Проверка нового метода, сочетающего как HER2 иммуногистохимии и HER2 двухцветными серебра гибридизация на одном слайде для рака желудка testing

валидации нового метода, сочетающего как HER2 иммуногистохимии и HER2 двухцветными серебра Ситу
гибридизации в на одном слайд для желудка тестирования рака
Аннотация
Справочная информация
оценки состояния HER2 является необходимым условием для создания соответствующей стратегии лечения при раке желудка. Рака желудка очень разнородны и отдельные оценки амплификации генов и экспрессии белка приводят к неопределенности в локализации различных клонов и отнимает много времени. Это исследование оценивает эквивалентность нового метода Объединяя оба гена и белка платформ на одном слайде.
Методы
иммуногистохимии (IHC) и HER2 двухцветными серебра гибридизация (SISH) в качестве отдельных методов в (IHC /SISH) и ген-белок платформы сочетания обоих методов на одном слайде (ген /белок) проводили в случайном порядке собранных 100 случаев аденокарциномы желудка. Результаты IHC /SISH сравнивали с окрашиванием гена /белка.
Результаты
96 из 100 образцов были обложению. В окрашивания ген /белок, патологи были в состоянии оценить амплификацию гена и последующей экспрессии белка на уровне одной клетки. В сравнительных испытаниях, амплификации гена наблюдалась в 14,6% обоими, обычным SISH и Gene /платформы белка (соглашения 100%; каппа-коэффициент К = 1,0). Экспрессия белка счеты IHC были 70,8% (0), 10,4% (1+), 9,4% (2+), и 9,4% (3+). Экспрессию белка с помощью метода генной /белка были: 70,8% (0), 11,5% (1+), 7,3% (2+) и 10,4% (3+) больных. Были полные конкордансы в оценке IHC случаев со счетом 0 (100,0%; К = 1). Высокие конкордансы показаны в счет 1+ (98,96%; κ = 0,947) и 3 + (96,88%; К = 0,825) случаях и хорошее конкордансы в 2+ случаях (95,83%; κ = 0,728).
Выводы <бр> Этот роман в сочетании платформа имеет преимущество быть в состоянии оценить как ген и статус белка в той же клетке рака и может представлять особый интерес для исследования и ухода пациента.
статьи категории
Болезни Biomarker.
Ключевые слова
рак желудка HER2 иммуногистохимии Silver гибридизация ген-белок анализа фон
The HER2 онкоген в (также упоминается как HER2 /Neu или ErbB-2) на хромосоме 17q21, кодирует трансмембранный рецептор тирозин-киназы рецептора 185 кД, что принадлежит к семейству рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), состоящий из EGFR /HER1, HER2, HER3 и HER4. активация HER2 играет центральную роль в клеточной пролиферации и выживания, во многом опосредуется через пути RAS-МАРК. Он также ингибирует клеточную гибель через фосфатидилинозитол-3'-киназы-AKT-млекопитающим мишень рапамицина (МРМ) пути. Гиперэкспрессией HER2 было сообщено в различных солидных опухолей [1-7]. Генные усилений редко встречаются в других заболеваний и анти-HER2 терапии в настоящее время проверяются только при раке молочной железы и рака желудка.
Основываясь на результатах ToGA суда [8], трастузумаб был одобрен для метастатической аденокарциномы желудка и желудочно-пищеводного соединения в комбинированная терапия в США и Европе. Требование является доказательством гиперэкспрессией HER2. В Европе это определяется с помощью IHC 3+ результата или IHC 2+ и положительной FISH или результат SISH (соотношение ≥ 2,0). IHC считался основным методом, поскольку IHC отрицательный или еженедельно положительный (1+) пациенты не получают выгоды от трастузумаба в суде ToGA, хотя они были ISH положительными. В литературе, однако, существуют значительные различия в иммуногистохимическое позитивности определяется. При этом, доля HER2 положительных передовых желудка аденокарциномы варьируется от исследования к исследованию, от 5% до 30% [9], скорее всего, из-за различных протоколов анализа и критериев интерпретации.
