La validation d'une nouvelle méthode combinant à la fois HER2 immunohistochimie et HER2 double couleur argent hybridation in situ sur une lame pour les tests de cancer de l'estomac

La validation d'une nouvelle méthode combinant à la fois HER2 immunohistochimie et HER2 double couleur argent l'hybridation de in situ sur une diapositive pour les tests de cancer de l'estomac
Résumé de l'arrière-plan
HER2 évaluation de la situation est une condition préalable à l'établissement de une stratégie de traitement approprié dans le cancer gastrique. cancers gastriques sont des évaluations très hétérogènes et séparées de l'amplification du gène et de la protéine d'expression conduisent à des incertitudes dans la localisation des clones distincts et prennent du temps. Cette étude évalue l'équivalence de la nouvelle méthode combinant les deux plates-formes de gènes et de protéines sur une diapositive
. Méthodes
immunohistochimie (IHC) et HER2 double couleur argent hybridation in situ (SISH) que des méthodes simples dans (IHC /SISH) et la plate-forme gène de protéine combinant les deux méthodes sur une diapositive (gène /protéine) ont été effectuées dans collectées au hasard 100 cas d'adénocarcinome gastrique. Résultats de résultats de IHC /SISH ont été comparés avec le gène /protéine coloration.
96 de 100 échantillons ont été évaluables. Dans la coloration de gène /protéine, les médecins ont pu évaluer l'amplification des gènes et l'expression protéique consécutive au niveau de la cellule unique. Au cours d'essais de comparaison, une amplification génique a été observée chez 14,6% par les deux, SISH classique et le gène /protéine de la plate-forme (convention de 100%; Kappa coefficient κ = 1,0). Protein expression scores par IHC étaient 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2 +) et 9,4% (3+). L'expression des protéines par la méthode de gène /protéine ont été: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) et 10,4% (3+) des patients. Il y avait des concordances complètes dans l'évaluation des cas IHC avec score à 0 (100,0%; kappa = 1). Hautes concordances sont présentés dans le score 1+ (98,96%; κ = 0,947) et 3+ (96,88%; kappa = 0,825) les cas et les bonnes concordances dans 2+ cas (95,83%; κ = 0,728). Conclusions

Ce roman combiné a l'avantage d'être en mesure d'évaluer à la fois génétique et l'état de la protéine dans la même cellule de cancer et peut être d'un intérêt particulier pour la recherche et les soins du patient.
article catégorie
maladie Biomarker.
Mots-clés
cancer gastrique HER2 argent immunohistochimie hybridation in situ du gène-dosage des protéines fond The oncogène HER2 dans (également appelé HER2 /neu ou erbB-2) situé sur le chromosome 17q21, code pour un récepteur tyrosine kinase transmembranaire de 185 kDa qui appartient à la famille du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) constitué d'EGFR /HER1, HER2, HER3 et HER4. l'activation HER2 joue un rôle central dans la prolifération cellulaire et la survie, principalement médiée par la voie RAS-MAPK. Il inhibe également la mort cellulaire par la phosphatidylinositol 3'-kinase-Akt-cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) voie. Surexpriment HER2 a été rapporté dans une variété de tumeurs solides [1-7]. amplifications géniques sont rares dans d'autres maladies et anti-HER2 thérapie est actuellement validée que dans le sein et les cancers gastriques.
Sur la base des résultats de l'essai ToGA [8], le trastuzumab a été approuvé pour l'adénocarcinome métastatique de l'estomac et gastroesophageal jonction thérapie combinée aux États-Unis et en Europe. Exigence est la preuve de la surexpression de HER2. En Europe, cela est défini par un résultat IHC 3+ ou un IHC 2+ et FISH positif ou résultat SISH (ratio ≥ 2,0). IHC a été considérée comme la principale méthode parce IHC positif ou négatif hebdomadaire (1+) patients n'a pas bénéficié de trastuzumab dans le procès ToGA, bien qu'ils aient été ISH positive. Dans la littérature, cependant, il existe des variations considérables dans la positivité immunohistochimique déterminée. Ici, le pourcentage des adénocarcinomes gastriques avancés HER2 positives varie d'une étude à, de 5% à 30% [9], très probablement due à des protocoles d'analyse différents et des critères d'interprétation.
