Az érvényesítési egy új módszer kombinálásával egyaránt HER2 immunhisztokémiai HER2 kétszínű ezüst in situ hibridizáció egy csúszda gyomorrák vizsgálata

Az érvényesítési egy új módszer kombinálásával egyaránt HER2 immunhisztokémiai HER2 kétszínű ezüst in situ hibridizáció katalógusa egyik csúszda gyomorrák vizsgálata katalógusa Abstract Background katalógusa katalógusa HER2 állapotfelmérés előfeltétele létrehozásának megfelelő kezelési stratégia a gyomorrák. Gyomorrák nagyon sokrétűek, és külön értékelések génamplifikációra és fehérje expressziós vezet bizonytalanságok lokalizálása különböző klónok, és időigényes. Ez a tanulmány értékeli a egyenértékűségét új módszer kombinálásával egyaránt gén és fehérje platformok egy dián. Katalógusa Methods katalógusa immunhisztokémia (IHC) és a HER2 kétszínű ezüst in situ hibridizáció (SISH) egyetlen módszer (IHC /SISH) gén-protein platform egyesíti a két módszer egy dián (gén /fehérje) végeztük véletlenszerűen gyűjtött 100 esetben gyomor adenokarcinóma. Eredményei IHC /SISH összevetettük gén /fehérje-festéssel. Katalógusa eredményei
96 100 minta volt értékelhető. A gén /fehérje-festéssel, patológusok értékelni tudták génamplifikáció és az ebből következő fehérje expresszióját az egyes sejtek szintjén. Összehasonlításképpen vizsgálatokban génamplifikációval megfigyelhető 14,6% mindkettő hagyományos SISH és gén /fehérje platform (megegyezés 100%; Kappa-együttható κ = 1,0). A fehérje expresszióját pontszámok az IHC volt 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+), és 9,4% (3+). Fehérje expresszióját gén /fehérje módszer voltak: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) és 10,4% (3+) a betegek. Voltak teljes konkordancia az IHC vizsgálat az esetek pontszám 0 (100,0%; κ = 1). Nagy konkordanciák jelennek pontszám 1+ (98,96%; κ = 0,947) és a 3+ (96,88%; κ = 0,825) azok az esetek, és jó konkordancia a 2+ esetben (95,83%; κ = 0,728). Katalógusa következtetések
Ez az új kombinált platform megvan az az előnye, hogy képes értékelni mind gén és fehérje állapotát ugyanazon ráksejtek és lehet különösen érdekes a kutatás és a betegek gondozására.
cikk kategóriában katalógusa Disease biomarker. katalógusa kulcsszavak
Gyomorrák HER2 Immunhisztokémia Ezüst in situ hibridizáció Gene-protein assay alapon
A HER2 onkogént (más néven a HER2 /neu vagy erbB-2) kromoszómán 17q21, kódol 185 kD transzmembrán tirozin-kináz-receptor, amely tartozik az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) családjának tartalmaz EGFR /HER1, HER2, HER3 és HER4. HER2 aktiválás központi szerepet játszik a sejtproliferációban és túlélését, nagyrészt közvetített RAS-MAPK útvonal. Gátolja továbbá sejthalál keresztül a foszfatidilinozitol-3'-kináz-Akt-mammalian target of rapamycin (mTOR) útvonal. HER2 overexpresszió számoltak be a különböző szilárd tumorokban [1-7]. Gene amplifikációk ritkák más betegségek és az anti-HER2-terápia jelenleg érvényesítése csak a mell és a gyomor rák.