Перспективные substudies из двух адъювантных рандомизированных испытаний трастузумаб по сравнению с нулевым при раке молочной железы показали, что примерно 20% анализов HER2, проведенных в местных учреждениях (в отделе патологии сайта первичного лечения в) были неправильными, когда тот же образец был повторно оценен в большом объеме, центральная лаборатория [10, 11 ].
в отличие от рака молочной железы, гистопатологии рака желудка с точки зрения HER2 считается более гетерогенным и фокусного сверхэкспрессия амплификации генов часто наблюдается [12]. Таким образом, трудности в определении статуса HER2, как ожидается, будет более выраженным, чем при раке молочной железы. В целом, эти результаты приняты во внимание, необходимы более надежные, воспроизводимые и время щадящие методы оценки состояния HER2 при раке желудка. Лишь немногие опубликованные исследования, сочетающие IHC и в точке методов гибридизации (но не SISH) на одном слайде были проведены [13-16]. Тезисы исследования использованы стандарт IHC и хромогенных или флуоресцентных гибридизация (CISH или FISH) в качестве отдельных методов в и сравнили их с одновременным анализом (в сочетании на одном слайде) и найдено хорошее согласование с результатами одного окрашивания. Насколько нам известно, однако, нет никаких исследований, которые непосредственно сравнивать результаты обоих иммуногистохимии (IHC) и серебра гибридизация (SISH) в когда каждый используется отдельно с результатами их использования в сочетании на одном участке в желудочном карцином.
в настоящем исследовании, экспрессия белка и амплификации гена HER2 статус 100 желудочных аденокарцином и карцином пищеводно перехода были исследованы с помощью обычных IHC и ISH отдельных методов (IHC /SISH) и параллельно новым способом комбинирования оба метода (ген /белок). Цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить эквивалентность новой платформы гена белка по сравнению с одиночными методами окрашивания.
Методы
Пациенты и образцы тканей
формалином фиксированных парафином (FFPE) образцов опухолей из 100 пациентов с желудочной или желудочно-пищеводного соединения аденокарциномы были отобраны из архива ткани образцов в Институте патологии в Krankenhaus Нордвест. Проект был выполнен с разрешения ответственного этического комитета. Для каждого случая, четыре различных метода окрашивания были использованы в соответствии с постав FDA утвержденных процедур: гематоксилином и эозином (H &Amp; E) для оценки адекватности выборки и подтвердить гистологический подтип, иммуногистохимии (IHC) для оценки белок HER2 выражение, серебро гибридизация (SISH), чтобы оценить усиление гена и новой платформы ген-белок, который сочетает в себе IHC и SISH на одном слайде.
Immunohistochemistry
IHC проводили с FDA утвержденных Ventana PATHWAY кролика моноклональное антитело 4B5 клон и с Ultraview DAB Detection Kit (Ventana) на BenchMark XT автоматизированном ситечко (Вентана, Tucson, AZ). Вкратце, срезы ткани были депарафинировали с EZ Prep при 75 ° C и 76 ° C, тепло предварительно обрабатывают в соте Conditioning 1 (СС1) для извлечения антигена при 76 ° С - 100 ° С, а затем инкубировали с первичным антителом против HER2 для 16 мин при 37 ° с, после инактивации эндогенной пероксидазы с использованием УФ-ингибитора в течение 4 мин при 37 ° с. Срезы инкубировали с вторичным антителом, с последующим применением ПХ Универсальной мультимеру в течение 8 мин. Антитела были обнаружены с помощью хромогена (в течение 38 мин). Перед монтажом, слайды были контрастно гематоксилином II в течение 4 мин и подсинивания реагента в течение 4 мин. Для того, чтобы поддержать справедливость окрашивания и определить экспериментальные артефакты, положительный контроль был включен в каждом цикле.
Silver гибридизация