Sous-études prospectives de deux des adjuvants essais randomisés de trastuzumab contre zéro dans le cancer du sein a démontré que près de 20% des tests HER2 effectués dans les établissements sur place (au département de pathologie du primaire site de traitement) étaient incorrects lorsque le même échantillon a été réévalué dans un volume élevé, laboratoire central [10, 11 ].
Contrairement au cancer du sein, le cancer de l'estomac histopathologie en termes de HER2 est considérée comme une surexpression plus hétérogène et focale de l'amplification génique est fréquemment observée [12]. Par conséquent, des difficultés dans la détermination du statut HER2 sont censés être plus prononcé que dans le cancer du sein. Dans l'ensemble, ces résultats pris en compte, des méthodes reproductibles et de temps en épargnant plus fiables pour évaluer le statut HER2 dans le cancer gastrique sont nécessaires. Seulement quelques études publiées combinant IHC et méthodes in situ d'hybridation (mais pas SISH) sur une diapositive ont été menées [13-16]. études Thèses utilisées norme IHC et chromogènes ou hybridation fluorescente in situ (CISH ou FISH) que des méthodes simples et les a comparés avec une analyse simultanée (combinée sur une lame) et trouvé une bonne concordance avec les résultats de la coloration unique. Au meilleur de notre connaissance, cependant, il n'y a pas d'études qui comparent directement les résultats des deux immunohistochimie (IHC) et l'argent hybridation in situ (SISH) lorsque chacun est utilisé séparément avec les résultats de leur utilisation en combinaison sur une seule section de l'estomac carcinomes.
dans la présente étude, la HER2 expression de la protéine et l'amplification du gène état de 100 adénocarcinomes et les carcinomes de la jonction gastro-oesophagienne gastriques ont été examinés par IHC conventionnelle et méthodes simples ISH (IHC /SISH) et en parallèle par le nouveau procédé combinant les deux méthodes (gène /protéine). Le but de cette étude était d'évaluer l'équivalence de la nouvelle plate-forme gène de protéine par rapport aux méthodes de coloration unique.
Méthodes
Patients et fixés au formol paraffine (FFPE) tumorales des échantillons de tissus échantillons à partir de 100 patients atteints d'un adénocarcinome gastrique ou gastroesophageal jonction ont été sélectionnés à partir d'une archive de tissus d'échantillons à l'Institut de pathologie à Krankenhaus Nordwest. Le projet a été réalisé avec l'autorisation du comité d'éthique responsable. Pour chaque cas, quatre méthodes de coloration différentes ont été utilisées selon des directives du fabricant des procédures approuvées par la FDA: hématoxyline et l'éosine (H & E) pour évaluer l'échantillon adéquat et de confirmer le sous-type histologique, l'immunohistochimie (IHC) afin d'évaluer la protéine HER2 expression, argent hybridation in situ (SISH) pour évaluer l'amplification génique et la plate-forme nouveau gène-protéine qui combine IHC et SISH sur une diapositive.
immunohistochimie
IHC a été réalisée avec le PATHWAY anticorps monoclonal de lapin Ventana approuvé par la FDA 4B5 clone et avec le kit ULTRAVIEW DAB Detection (Ventana) sur un Stainer XT BenchMark automatisé (Ventana, Tucson, AZ). En bref, les coupes tissulaires ont été déparaffinées avec EZ préparation à 75 ° C et 76 ° C, la chaleur prétraités dans la cellule de conditionnement 1 (CC1) pour la récupération de l'antigène à 76 ° C - 100 ° C, puis incubées avec l'anticorps primaire anti-HER2 pour 16 min à 37 ° C, après inactivation de la peroxydase endogène en utilisant un inhibiteur UV pendant 4 min à 37 ° C. Les lames ont été mises en incubation avec un anticorps secondaire suivie par l'application universelle de la HRP multimère pendant 8 min. Des anticorps ont été détectés en utilisant chromogène (38 min). Avant le montage, les diapositives ont été contre l'hématoxyline II pendant 4 min et bleuissement réactif pendant 4 min. Pour soutenir la validité de la coloration et identifier les artefacts expérimentaux, un contrôle positif a été inclus dans chaque série.