Eredményei alapján a ToGA vizsgálat [8], a trasztuzumab hagyta jóvá az áttétes adenocarcinoma a gyomor és gastrooesophagealis csomópont kombinációs terápia az Egyesült Államokban és Európában. Követelmény bizonyítéka HER2-expressziót. Európában ez határozza meg az IHC 3+ eredmény vagy IHC 2+ és pozitív FISH vagy SISH eredmény (hányados ≥ 2,0). IHC tartották az elsődleges módszer, mert IHC negatív vagy pozitív heti (1+) a betegek nem részesülhetnek trastuzumab a ToGA tárgyalás, bár voltak ISH pozitív. A szakirodalomban azonban, jelentős változás a immunhisztokémiai pozitivitás meghatározva. Itt az aránya, HER2 pozitív előrehaladott gyomorrák adenocarcinoma változik tanulmány tanulni, 5% -ról 30% [9], valószínűleg a különböző elemzési jegyzőkönyvek és értelmezési kritériumokat.
Leendő substudies két adjuváns randomizált vizsgálatokban trastuzumab versus nulla emlőrák kimutatták, hogy mintegy 20% -a HER2-vizsgálatot végezni a helyszínen intézmény (az elsődleges kezelés helyén a patológiai osztály) helytelenek voltak, amikor az azonos mintából újra értékelték a nagy mennyiségű, központi laboratóriumban [10, 11 ].
ellentétben a mellrák, a kórszövettani gyomorrák szempontjából HER2 kell tekinteni heterogénebb és fokális overexpressziója génamplifikáció gyakran megfigyelhető [12]. Ezért nehézséget okoz annak megállapítása a HER2-státus várhatóan még kifejezettebb, mint a mellrák. Összességében ezek az eredmények vett figyelembe, megbízhatóbb, reprodukálható, és időt megtakarító módszereinek a HER2 státusz gyomorrákban van szükség. Csak kevés publikált tanulmány ötvözi IHC és in situ hibridizációs módszerekkel (de nem SISH) egy dián végeztek [13-16]. Tézisek tanulmányok hasznosított szabvány IHC és kromogén vagy fluoreszcens in situ hibridizáció (CISH vagy FISH) egyetlen módszerek és összehasonlították őket a szimultán elemzés (kombinált egy dián), és találtam jó egybehangzóan eredményeit egyetlen festés. Ahhoz, hogy a legjobb tudásunk, azonban nincs olyan tanulmány, amely közvetlenül összehasonlítani eredmények mindkét immunhisztokémiai (IHC) és ezüst-in situ hibridizáció (SISH), amikor az egyes alkalmazunk külön-külön az eredménnyel a használja őket kombinálva egyetlen szakasz a gyomor carcinoma.
a jelen vizsgálatban a HER2 fehérje expresszióját és gén amplifikációs státusza 100 gyomor adenocarcinoma és carcinomák a nyelőcső találkozásánál vizsgáltuk hagyományos IHC és ISH egységes módszerek (IHC /SISH), és ezzel párhuzamosan az új eljárással kombinálásával mindkét módszer (gén /fehérje). A vizsgálat célja az volt, hogy értékelje a egyenértékűségét az új gén-protein platform képest az egyetlen festési eljárások. Katalógusa Módszerek katalógusa Betegek és szövetminták katalógusa formalinban fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) tumor minták 100 beteg gyomor- vagy gastrooesophagealis csomópont adenocarcinoma közül választották ki a szöveti archív minták Intézetének Patológia Krankenhaus Nordwest. A projekt a engedélyével a felelős etikai bizottság. Minden esetben négy különböző festési eljárások szerint használtuk a gyártó termékével FDA által jóváhagyott eljárások: hematoxilin-eozin (H &E), hogy értékelje a minta megfelelőségének és