двухцветным SISH в была выполнена в соответствии с INFORM HER2 Dual ISH DNAProbe коктейлем и Ultraview SISH обнаружения DNP Kit /Ultraview RED ISH DIG Detection Kit для HER2 и Chr 17 количественному и процедуры (Вентана /Roche). Оба зонда были мечены с 2,4-динитрофенол (DNP) и дигоксигенином (DIG). Слайды ткани были депарафинировали с EZ Prep при 65 ° C-76 ° C и тепловой предварительной обработке с EZ Преп-разбавленного Cell Conditioner 2 (СС2) при 90 ° С с последующим протеаз расщеплением ISH-протеиназы 3 в течение 16 мин при 37 ° С. Геномные ДНК срезы ткани и нарицательные переводные HER2 и Chr 17 Зонды были совместно денатурированный при тепловой обработке в течение 20 мин при 80 ° С с последующей стадией гибридизации в течение 6 ч при 44 ° С. Эти сигналы HER2 были обнаружены с помощью кроличьей анти-DNP антитела в течение 20 мин при 37 ° С и инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена козьими антителами против кроличьих антител в течение 16 мин при температуре 37 ° С, после трех стирок жесткости 8 мин. Сигнал был обнаружен в качестве месторождений серебра с ацетатом серебра, гидрохинон и перекись водорода. Для Chr 17 обнаружения, предметные стекла инкубировали с мышиным анти-DIG антител в течение 20 мин при 37 ° С и с AP-конъюгированные козьим антителом против мышиного С в течение 24 мин при 37 ° С. Chr 17 Сигнал был разработан как красная точка окрашивания с быстрым красным и нафтола фосфата. Слайды были, наконец, контрастно гематоксилином II и подсинивания реагента перед монтажом.
Gene /белок
Gene платформа /белок сочетающую IHC и SISH на одном слайде. Для того, чтобы поддержать справедливость окрашивания и идентифицировать экспериментальные артефакты, положительный контроль был включен в каждый белок окрашивания run.For HER2 и HER2 /Chr 17 гибридизации были использованы комплект Iview обнаружения ДАБ и обнаружения UltraView комплекты. Образцы окрашивались при нескольких условиях анализа для реализации оптимального протокола, необходимого для достижения результатов IHC /SISH окрашивания, сравнимые с индивидуальной IHC и SISH тестирования. Оптимизация была выполнена в лаборатории Вентана (Roche) и частично в собственной работе. Оптимальные результаты были достигнуты при выполнении процедуры IHC перед процедурой SISH.
Образцы депарафинировали с EZ Prep при 72 ° С в течение 6 циклов. Для получения белка окрашивания HER2, срезы тканей были подвергнуты тепловой предварительной обработке в СС1 для извлечения антигена при 95 ° С, а затем инкубировали с первичным антителом против HER2 при 37 ° С в течение 48 мин после того, как инактивацией эндогенной пероксидазы с использованием УФ-ингибитора в течение 4 мин при 37 ° С. Срезы инкубировали с биотинилированным вторичным антителом, с последующим применением ПХ-конъюгированным стрептавидином в течение 8 мин. Медную усиливается реакция ДАБ использовали для визуализации белка. Для гена HER2 и CHR 17 окрашивания, образцы подвергали тепловой предварительной обработке с EZ Преп-разбавленного СС2 при температуре 90 ° С в течение четырех циклов с последующим расщеплением протеазы ISH-протеиназы 2 в течение 12 мин при 37 ° С. Зонды денатурировали в течение 4 мин при 80 ° С и гибридизуют в течение 6 ч при 44 ° С, используя коктейль из DNP- и DIG-меченных зондов. Раствор HybClear был добавлен, чтобы блокировать взаимодействие между ДНП и месторождения ЦАВ при гибридизации. Сигналы генов были обнаружены с помощью кроличьей анти-DNP антитела в течение 16 мин при 37 ° С и инкубировали с конъюгированным с пероксидазой хрена козьими антителами против кроличьих антител в течение 16 мин при 37 ° С после четырех 8 мин строгостью стирок. Сигнал был разработан на месторождении серебра ацетатом серебра, гидрохинон и перекись водорода. Для Chr 17 обнаружения, предметные стекла инкубировали с мышиным анти-DIG антитела в течение 16 мин при 37 ° С и с AP-конъюгированные козьим антителом против мышиного С в течение 24 мин при 37 ° С. Chr 17 Сигнал был разработан как красная точка окрашивания с быстрым красным и нафтола фосфата. Перед монтажом, слайды были контрастно гематоксилином II в течение 8 мин и подсинивания реагента в течение 4 мин. Обзор
