Zaviranje želodca H, K-ATPaze dejavnost in želodca epitelijske celice IL-8 izločanje, ki ga pirolizin izpeljanega ML 3000

Zaviranje želodca H, K-ATPaze aktivnosti in želodca epitelijskih celic IL-8 izločanja ki ga pirolizin derivata ML 3000
Abstract
Ozadje
ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-klorofenil ) -7-fenil-2,3-dihidro-1 H-pirolizin-5-il] ocetna kislina) je zaviralec tako ciklooksigenaze in 5-lipoksigenaze in vitro, in obeta kot novega nesteroidnega protivnetnega zdravila (NSAID). Za razliko od običajnih nesteroidna protivnetna zdravila, ki so povezane z želodčnih ulkusnih učinkov, ML 3000 povzroča malo ali nobene poškodbe želodčne sluznice, čeprav je precej posede tvorbe prostaglandinov v želodcu.
Metode
Kot del prizadevanj za razjasnitev mehanizmov, na katerem temelji želodca varčujejo lastnosti ML 3000, smo preučevali učinke ML 3000 o H, K-ATPaze aktivnost in vitro, na kisline kopičenja v izoliranih celicah želodčne stene, in IL-8 izločanja s epitelnih celic želodca v kulturi.
Rezultati
SCH28080 občutljiva H, K-ATPaze dejavnost visoko prečiščena prašičev želodca mikrosomih je v odvisnosti od odmerka zavira ML 3000 (IC 50 = 16,4 iM). Zaviranje je reverzibilna in neobčutljiva na ml 3000 zakisljevanje v območju pH 2,0-8,0. V zajcev celicah želodčne stene,
ML 3000 kopičenje v odvisnosti od odmerka zaviral-histamina spodbudila kisline (IC 50 = 40 pM) in akumulacija-forskolin spodbudila kisline (IC 50 = 45 pM). Nazadnje, v celicah človeškega adenokarcinomom želodca (AGS), ML 3000 v odvisnosti od odmerka zaviral tako izhodiščno in IL-1β spodbujene (20 ng /ml), IL-8 izločanje z IC 50 let za 0,46 mikrometrov in 1,1 uM oz.
Zaključek
podatki kažejo, da ML 3000 vpliva na kislinsko-sekretornih mehanizme v smeri toka cAMP sredstev, ki jih histamin aktivacijo H 2 receptorja jih povzročajo, da neposredno zavira H, specifične aktivnosti K-ATPaze, in da izhodiščno želodčne epitelne celice IL-8 inhibicijo izločanja lahko posreduje ML 3000 inhibicije 5-lipoksigenaze aktivnosti. Sklepamo, da lahko te funkcije želodca zaviralni podatkov, na katerih temeljijo želodčne varčujejo lastnosti ML 3000.
Ozadje
farmakoloških lastnosti nesteroidnih protivnetnih zdravil (NSAID), izhajajo iz njihovega zatiranja sinteze prostaglandinov iz arahidonske kisline [1] . Zaviranje želodčnih prostaglandinskega sintez je pa spremlja zmanjšala želodčne sluznice dotok krvi, s sočasnim občutljivost sluznice za topično poškodbe z različnimi dražečih [2]. Obetaven farmakološko strategija za preprečevanje želodčnih zapletov, povezanih z NSAID uprave osredotoča na sočasni ciklooksigenaze in inhibicije 5-lipoksigenaze, s ciljem zatiranja sintezo levkotrinu. 5-lipoksigenaze pretvori arahidonske kisline na levkotrienov, med katerimi je levkotrien B4 kemotaktični za levkocitov in tako prispeva k vnetnih mehanizmov, ki vodijo do razjed v prebavilih [3]. Pirolizin derivat ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-chlorophen-il) -7-fenil-2,3-dihidro-1 H-pirolizin-5-il] ocetna kislina) je zaviralec oboje ciklooksigenaze in 5-lipoksigenaze in vitro [4, 5], in obeta kot roman nesteroidnih protivnetnih zdravil. ML 3000 zmanjša želodca prostaglandinov E2 sintezo iz podganjega želodca in kri, čeprav ni bila ugotovljena znatna inhibicija želodca ali krvi levkotriena B4 sintezo [6]. Najpomembneje je, ML 3000 nima nobenega vpliva na levkocitov spoštovanje v mezenterićne venules, in ne povzroča želodčne sluznice poškodbe [6].