megerősíteni a szövettani altípus, immunhisztokémiai (IHC), hogy értékelje a HER2 fehérje kifejezés, ezüst in situ hibridizáció (SISH), hogy értékelje a génamplifikáció és az új gén-protein platform, amely egyesíti a IHC és SISH egy dián. katalógusa immunhisztokémiai katalógusa IHC végeztünk az FDA által jóváhagyott Ventana PATHWAY nyúl monoklonális antitest 4B5 klón és a Ultraview DAB Detection Kit (Ventana) a viszonyítási XT automatikus Stainer (Ventana, Tucson, aZ). Röviden, a szöveti metszeteket paraffint EZ Prep 75 ° C-on és 76 ° C, hő előkezelt Cell Conditioning 1 (CC1) az antigén-visszanyerés 76 ° C hőmérsékleten - 100 ° C-on, majd inkubáljuk az anti-HER2 primer antitesttel 16 percen át 37 ° C-inaktiválása után az endogén peroxidáz segítségével UV-inhibitor 4 percig 37 ° C-on. A metszeteket egy szekunder antitesttel, majd az alkalmazás HRP Univerzális Multimer 8 percig. Ellenanyagokat kromogén (38 perc). A szerelés előtt, metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük II 4 percig és kékre futtatás reagens 4 min. Hogy támogassa érvényességének festéssel és azonosítani a kísérleti tárgyak, pozitív kontrollként szereplő minden távon. Katalógusa Silver in situ hibridizáció katalógusa Kétszínű SISH szerint végeztük INFORM HER2 Dual ISH DNAProbe koktél és Ultraview SISH DNP Detection Kit /UltraView RED ISH DIG Detection Kit HER2 és Chr 17 mennyiségi és eljárás (Ventana /Roche). Mindkét próbákat 2,4-dinitro-fenol (DNP), és digoxigeninnel (DIG). A szövet tárgylemezeket paraffint EZ Prep 65 ° C-76 ° C-on és a hő előkezeljük EZ Prep-hígított Cell balzsam 2 (CC2) 90 ° C hőmérsékleten, majd proteáz emésztés ISH proteáz 3 16 percen át 37 ° C-on. A genomiális DNS-t szöveti metszetek, és a nick-transzlatált HER2 és Chr 17 próbákat az co-denaturáltuk hőkezelés 20 percen át 80 ° C-on, majd egy hibridizációs lépés 6 órán át 44 ° C-on. A HER2 jelek alkalmazásával detektáltuk nyúl anti-DNP antitest 20 percig 37 ° C-on inkubáltuk egy HRP-vel konjugált kecske anti-nyúl antitesttel 16 percig 37 ° C-on, miután három 8 perc szigorúsági fokú mosás. A jel volt kimutatható, mint az ezüstöt betétek ezüst-acetát, hidrokinon és a hidrogén-peroxid. A Chr 17 kimutatására a lemezeket inkubáltuk egér anti-DIG antitest 20 percig 37 ° C-on és egy AP-konjugált kecske anti-egér antitesttel 24 percig 37 ° C-on. A Chr 17 jel alakult, mint red dot festés gyors piros és naftol-foszfát. A metszeteket végül kontrasztfestést hematoxilinnel II és kékre futtatás reagens szerelés előtt. Katalógusa Gene /fehérje katalógusa Gene /fehérje platform egyesíti IHC és SISH egy dián. Hogy támogassa a érvényességét festéssel és azonosítani kísérleti tárgyak, egy pozitív kontrollt is használtunk minden run.For HER2 fehérje-festéssel és a HER2 /CHR 17 hibridizáció, a IVIEW DAB Detection Kit és Ultraview Detection Kit használtunk. A mintákat festettük alatt több vizsgálati körülmények között végrehajtani az optimális protokoll eléréséhez szükséges IHC /SISH festési eredményeket hasonlóak az egyéni IHC és SISH tesztelés. Az optimalizálási végeztük laboratóriumában Ventana (Roche) és részben saját munkáját. Optimális eredmények születtek, hogy elvégezzük a IHC előtti eljárás SISH eljárást.