Патология
Образцы независимо друг от друга истолковано патологоанатомом (AB) и биолог обученный в желудочном гистологии рака (DW). Наблюдатели получили образцы случайным образом, т.е. SISH, IHC, и комбинированный метод не были оценены в сочетании друг с другом, но по отдельности для каждого пациента. Консенсус обоих обозревателей был найден после каждой оценки. Поскольку противоречивые результаты между обоими методами могут быть результатом изменчивости внутри наблюдателя, а не различия в качестве окрашивания, диссонирующие случаи были перепроверены с помощью третьего наблюдателя, который не знал о результатах первой оценки, но оценивали противоречивые случаи (методы) в связи друг с другом. Наконец, консенсус был установлен между третьим наблюдателем и первичных наблюдателей.
Результаты IHC были интерпретированы с использованием схемы подсчета очков, предложенную для рака желудка по Hofmann и др. [17] и Rüschoff и др. [18]: 0, отсутствие реактивности или перепончатые реактивность в &л; 10% опухолевых клеток; 1+, слабый /едва заметный перепончатая реакционная способность в > 10% опухолевых клеток; 2+, слабый до умеренного полный, боковой или базолатеральных мембранную реактивность в &ГТ; 10% опухолевых клеток; и 3+, сильная полная, боковая или базолатеральная перепончатая реактивность в ≥ 10% опухолевых клеток.
В SISH результатов, общее количество HER2 и хромосоме 17 сигналы были подсчитаны по меньшей мере, 20 ядер опухолевых клеток в двух различных областях. Коэффициенты HER2 /Хр 17 были интерпретированы в соответствии с ToGA FISH схемы подсчета очков для тестирования HER2 в желудка и желудочно-пищеводного соединения (GEJ) рака следующим образом: &л; 2,0, ген HER2 не усиливается; ≥ 2,0, ген HER2 усиливается [17]. Среднее число шести или более рассматривается как усиливается.
Статистический анализ
Анализ был исследующий без каких-либо заранее определенных расчетов размера гипотезы или образца. Число 100 пациентов, было признано достаточным для выполнения предложенных статистических тестов. Корреляция между IHC /SISH и гена /белка оценивали с использованием коэффициента каппа Cohen's (К). Интерпретация значение каппа по Альтмана [19] был использован: к > 0.81, очень хорошее согласие; 0.61-0.80, хорошее согласие; 0.41-0.60 умеренное соглашение; 0.40-0.21, справедливое соглашение; &Л; 0,20, небольшое соглашение. Статистический анализ проводился с использованием программного обеспечения WinStat (R.Fitch версии программного обеспечения 2009,1).
Результаты
характеристики пациентов
девяносто шесть из 100 случаев пациентов были обложению. Один случай был исключен из-за отсутствия опухолевых клеток и трех случаев для плохих сигналов в одном SISH окрашиванием.
Большинство пациентов были мужчины (67,7%) и ≥ 65 лет (70,8%) (таблица 1). Когорта состоит из пациентов с аденокарциномой середины к дистальной желудка (50,0%) или GEJ (45,8%) с большим количеством случаев Lauren`s кишечника (67,7%), чем диффузных опухолей (28,1%). Градация большинства образцов был G3 (50,0%), а затем G2 (39,6%) и опухолей, классифицированных как G2-3 (10,4%). 85,7% резецированной больных (п = 28) показали узел метастаз лимфатический (N этап) и 64,3% не показали отдаленных метастазов (M этап). В половине резецированными пациентов наблюдалась стадия опухоли Т3, а затем T2 в 28,6%, T1 у 14,3% и стадии Т4 у 7,1% от patients.Table 1 Patient's характеристик и HER2 позитивности подгруппами
<Ьг> Общее п = 96 (%)