Argent double SISH couleur de hybridation in situ en a été réalisée selon la INFORMER HER2 double ISH DNAProbe cocktail et Kit ULTRAVIEW SISH DNP Détection /Kit ULTRAVIEW RED ISH DIG détection pour HER2 et Chr 17 quantification et de la procédure (Ventana /Roche). Les deux sondes ont été marquées avec du 2,4-dinitrophénol (DNP) et la digoxigénine (DIG). Les lames de tissu ont été déparaffinées avec EZ Prep à 65 ° C-76 ° C et la chaleur prétraités avec EZ Prep diluée cellulaire Conditioner 2 (CC2) à 90 ° C suivie par une protéase digestion avec ISH Protease 3 pendant 16 min à 37 ° C. Les coupes de tissus d'ADN génomique et les sondes HER2 et Chr 17 nick traduites ont été co-dénaturé par traitement thermique pendant 20 min à 80 ° C suivie d'une étape d'hybridation pendant 6 h à 44 ° C. Les signaux de HER2 ont été détectés en utilisant un anticorps de lapin anti-DNP pendant 20 min à 37 ° C et incubées avec un anticorps anti-lapin de chèvre conjugué à la HRP pendant 16 min à 37 ° C après trois lavages de stringence 8 min. Le signal a été détecté en tant que dépôts d'argent avec de l'acétate d'argent, l'hydroquinone et le peroxyde d'hydrogène. Chr 17 détection, les lames ont été incubées avec des anticorps de souris anti-DIG pendant 20 min à 37 ° C et avec un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à AP pendant 24 min à 37 ° C. Le signal Chr 17 a été développé comme rouge coloration de point avec rapide phosphate rouge et naphtol. Les lames ont été finalement de contraste avec hématoxyline II et bleuissement réactif avant le montage.
Gene /protéine
Gene plateforme /protéine combinant IHC et SISH sur une diapositive. Pour soutenir la validité de la coloration et identifier les artefacts expérimentaux, un contrôle positif a été inclus dans chaque coloration de la protéine HER2 run.For et HER2 /Chr 17 hybridation, le kit iVIEW DAB Détection et ULTRAVIEW kits de détection ont été utilisés. Les échantillons ont été colorés dans plusieurs des conditions d'essai pour mettre en oeuvre un protocole optimal nécessaire pour obtenir des résultats IHC /SISH de coloration comparables à celles des essais IHC et SISH individuel. L'optimisation a été réalisée dans le laboratoire de Ventana (Roche) et en partie dans son propre travail. Des résultats optimaux ont été obtenus en effectuant la procédure IHC avant la procédure de SISH.