Mintákat paraffint EZ Prep 72 ° C-on 6 cikluson keresztül. HER2 fehérje-festéssel, a szöveti metszeteket hő előkezelt CC1 antigén visszakeresés 95 ° C hőmérsékleten, majd inkubáljuk az anti-HER2 primer antitest 37 ° C-on 48 percig inaktiválása után az endogén peroxidáz segítségével UV-inhibitor 4 percig 37 ° C-on. A metszeteket egy biotinilált másodlagos antitesttel, majd az alkalmazás HRP-konjugált sztreptavidinnel 8 percig. A réz fokozott DAB reakcióval láthatóvá a fehérjéhez. HER2 gén és a CHR 17 festéssel, mintákat hővel előkezelt EZ Prep-hígított CC2 90 ° C-on négy ciklusban, melyet proteáz emésztés ISH Protease 2 12 percig 37 ° C-on. A próbákat denaturáljuk, 4 percen át 80 ° C-on hibridizáltuk 6 órán át 44 ° C-on egy koktél DNP- és DIG-jelölt próbák. HybClear oldatot adtunk, hogy blokkolja a kölcsönhatás a DNP és a DAB betét hibridizáció során. A gén jelek alkalmazásával detektáltuk nyúl anti-DNP antitest 16 percig 37 ° C-on inkubáltuk egy HRP-vel konjugált kecske anti-nyúl antitesttel 16 percig 37 ° C-on négy után 8 perc szigorúsági fokú mosás. A jel által kifejlesztett az ezüst betét ezüst-acetát, hidrokinon és a hidrogén-peroxid. A Chr 17 kimutatására a lemezeket inkubáltuk egér anti-DIG antitest 16 percig 37 ° C-on, és egy AP-konjugált kecske anti-egér antitesttel 24 percig 37 ° C-on. A Chr 17 jel alakult, mint red dot festés gyors piros és naftol-foszfát. A szerelés előtt, metszeteket hematoxilinnel ellenfestettük II 8 percig és kékre futtatás reagens 4 min. Katalógusa Pathology felülvizsgálat
A mintákat önállóan értelmezni egy patológus (AB) és egy biológus képzett gyomorrák szövettan (DW). A megfigyelők megkapta a mintákat véletlenszerűen, azaz SISH, IHC, és a kombinált módszer nem értékeltük társítva egymással, de külön-külön minden egyes beteg számára. Konszenzus mindkét bírálók találták után értékelést. Mivel eredményei ellentmondásosak mindkét módszer lehet eredménye belüli megfigyelő változékonyság különbségek helyett a festés minősége, disszonáns esetet újra megvizsgáltuk egy harmadik megfigyelő, aki nem ismerte az eredmények az első értékelés, de értékelte a disszonáns esetek (módszerek) társítva egymással. Végül konszenzus jött létre a harmadik megfigyelő, és az elsődleges megfigyelők.
A IHC eredmények értékelését a pontozási rendszert javasolt gyomorrák Hofmann és munkatársai. [17] és Rüschoff et al. [18]: 0, nincs reaktivitás vagy hártyás reaktivitás < 10% a tumorsejtek; 1+ halvány /alig észrevehető hártyás reaktivitás > 10% a tumorsejtek; 2+, gyenge vagy mérsékelt teljes vagy oldalsó, illetve basolaterális hártyás reaktivitás > 10% a tumorsejtek; és 3+, erős teljes vagy oldalsó, illetve basolaterális hártyás reaktivitás ≥ 10% a tumorsejteket.
SISH eredmények teljes számát HER2 és 17. kromoszóma szignál megszámoltuk legalább 20 tumor sejtmagok két különböző területen. A HER2 /Chr 17 arány értelmezték megfelelően ToGA FISH pontozási rendszer HER2-vizsgálat a gyomor és gyomor-csomópont (GEJ) rák a következők: < 2.0 HER2 gén nem erősödött; ≥ 2,0 HER2 gén amplifikált [17]. Egy átlagos száma hat vagy több tekintették erősített. Katalógusa Statisztikai analízis katalógusa Az elemzés feltáró nincs előre meghatározott hipotézis vagy mintanagyság számítások. Száma 100 beteg tartották elegendő a javasolt statisztikai próbák. Összefüggések a IHC /SISH és gén /fehérje becsültük meg Cohen's kappa együttható (к). A kappa érték értelmezése szerint Altmann [19] használtuk: к > 0,81, nagyon jó megállapodást; 0,61-0,80, jó egyezést; 0,41-0,60 mérsékelt megállapodás; 0,40-0,21, tisztességes megállapodást; ≪ 0,20, enyhe megállapodást. A statisztikai elemzéseket végeztük WinStat szoftver (R.Fitch Software Version 2009,1). Katalógusa Eredmények katalógusa Betegjellemzők katalógusa kilencven hat a 100 beteg esetek értékelhető. Az egyik esetben kizárták, mert a hiánya tumorsejtek és három esetben a gyenge jeleket az egységes SISH festés.