положительности * (IHC 3+ или SISH +) одного п (%)

положительности * (IHC 3+ или SISH +) комби п (%)

Пол
Женский
27 (28,1)
2 (7.4)
1 (3.7)
Мужской
65 (67,7) 11
(16,9)
11 (16,9)
Unknown
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
Возраст
Результаты 18-94 Yrs (медиана 69)
≥ 65
68 (70,8) 12
(17.6)
11 (16,2)
&л; 65
28 (29,2)
4 (14,3)
4 (14.3)
Первичная локализация опухоли
середины до дистальной желудка
48 (50,0)
5 (10,4)
4 (8.3)
GEJ
44 (45,8)
8 (18,2)
8 (18,2)
Не указано
4 (4.2)
3 (75,0)
3 (75,0)
классификации Lauren
Диффузный
27 (28,1)
3 (11.1) страница 2 (7.4)
Mixed страница 4 из (4.2) <бр> 1 (25,0)
1 (25,0)
Кишечные
65 (67,7) 12
(18,5) 12
(18,5)
из биопсийного /резекцию
Биопсия
68 (70,8) 10
(14.7)
9 (13.2)
резекцию
28 (29,2)
6 (21,4)
6 (21,4)
T стадии (п = 28)
T 1
4 (14,3)
0 0

T 2
8 (28,6)
2 (25.0)
2 (25.0)
T 3
14 (50,0)
4 (28,6)
4 (28,6)
T 4
2 (7.1) 0

0
N этап (п = 28)
N +
24 (85,7)
5 (20,8)
5 (28,8)
N -
4 (14.3)
1 (25,0)
1 (25,0)
M этап (п = 28)
М +
5 (17,9)
1 (20,0)
1 (20,0)
M - <бр> 18 (64,3)
3 (16.7)
3 (16.7)
Mx
5 (17,9) 2 (
40,0)
2 (40,0)
Градация <бр> G2
38 (39,6)
6 (15.8)
6 (15.8)
G2-3
10 (10,4)
2 (20,0)
2 (20,0)
G3
48 (50,0)
8 (16.7)
7 (14,6)
Сокращения
: IHC
иммуногистохимии, SISH
серебра гибридизация T <бр в> первичная опухоль, N
лимфатических узлов, M
метастазы * определяется как IHC 3+ или SISH ≥2.0.
P
= 1 для всех сравнений между IHC /SISH и методов генной /белка (Fisher Тест'S Exact).
В таблице 1 HER2 положительность подгруппами также представлены. Никаких существенных различий не было отмечено в HER2 позитивности по сравнению с подгруппами и различными методами.
Результаты Окрашивание для экспрессии белка HER2 и амплификации гена (единичные методы окраски)
экспрессии белка баллов по IHC были 0 и 1 + в 70,8% и 10,4% пациентов (таблица 2). 2,9% 0 баллов и 10,0% + Score 1 случаев были усилены. В 9,4% случаев, умеренное выражение (оценка 2 +) с 44,4% усиленных случаев был обнаружен. 9,4% окрашенных образцов показали сильное выражение (оценка 3 +) с 77,8% усиленных случаев. Рисунок 1 демонстрирует репрезентативные результаты от отдельных staining.Table 2 результатов Окрашивание для экспрессии белка HER2 и амплификации гена
одностоечные метод

Комбинированный метод

IHC Счет

IHC (п = 96)

SISH ≥ 2,0

IHC (п = 96)

SISH ≥ 2,0

п (%)
<бр> п (%)