échantillons ont été déparaffinées avec EZ Prep à 72 ° C en 6 cycles. Pour la protéine HER2 la coloration, les coupes de tissu ont été chaleur prétraitées CC1 pour la récupération d'antigène à 95 ° C, puis incubées avec l'anticorps primaire anti-HER2 à 37 ° C pendant 48 min après l'inactivation de la peroxydase endogène en utilisant les UV-inhibiteur pendant 4 min; à 37 ° C. Les lames ont été mises en incubation avec un anticorps secondaire biotinylé, suivi par l'application de la streptavidine conjuguée à HRP pendant 8 min. Une réaction DAB en cuivre renforcé a été utilisée pour visualiser la protéine. Pour le gène HER2 et CHR 17 coloration, des échantillons ont été prétraités avec chaleur CC2 EZ Prep diluée à 90 ° C pendant quatre cycles suivis par digestion avec la protéase ISH Protease 2 pendant 12 min à 37 ° C. Les sondes ont été dénaturés pendant 4 min à 80 ° C et hybridés pendant 6 heures à 44 ° C en utilisant un cocktail de sondes DNP- et marqué au DIG. On a ajouté une solution HybClear pour bloquer l'interaction entre le DNP et le dépôt DAB pendant l'hybridation. Les signaux de gènes ont été détectés en utilisant un anticorps de lapin anti-DNP pendant 16 min à 37 ° C et incubées avec un anticorps anti-lapin de chèvre conjugué à la HRP pendant 16 min à 37 ° C après quatre lavages de stringence 8 min. Le signal a été développé par le dépôt d'argent avec de l'acétate d'argent, l'hydroquinone et le peroxyde d'hydrogène. Chr 17 détection, les lames ont été incubées avec des anticorps de souris anti-DIG pendant 16 min à 37 ° C et avec un anticorps anti-souris de chèvre conjugué à AP pendant 24 min à 37 ° C. Le signal Chr 17 a été développé comme rouge coloration de point avec rapide phosphate rouge et naphtol. Avant le montage, les diapositives ont été contre l'hématoxyline II pendant 8 min et bleuissement réactif pendant 4 min. Avis
Pathologie
Les échantillons ont été interprétés de façon indépendante par un pathologiste (AB) et un biologiste de formation en histologie de cancer gastrique (DW). Les observateurs ont reçu les échantillons au hasard, à savoir SISH IHC et un procédé combiné n'a pas été évalué en association les uns avec les autres, mais séparément pour chaque patient. Consensus des deux examinateurs a été trouvé après chaque évaluation. Parce que les résultats discordants entre les deux méthodes peuvent être le résultat de variabilité intra-observateur plutôt que des différences dans la qualité de coloration, les cas discordants ont été réévaluées par un troisième observateur qui ne connaissait pas les résultats de la première évaluation, mais évalué les cas discordants (méthodes) en association les uns avec les autres. Enfin, un consensus a été établi entre le troisième observateur et les principaux observateurs.
Les résultats IHC ont été interprétés en utilisant le système de notation proposé pour le cancer gastrique par Hofmann et al. [17] et Rüschoff et al. [18]: 0, aucune réactivité ou la réactivité membraneuse dans < 10% des cellules tumorales; 1+, faible réactivité membraneuse /à peine perceptible dans > 10% des cellules tumorales; 2+, faible à modéré complet, latéral ou basolatérale réactivité membraneuse > 10% des cellules tumorales; et 3+, une forte réactivité complète, latérale ou basolatérale membraneuse ≥ 10% des cellules tumorales.
Dans les résultats Sish, le nombre total de HER2 et le chromosome 17 signaux ont été comptés dans au moins 20 noyaux de cellules tumorales dans deux zones différentes. Les HER2 /Chr 17 rapports ont été interprétés conformément au FISH système de notation ToGA pour le test HER2 dans la jonction gastrique et gastro- (GEJ) cancer de la manière suivante: < 2.0 gène HER2 non amplifié; ≥ 2.0, le gène HER2 amplifié [17]. Un nombre moyen de six ou plus a été considéré comme amplifié. Analyse
statistique
L'analyse était explorative sans hypothèse ou exemples de calcul prédéfinies de taille. Le nombre de 100 patients a été jugé suffisant pour effectuer les tests statistiques proposés. Les corrélations entre IHC /SISH et le gène /protéine ont été estimées en utilisant le coefficient de kappa Cohen's (de к). La valeur kappa interprétation par Altmann [19] a été utilisé: к > 0,81, très bon accord; 0,61-0,80, bon accord; 0,41 à 0,60 accord modéré; 0,40 à 0,21, un accord équitable; ≪ 0.20, légère accord. Les résultats des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du logiciel Winstat (R.Fitch Software, version 2009.1).
caractéristiques des patients
Quatre-vingt six des 100 cas de patients étaient évaluables. Un cas a été exclu en raison de l'absence de cellules tumorales et trois cas pour les signaux pauvres dans la coloration de SISH unique.