V živalskih modelih je ML 3000 ugotovljeno, da je farmakološko benigna. Tako je spojina ni vplival podgane gibalne dejavnosti ali spanja-heksobarbital povzroča, ni imela kardiovaskularne ali respiratornih učinkov pri podganah in psih so brez vpliva na živčno-mišično funkcijo pri mačkah, in je povzročil niti želodčne škodo niti peristaltiko motnje [7]. ML 3000 izzvan šibek spasmogenic odziv pri budrinega ileum in povzročil majhno prehodno zmanjšanje izločanja urina pri podganah [7]. Študije genotoksičnosti kažejo, da ima ML 3000 ne vpliva na genske mutacije frekvenc v bakterij in sesalskih celicah, na neurejeni sintezi DNA ali na frekvenci kromosomskih aberacij v celicah rat kostnega mozga [8]. -14C označene ML 3000 distribucije in izloča študije na podganah kažejo enterohepatično cirkulacijo in glukuronidni konjugacijo z ML 3000 [9].
Farmakološki profil ML 3000, kot so jih raziskali pri živalskih modelih kaže protivnetno, analgetično, antipiretik, antiastmatičnih in antiaggregative aktivnost v odmerku, ki povzroča nobene želodčne poškodbe [4, 10]. Akutne in kronične protivnetne lastnosti ML 3000 preučevali v-adjuvantno inducirane podganjem modelu tačk edema [11] kažejo, da čeprav je indometacin nekoliko močnejši kot protivnetno sredstvo ni bilo poškodb želodca je z ML 3000 do 100 mg /kg /d po, ​​medtem ko je ulcerogeni odmerek (UD 50) za indometacin je 7 mg /kg /d pO
želodca razjede, ki NSAID inducirane bistveno omejuje uporabnost teh zdravil. Jasno je, da kombinacija protivnetnih in želodčnih varčujejo lastnosti v ML 3000 razstavljenih je ta spojina privlačen kandidat za nadaljnji študij. Dva želodčne sluznice funkcije, ki igrajo pomembno vlogo pri razjede želodca so izločanje kisline in interlevkin-8 izločanje. sekrecijska zaviralci kisline, so med najbolj visoko predpisanih zdravil, kar kaže na fiziološki rek "Ne kislino, ne razjeda". Farmakološko ali patofiziološki prekoračitev želodca ovir sluznice podpreti širjenje HCl vodi do hitre erozije želodčne epitelijske enoplastni in posledično razjede sluznice. Zaviranje izločanja želodčne kisline, ki ga antagonizem na receptorjih parietalnih celica histamina H2 (cimetidin), ali z direktno kovalentno derivatizacijo in inaktivaciji želodčni protonske črpalke (omeprazol, lansoprazol, rabeprazol, esomeprazol, itd) rutina za omiljenje in spodbujanje celjenje želodca razjede. Tako lahko želodčne učinki varčuje ML 3000 so povezani s kislinsko inhibicijo sekretorni ga spojine.
Komplementarno želodčne varčevalni učinek ML 3000 lahko vključuje modulacijo želodčne sekrecije pro-vnetnih citokinov IL-8. -Aspirin povzroča poškodbe želodca so poročali, da je povezana s povečano antralnih proizvodnjo IL-8 [12]. Ulkusnih bakterija Helicobacter pylori
Dokazano je, da poveča hitrost in amplitudo IL-8 izločanja in vitro in in vivo [13-15], in navzgor regulacijo IL-8 ekspresijo genov [16]. Podobne učinke IL-8 prosecretory so videti kot posledica IL-1β stimulacijo epitelnih celic želodca. Primerjava učinkov ML 3000 in drugih NSAID o teh želodčnih izločevalnih dejavnosti lahko pojasnimo mehanizem, s katerim ML 3000 preprečuje nastanek želodčnih lezij na sluznicah.