п (%)

п (%)

0
68 (70,8)
2 (2.9)
68 (70,8)
2 (2.9)
1+
10 (10,4)
1 (10,0)
11 (11,5)
1 (9.1)
2+
9 (9.4)
4 (44,4) 7
(7.3)
2 (28.6)
3+
9 (9.4)
7 (77,8)
10 (10.4)
9 (90,9)
Сокращения
: IHC
иммуногистохимии, SISH
серебра гибридизация
Рисунок 1 Представитель результаты различных методов окрашивания.. Кишечный опухоли (гематоксилином и эозином (Н &Amp; Е), А.1, 20x) с IHC 3+ (иммуногистохимии (IHC), А.2, 20x, ген /белок, А.4, 20х) и амплификации (серебро на месте гибридизация (SISH), А.3, 40x; ген /белок, А.4, 20x). IHC оценка 0 (IHC, В.2, 20x; ген /белок, В.4, 40x), кишечного типа (H &Amp; E, B.1, 20x) и усиление (SISH, B.3, 40x; ген /белок , В.4, 40x).
Gene /белок (комбинированный метод окрашивания)
экспрессии белка оценки методом генной /белка были 0, 1+, 2+ и 3+ в 70,8%, 11,5%, 7,3 % и 10,4% (таблица 2). Существовали 2,9% /9,1% случаев усиливается в образцах со счетом 0 /1+. 28,6% Усиленные случаев показали умеренное окрашивание (оценка 2+). Образцы с высоким уровнем экспрессии (3+) показал в 90,9% амплификации гена. Примеры окрашивания гена /белка, показаны на рисунке 1.
Оценка по конкордантном и несогласованных случаев
оценке IHC окрашивания в обычном одно- и метода гена /белка не всегда выявляют конгруэнтных результатов; соглашения обоих методов были также перечислены в таблице 3 Были очень хорошие конкордансы в результатах усиленных случаев (соглашение 100,0%; каппа-коэффициент κ = 1), а также оценка 0 (100%; κ = 1), оценка 1+ ( 98,96%; κ = 0,947) и оценка 3+ образцов опухоли (96,88%; κ = 0,825) в обоих методах. Случаи со счетом 2+ показали меньше конкордантность, хотя по-прежнему хорошо (95,83%; κ = 0,728). Соответствие между общим HER2 позитивности (определяемой как IHC 3+ или SISH +) в стандартном или новым способом был очень хорош (98,69%; κ = 0,963; 17,7% по сравнению с 16,7%) Таблица 3 Конкордансы между отдельными методами и комбинированного гена /белка. методы одностоечные комбинацию против

Concordance

каппа-коэффициент к

соглашение Альтман [[15]]

SISH усиленную
100 %
1
Очень хорошее качество IHC оценка 0
100%

1 Очень хорошее качество IHC балл 1+
98.96%
0,947
Очень хорошее качество IHC оценка 2+
95.83%
0,728
хорошее качество IHC балла 3+
96,88%
0,825
Очень хорошее качество Сокращения
: IHC
иммуногистохимии, SISH
серебра гибридизация.
Существовали двенадцать противоречивые случаев перед повторным анализа со стороны третьего наблюдателя (данные не показаны). После повторной оценки со стороны третьего наблюдателя, несоответствующие результаты оставались в четырех образцах опухолей. Причина восьми несоответствующих случаев в промежуточном анализе было установлено, что изменчивость внутри наблюдателя. Результаты финальных разноголосых результаты представлены в таблице 4.Table 4 Подробная оценка результатов несогласованных между методами
одностоечные методы

Комбинированный метод



Case гистологии (Lauren)

IHC (Score)

SISH (≥ 2,0 /&л; 2,0)

IHC (Score)

SISH (≥ 2,0 /&л; 2,0)