La majorité des patients étaient des hommes (67,7%) et ≥ 65 ans (70,8%) (tableau 1). La cohorte se compose de patients atteints d'un adénocarcinome du milieu à l'estomac distal (50,0%) ou GEJ (45,8%) avec plus de cas de Lauren`s intestinale (67,7%) que les tumeurs diffuses (28,1%). Le classement de la majorité des échantillons était G3 (50,0%), suivie par G2 (39,6%) et les tumeurs classées comme G2-3 (10,4%). 85,7% des patients réséqués (n = 28) a montré métastase ganglionnaire (stade N) et 64,3% ont montré sans métastases à distance (stade M). Dans la moitié des patients réséqués, stade T3 de la tumeur a été observée, suivie de T2 à 28,6%, T1 à 14,3% et le stade de T4 à 7,1% de patients.Table 1 Patient's caractéristiques et positivité HER2 par sous-groupes

total n = 96 (%)
Positivity * (IHC 3+ ou SISH +) unique n (%)
Positivity * (IHC 3+ ou SISH +) combi n (%)
Sex
Femme
27 (28,1)
2 (7.4)
1 (3,7)
Homme
65 (67,7)
11 (16,9)
11 (16,9)
Inconnu
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
Âge
18-94 ans (médiane 69)
≥ 65
68 (70,8)
12 (17,6)
11 (16.2)
< 65
28 (29,2)
4 (14,3)
4 (14,3)
localisation de la tumeur primaire
Mid à l'estomac distal
48 (50,0)
5 (10.4)
4 (8.3)
GEJ
44 (45,8)
8 (18.2)
8 (18.2)
Non spécifié
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
classification Lauren
dIFFUSE
27 (28,1)
3 (11.1)
2 (7.4)
mixte
4 (4.2)
1 (25,0)
1 (25,0)
Intestinal
65 (67,7)
12 (18,5)
12 (18,5)
biopsie /résection
biopsie
68 (70,8)
10 (14,7)
9 (13,2)
28 (29,2)
6 (21,4)
6 (21,4)
T étape de résection (n = 28)
T 1
4 (14,3)
0
0
T 2
8 (28,6)
2 (25,0)
2 (25,0)
T 3
14 (50,0)
4 (28,6)
4 (28,6)
T 4
2 (7.1)
0
0
étape de N (n = 28)
N +
24 (85,7)
5 (20,8)
5 (28,8)
N -
4 (14,3)
1 (25,0)
1 (25,0) M
étape (n = 28)
M +
5 (17,9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M -
18 (64,3)
3 (16,7)
3 (16,7)
Mx
5 (17,9)
2 (40.0)
2 (40.0)
classement
G2
38 (39,6)
6 (15,8)
6 (15,8)
G2-3
10 (10,4)
2 (20,0)
2 (20.0)
G3
48 (50,0)
8 (16,7)
7 (14,6)
abréviations
: IHC
immunohistochimie, SISH
argent hybridation in situ T
tumeur primaire, les ganglions lymphatiques de N, M de les métastases * définis comme IHC 3+ ou SISH ≥2.0.
P
= 1 pour toutes les comparaisons entre IHC /SISH et méthodes gène /protéine (Fisher de test exact).
Dans le tableau 1 la positivité HER2 par des sous-groupes est également présenté. Aucune différence significative n'a été notée dans la positivité HER2 par rapport aux sous-groupes et des méthodes différentes.