A betegek többsége férfi (67,7%) és ≥ 65 év (70,8%) (1. táblázat). A kohorsz áll adenocarcinoma a középső gyomor distalis (50,0%), illetve GEJ (45,8%), több esetben Lauren`s bél (67,7%), mint a diffúz daganatok (28,1%). Az osztályozás a minták többsége volt a G3 (50,0%), majd a G2 (39,6%), illetve daganatok besorolt ​​G2-3 (10,4%). 85,7% -a eltávolított betegek (n = 28) azt mutatta, nyirokcsomó áttét (N stádium) és 64,3% nem mutatott távoli áttétek (M fázis). A felét a kimetszett betegek, T3 tumorstádium volt megfigyelhető, majd T2 28,6%, T1 14,3% és T4 szakaszban 7,1% patients.Table 1 páciens jellemzőit és HER2-pozitivitás által alcsoportok katalógusa
Az összes n = 96 (%) Matton pozitivitás * (IHC 3+ és SISH +) egyetlen n (%) Matton pozitivitás * (IHC 3+ és SISH +) kombi n (%) Matton Sex fiatal női katalógusa 27 (28,1) hotelben 2 (7.4) hotelben 1 (3,7) hotelben Férfi katalógusa 65 (67,7) hotelben 11 (16,9) katalógusa 11 (16,9) hotelben ismert katalógusa 4 (4,2) hotelben 3 (75,0) hotelben 3 (75,0) hotelben Kor
18-94 év (medián 69) hotelben ≥ 65 katalógusa 68 (70,8) hotelben 12 (17,6) hotelben 11 (16,2) hotelben < 65 katalógusa 28 (29,2) hotelben 4 (14.3) hotelben 4 (14.3) hotelben elsődleges daganat helyét katalógusa Mid a gyomor distalis katalógusa 48 (50,0) hotelben 5 (10.4)
4 (8,3) hotelben GEJ katalógusa 44 (45,8) hotelben 8 (18,2) hotelben 8 (18,2) hotelben Nincs megadva katalógusa 4 (4,2) hotelben 3 (75,0)
3 (75,0) hotelben Lauren besorolás katalógusa Diffúz katalógusa 27 (28,1) hotelben 3 (11,1) hotelben 2 (7.4) hotelben Vegyes katalógusa 4 (4,2)
1 (25.0) hotelben 1 (25.0) hotelben intestinalis katalógusa 65 (67,7) hotelben 12 (18,5) hotelben 12 (18,5) hotelben biopszia /reszekció katalógusa biopszia katalógusa 68 (70,8) hotelben 10 (14,7) hotelben 9 (13.2) hotelben Rezekciós katalógusa 28 (29,2) hotelben 6 (21.4) hotelben 6 (21.4) hotelben T stádium (n = 28) hotelben T1 katalógusa 4 (14.3) hotelben 0 katalógusa 0 katalógusa T 2

• Hosszú távú hatásai a laparoszkópos hüvely gastrectomia versus Roux-en-Y gyomor bypass kezelésére kínai 2. típusú diabetes mellitusban szenvedő betegek testtömegindexe 28-35 kg /m2
• Polimorfizmusa TGFB1 és VEGF gén és betegek túlélési gyomor cancer