6693
я
2+
≥2.0
3+
≥2.0
9924
я
2+ <бр> &л; 2,0
1+
&л; 2,0
20209
я
2+
≥2.0
3+
≥2.0
1057
d
3+
&л; 2,0
2+
&л; 2,0
Сокращения
:. IHC
иммуногистохимии, SISH

серебра гибридизация Обсуждение
цель данного исследования состояла в том, чтобы оценить возможность новой платформы гена /белка по сравнению с одиночными методами окрашивания в желудочных аденокарцином и карцином пищеводно перехода.
из оцениваемых образцов 28,1% показали, диффузный, 4,2 % смешанный и 67,7% кишечной гистологического типа. Большинство пациентов были ≥65 лет (70,8%) и мужчин (67,7%). Скорость аденокарциномы GEJ или середины к дистальной желудка была сходной (45,8% против 50,0%). В стандартном методе, 17,7% пациентов были положительный HER2. Большинство HER2-положительных опухолей были кишечной гистологии и локализовались в месте соединения GE, это хорошо коррелирует с данными литературы [20, 21]. В целом, на основе пациента и характеристик опухоли, а также положительный HER2 статус, оцениваемая группа является представителем коллектива. Несмотря на то,
значительный опыт для анализа HER2 по IHC и ISH для рака молочной железы доступен, он не уверен, могут ли они быть напрямую переданы карцином желудочно-кишечного тракта. Экспрессия белка HER2, в отличие от рака молочной железы, является гетерогенным и часто очаговым выраженным. Фокс и др. [12]. определяется статус HER2 в 100 образцах ткани с диагнозом распространенным раком желудка или рака пищеводно перехода в разных лабораториях, чтобы проверить свои матчи. Для этого, IHC и CISH (хромогенные гибридизация) или SISH были применены. Был хорошее согласие между различными лабораториями относительно хромогенной гибридизации in situ или SISH, но наблюдалось умеренное конкордантность всех баллов IHC. На основании результатов исследования, по мнению автора, что определение статуса HER2 на основе на ВВК, а затем ISH (европейский стандарт) не является оптимальной стратегией оценки и рекомендуется выполнять оба метода окрашивания [12]. Другое исследование [22] тестировали HER2 амплификации и экспрессии у 148 пациентов с поздними стадиями рака желудка по IHC и FISH /SISH. Положительные случаи HER2 были обнаружены только у 10% ВВК по сравнению с 18% до 22% в гибридизация. Не только потому, что было легче воспроизвести, автор предложил на месте методом гибридизации в качестве лучшего подхода для определения HER2 положительность [22]. Однако, основываясь на TOGA испытании [8], у пациентов с ИСГ положительным, но IHC отрицательным или еженедельно (1+) положительных опухолей не получают выгоды от трастузумаба. Таким образом, использование рыбы или SISH в качестве основного и единственного метода не рекомендуется использовать в Европе и IHC по-прежнему рассматривается в качестве основного метода оценки во многих странах.
Насколько нам известно, однако, нет никаких исследований, которые непосредственно сравнивать результаты обоих иммуногистохимии (IHC) и гибридизация серебра (SISH) в когда каждый используется отдельно с результатами их использования в сочетании на одном участке в желудочных карцином. Для визуализации РНК и ДНК мишени на месте, существуют различные способы маркировки зондов с использованием флуоресценции, хромогенный или серебра обнаружения. Все предыдущие исследования с настройками, сравнимые с нашего анализа использовали хромогенный или флуоресцентная гибридизация (CISH или FISH) в. Даунс-Келли и др. [14] в сочетании стандарт IHC с осаждением металлического серебра EnzMetTM на микрочипе ткани (TMA) из карциномы молочной железы и сравнили результаты IHC и флуоресценции в гибридизация (FISH) при исполнении в одиночку. В другом исследовании, авторы действительно использовали сочетание IHC и серебра гибридизация (SISH) в TMA молочной железы и образцов желудочного рака, в но сравнили результаты, полученные с помощью IHC и флуоресценции в гибридизация (FISH) в качестве одного окрашивания [16]. Reisenbichler и др. [15] сообщили о результатах сравнения IHC и хромогенной гибридизация (CISH) в качестве отдельных окрашиванием с двойным анализом IHC /CISH в. Одновременное оценка белковых и генных комбинаций на одном слайде предложил хорошо воспроизводимый и очень надежный метод с хорошими конкордансы.