Les résultats de la coloration pour HER2 expression de protéines et d'amplification génique (méthodes de coloration individuelles)
scores d'expression de la protéine par IHC ont 0 et 1 + à 70,8% et 10,4% des patients (tableau 2). 2,9% de la note 0 et 10,0% de la note 1 + cas ont été amplifiés. Dans 9,4% des cas, une expression modérée (score 2 +) avec 44,4% des cas amplifiés a été détectée. 9,4% des échantillons colorés a montré une expression forte (score 3 +) avec 77,8% des cas amplifiés. La figure 1 montre des résultats représentatifs de staining.Table 2 résultats de coloration unique pour HER2 expression de la protéine et l'amplification du gène
méthode simple
méthode combinée
Score IHC
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2.0
IHC (n = 96)
SISH ≥ 2.0
n (%)

n (%)
n (%)
n (%)
0
68 (70,8)
2 (2.9)
68 (70,8)
2 (2.9)
1+
10 (10,4)
1 (10.0)
11 (11.5)
1 (9.1)
2+
9 (9.4)
4 (44,4)
7 (7.3)
2 (28,6)
3+
9 (9.4)
7 (77,8)
10 (10,4)
9 (90,9)
abréviations
: IHC
immunohistochimie, SISH
argent hybridation in situ
Figure 1 résultats représentatifs des différentes méthodes de coloration.. Intestinal tumeur (hématoxyline et éosine (H & E), A.1, 20x) avec IHC 3+ (immunohistochimie (IHC), A.2, 20x; gène /protéine, A.4, 20x) et l'amplification (argent in situ hybridation (SISH), A.3, 40x; gène /protéine, A.4, 20x). IHC marquer 0 (IHC, B.2, 20x; gène /protéine, B.4, 40x), type intestinal (H & E, B.1, 20x) et amplification (SISH, B.3, 40x; gène /protéine , B.4, 40x).
Gene /protéines (méthode de coloration combinée)
expression des protéines par la méthode des scores gène /protéine était 0, 1+, 2+, 3+ et à 70,8%, 11,5%, 7,3 % et 10,4% (tableau 2). Il y avait 2,9% /9,1% amplifié cas dans des échantillons avec score 0 /1+. 28,6% des cas amplifiés ont montré une coloration modérée (score 2+). Les échantillons ayant une forte expression (3+) ont montré dans 90,9% amplification génique. Des exemples de gène /protéine coloration sont démontrées dans la Figure 1.
Évaluation des cas concordant et discordant
L'évaluation de la coloration IHC dans le seul classique et la méthode gène /protéine n'a pas toujours révéler des résultats congruents; les accords des deux méthodes ont également été répertoriés dans le tableau 3 Il y avait de très bonnes concordances dans les résultats des cas amplifiés (accord 100,0%; Kappa-coefficient κ = 1), ainsi que score à 0 (100%; κ = 1), le score 1+ ( 98,96%; κ = 0,947) et marquer des échantillons de tumeur 3+ (96,88%; κ = 0,825) dans les deux méthodes. Cas avec score 2+ ont montré moins de concordance, bien que toujours bon (95,83%; κ = 0,728). Concordance entre la positivité globale de HER2 (défini comme IHC 3+ ou SISH +) dans la méthode standard ou roman était très bon (98,69%; κ = 0,963; 17,7% contre 16,7%) Tableau 3 Concordances entre les méthodes simples et gène /protéine combinée. méthodes
combinaison vs. simple
Concordance
Kappa-Coefficient к
Accord Altmann [[15]]
SISH amplifié
100 % 1
Très bon
IHC score de 0
100% 1
Très bon
Le score IHC 1+
98,96%
0,947
Très bonne
Le score IHC 2+
95,83%
0,728
Good
Le score IHC 3+
96,88%
0,825
Très bon
abréviations
: IHC
immunohistochimie, SISH
argent hybridation in situ.
Il y avait douze cas discordants avant de re-analyse par un troisième observateur (données non présentées). Après réévaluation par un troisième observateur, les résultats discordants sont restés dans quatre échantillons de tumeurs. La raison pour laquelle les huit cas discordants dans l'analyse intermédiaire a été jugée variabilité intra-observateur. Résultats des résultats discordants finaux sont présentés dans le tableau 4.Table 4 évaluation détaillée des résultats discordants entre les méthodes
méthodes simples
méthode
Case
Combiné histologie (Lauren)
IHC (Partition)
SISH (≥ 2,0 /< 2.0)
IHC (Partition)
SISH (≥ 2.0 /< 2.0)
6693
i
2+
≥2.0
3+
≥2.0
9924
i
2+
< 2.0
1+
< 2.0
20209
i
2+
≥2.0
3+
≥2.0
1057
d
3+
< 2.0
2+
< 2.0
abréviations
:. IHC
immunohistochimie, SISH
argent hybridation in situ
Discussion
le but de cette étude était d'évaluer la faisabilité de la nouvelle plate-forme gène /protéine en comparaison avec les méthodes de coloration unique dans les adénocarcinomes et les carcinomes de la jonction gastro-oesophagienne.
