomi versus Roux-en-Y gastrisk bypass for behandling av 2 diabetes mellitus pasienter kinesisk type med kroppsmasseindeks 28-35 kg /m2
• Polymorfismer av TGFB1 og VEGF gener og overlevelse av pasienter med mage cancer