Чтобы проверить правильность нового гена /белка окрашивания по сравнению со стандартизованным IHC и SISH, были рассчитаны конкордансы на основе коэффициента каппа. В соответствии с рекомендациями ASCO /CAP для рака молочной железы, новый тест должен показать более чем на 95% с конкордантность одобренного эталонного анализа [23]. В нашем исследовании, новый метод показал конкордансы выше 95% с точки зрения всех тестов. Были очень хорошие конкордансы в результатах амплификации гена, а также оценка 0 (каждый со 100%), оценка 1+ (98,96% соглашение) и оценка 3+ образцы опухоли (96,88% соглашение). Случаи со счетом 2+ показали менее согласующиеся результаты, хотя до сих пор хорошо (95.83% соглашение). Трудности в случаях с умеренным выражением в оценке и классификации известны в литературе. Tafe и др. [24]. показали, что существуют трудности в назначении окончательный счет в оценке ВВК из-за отсутствия в надежного разделения случаев с HER2 счетом 1 + или 2 +. Эти категории могут быть ограничены субъективностью и плохой воспроизводимости. Явление, диссонирующие результаты наблюдаются у пациентов с низким уровнем экспрессии HER2, которые иногда имеют до сих пор амплификации гена HER2, было сообщено в раке пищевода [24-26]. Наиболее вероятной причиной этого является рассогласование внутри опухоли гетерогенность статуса HER2 в желудочном или GEJ рака [17, 27, 28]. В нашем исследовании наблюдались противоречивые результаты IHC у четырех пациентов, но они привели к клинически значимой разницы в HER2 положительности у одного пациента только (пациентi7). У пациента был рак желудка диффузного типа. Оценка диффузных опухолей представляется более сложным, чем опухоли кишечника типа [29, 30]. Согласно Rüschoff и соавт. [18]. только 5% этих опухолей показывают положительный HER2 статус; печатки карцином кольца клеток являются отрицательными. HER2 усиления крайне редко при диффузном раке желудка, которая связана с аномальной экспрессии E-кадгерина [13, 31-33].
SISH является относительно новый метод обнаружения амплификации гена HER2. Многочисленные исследования подтвердили высокую согласованность с другими методами in-situ гибридизации, как и рыбы хромогенной гибридизации in situ [34]. По сравнению с IHC, ISH показывает более высокую чувствительность и специфичность и более высокую воспроизводимость. Это утверждение может быть подтверждено путем сравнения согласование усиленных случаев в наших методах. Результаты показали очень хорошее согласие между обоими методами (100,0%; к = 1). Кроме того, ISH менее чувствителен, чем IHC из-за относительной стабильности ДНК по сравнению с различиями в фиксации и обработки тканей.
В настоящее время мы работаем над расширенной исследования по оценке, является ли этот новый метод, связанный с сокращением между наблюдателями изменчивость в определении статуса HER2 при раке желудка. Это исследование также включает в себя компонент, глядя на время, необходимое, чтобы сообщить окончательные результаты. Результаты будут представлены в журнале в виде письма или первоначального доклада, как только они доступны.
Выводы
В данном исследовании мы четко показали, что использование комбинированного метода для выполнения экспрессии белка HER2 и амплификации гена на одном слайде может дать результаты, аналогичные тем, с помощью каждого метода по отдельности в контролируемом исследовании реализации трех независимых наблюдателей. Все авторы читали и одобрили окончательный вариант рукописи.

• Долгосрочные эффекты лапароскопической втулки гастрэктомии против Roux-ан-Y желудочного шунтирования для лече…
• Полиморфизм TGFB1 и VEGF генов и выживаемость больных раком желудка