des échantillons évaluables gastriques 28,1% a montré une diffuse, 4.2 % a mélangé et 67,7% d'un type histologique intestinal. La majorité des patients étaient âgés de 65 ans (70,8%) et les hommes (67,7%). Le taux d'adénocarcinome de GEJ ou au milieu de l'estomac distal était similaire (45,8% contre 50,0%). Dans la méthode standard, 17,7% des patients étaient HER2 positive. La majorité des tumeurs HER2-positives étaient de l'histologie intestinale et ont été localisés dans la jonction GE, cette corrélation avec les données de la littérature [20, 21]. Dans l'ensemble, en fonction des caractéristiques du patient et de la tumeur ainsi que la positivité de HER2, le groupe évalué est un collectif représentatif.
Bien que l'expérience considérable pour l'analyse de HER2 par IHC et ISH pour le cancer du sein est disponible, il est pas certain si elles peuvent être directement transféré aux carcinomes du tractus gastro-intestinal. L'expression de la protéine HER2, à la différence dans le carcinome du sein, est hétérogène et souvent focalement prononcé. Fox et al. [12]. déterminé le statut HER2 dans 100 échantillons de tissus diagnostiqués avec un cancer avancé de l'estomac ou le cancer de la jonction gastro-oesophagienne dans différents laboratoires pour tester leurs matches. Pour cela, IHC et CISH (chromogène hybridation in situ) ou SISH ont été appliquées. Il y avait un bon accord entre les différents laboratoires concernant CISH ou SISH, mais la concordance modérée pour tous les scores IHC a été observée. Sur la base des résultats de l'enquête, l'avis de l'auteur est que la détermination du statut HER2 basé sur IHC, suivie par ISH (norme européenne) ne constitue pas une stratégie d'évaluation optimale et a recommandé d'effectuer les deux méthodes de coloration [12]. Une autre étude [22] a testé l'amplification de HER2 et d'expression chez 148 patients atteints d'un carcinome gastrique avancé par IHC et FISH /SISH. cas HER2 positifs ont été détectés dans 10% des IHC contre 18% à 22% dans l'hybridation in situ. Non seulement parce qu'il était plus facile à reproduire, l'auteur a proposé la dans la technique d'hybridation in situ comme meilleure approche pour déterminer la positivité HER2 [22]. Cependant, d'après le procès de TOGA [8], les patients atteints de ISH positif, mais IHC négative ou hebdomadaire (1+) tumeurs positives ne bénéficient pas de trastuzumab. Par conséquent, l'utilisation de FISH ou SISH comme méthode primaire et n'est pas recommandé en Europe et IHC est toujours considérée comme la méthode d'évaluation primaire dans de nombreux pays.
Au meilleur de notre connaissance, cependant, il n'y a pas d'études qui comparer directement les résultats des deux immunohistochimie (IHC) et l'argent hybridation in situ (SISH) lorsque chacun est utilisé séparément avec les résultats de leur utilisation en combinaison sur une seule section dans les cancers gastriques. Pour visualiser des cibles d'ARN et d'ADN in situ, il existe différentes façons de sondes de marquage par fluorescence, la détection chromogène ou d'argent. Toutes les études précédentes avec des paramètres comparables à notre analyse utilisés chromogène ou hybridation fluorescente in situ (CISH ou FISH). Downs-Kelly et al. [14] combiné norme IHC avec un dépôt d'argent métallique par EnzMetTM sur un microréseau tissulaire (TMA) des cancers du sein et ont comparé les résultats de l'IHC et l'hybridation fluorescente in situ (FISH) lorsqu'il est effectué seul. Dans une autre étude, les auteurs ont en effet utilisé la combinaison de IHC et d'argent hybridation in situ (SISH) de TMA du sein et des échantillons de cancer gastrique dans mais par rapport aux résultats de ceux obtenus par IHC et hybridation fluorescente in situ (FISH) que la coloration unique [16]. Reisenbichler et al. [15] ont rapporté les résultats de la comparaison des IHC et hybridation in situ chromogène (CISH) comme des colorations simples avec le double test IHC /CISH dans. L'évaluation simultanée de protéines et de gènes combinaisons sur une seule lame offert une méthode hautement reproductible et très robuste avec de bonnes concordances.
Pour tester la validité de la nouvelle coloration gène /protéine par rapport à l'IHC standardisée et SISH, les concordances ont été calculées sur la base du coefficient kappa. Selon les lignes directrices de l'ASCO /CAP pour le cancer du sein, un nouveau test devrait montrer plus de 95% de concordance avec un essai de référence validé [23]. Dans notre étude, la nouvelle méthode a montré concordances plus de 95% en termes de tous les résultats des tests. Il y avait de très bonnes concordances dans les résultats de l'amplification du gène ainsi que score à 0 (chacun avec l'accord 100%), le score 1+ (accord 98,96%) et des échantillons de score 3+ tumorales (accord de 96,88%). Cas avec score 2+ ont montré des résultats moins concordants, bien que toujours bon (accord de 95,83%). Difficultés dans les cas avec une expression modérée dans l'évaluation et le classement sont connus dans la littérature. Tafe et al. [24]. ont montré qu'il y avait des difficultés dans l'attribution d'un score final dans l'évaluation de l'IHC en raison du manque dans la séparation fiable des cas avec un score de HER2 de 1 + ou 2 +. Ces catégories peuvent être limitées par la subjectivité et une mauvaise reproductibilité. Le phénomène que les résultats discordants sont observés chez les patients présentant une faible expression de HER2, qui parfois ont encore amplification du gène HER2, a été rapporté dans le cancer de l'œsophage [24-26]. La raison la plus probable pour cette discordance est l'hétérogénéité intra-tumorale du statut HER2 dans le cancer gastrique ou GEJ [17, 27, 28]. Dans notre étude, les résultats discordants IHC ont été observés chez quatre patients, mais ceux-ci ont conduit à une différence cliniquement significative de la positivité HER2 chez un patient seulement (patient n ° 1057). Le patient avait un cancer gastrique de type diffus. L'évaluation des tumeurs diffuses semble être plus difficile que les tumeurs de type intestinal [29, 30]. Selon la Rüschoff et al. [18]. seulement 5% de ces tumeurs montrent positivité HER2; chevalières carcinomes anneau sont négatifs. Amplification de HER2 est extrêmement rare dans le carcinome gastrique diffus qui est associé à une expression anormale E-cadhérine [13, 31-33].
Le SISH est une méthode relativement nouvelle pour la détection de l'amplification du gène HER2. De nombreuses études ont confirmé une forte concordance avec d'autres méthodes d'hybridation in situ comme CISH et FISH [34]. Par rapport à l'IHC, ISH montre une plus grande sensibilité et une spécificité et une reproductibilité élevée. Cette déclaration peut être confirmée par la comparaison de la concordance des cas amplifiés dans nos méthodes. Les résultats ont révélé un très bon accord entre les deux méthodes (100,0%; к = 1). En outre, l'ISH est moins sensible que IHC en raison d'une relative stabilité de l'ADN par rapport à des différences dans la fixation et le traitement des tissus.
Nous travaillons actuellement sur une étude élargie évaluer si cette nouvelle méthode est associée à une réduction des inter-observateur la variabilité de la détermination du statut HER2 dans le cancer gastrique. Cette étude comprend également un composant regardant le temps nécessaire pour rendre compte des résultats finaux. Les résultats seront soumis à la revue comme lettre ou un rapport original, dès qu'ils sont disponibles.
Conclusions
Dans cette étude, nous avons clairement montré que l'utilisation de la méthode combinée pour effectuer HER2 expression de la protéine et l'amplification génique sur une seule lame peut produire des résultats similaires à ceux qui utilisent chaque méthode individuellement dans une étude contrôlée mise en œuvre de trois observateurs indépendants. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

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