Da bi pojasnili mehanizme, ki podpirajo želodca varčujejo lastnosti ML 3000, smo raziskovali učinek ML 3000 na dveh želodčne sluznice sekretornih funkcij z vlogo v razjed: izločanje solne kisline in izločanje vnetnih citokinov interlevkin-8. Naši podatki kažejo, da je ML 3000 zavira prašičjega želodca mikrosomskimi H, K-ATPaze dejavnost, zavira-histamina spodbudila zakisljevanje v kunčjih želodčne stene celic in zavira IL-1β spodbujene IL-8 izločanje za želodčne epitelijskih celic.
Metode
Reagenti
ML 3000 in ZD-2138 so bili zagotovljeni Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazol jih je predložil AstraZeneca R & D, Molndal, Švedska, SCH 28080 je od Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC prišel iz Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO in NS 398 je prišel iz Kajmanskih Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arahidonska kislina, indometacin, acetil salicilna kislina, naproksen, PGE 2, levkotrieni B4 in D4 in IL-1β bili vsi pridobljeni iz Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimetilsulfoksid (Sigma-Aldrich) je bila uporabljena za solubilizacijo ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398 in indometacin. Acetil salicilna kislina in naproksena smo raztopili v ATPaze testnem pufru (tam spodaj
). Arahidonska kislina in PGE 2 smo raztopili v absolutnem etanolu, in omeprazol raztopimo v metanolu. Levkotrieni B4 in D4 bila dobavljena raztopimo v 70:30 mešanico metanola in 17 mM amonijev acetat. IL-1β raztopimo v-fosfatnim pufrom (pH 7,4), 0,1% m /v goveji serum albumin. Vsi testi, ki uporabljajo te spojine vključene ustrezne kontrole topil in vsa topila so bile prisotne v koncentracijah manj kot 1% m /vv končnem analiznega zmesi.
Priprava H, K-ATPaze
mikrosomskimi želodca H, K-ATPaze smo pripravili iz prašičjih želodčne sluznice homogenatov z diferencialom in saharoza /Ficoll stopenjski gradient centrifugiranjem kot smo že prej [17] opisano. Ta pripravek daje relativno težka (7% Ficoll /1,1 M saharoza vmesnik) mikrosomskimi del GII, ki je pokazala ne latence K-ATPaze dejavnost, in ki sestavlja ~ 90%, H, K-ATPaze, ki temelji na denzitometrijo za 94 kDa pasu z analizo SDS-PAGE. GII mikrosome smo hranili pri -80 ° C v 20% glicerola.
H, so ATP K-ATPase testu
hidrolitična aktivnost prašičjega želodca mikrosomi kvantificiramo kot ortofosfata izpustitvi iz substrata ATP uporabi kolorimetrično malahitzelene postopka [18] . ATPaze analize so bile izvedene v 96-dobro mikroplošče. Na kratko, 100 ul /vdolbino test pufer (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCl, ± 50 um SCH28080), ki vsebuje 80 ng mikrosomskimi H, K-ATPaze ML 3000 (10 -9 M 10 -4 M) ali drugih spojin in 1 mM ATP smo inkubirali 30 minut pri 37 ° C. Encimska aktivnost je bila ustavljena z dodajanjem (45 ul /dobro) od kolorimetrično reagenta (0,07% malahit zelena, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% amonijev molibdat tetrahydrate, 0,134% Tween-20). Po 10 sekundah smo barvno reakcijo razviti z dodatkom (45 ul /vdolbino) 15% natrijevega citrata. Po 45 min pri sobni temperaturi smo absorbanco vrtine na 570 nm izmeri v mikroploščnem čitalniku.
Za merjenje učinkov ML 3000 kisanja na inhibicijo ATPaze so ML 3000 alikvote (10 mM v 5 mM Tris-HCl) titriramo do pH od 2,0 do 7,4 za 30 minut. Želodčne mikrosome suspendirani v standardnem ATPaze testnem pufru pri pH 7,4 smo inkubirali 30 minut s nakisane alikvoti ML 3000 (16,6 pM končne ML 3000 koncentracije) in nato ATPaze aktivnost smo izmerili kot je opisano zgoraj. Za merjenje omeprazol inhibicijo H, K-ATPaze aktivnosti so želodčni mikrosomi suspendirane v ATPaze testnem pufru pri pH 6,1 inkubirali 30 minut z različnimi koncentracijami omeprazol. Omeprazol zakisljevanje na pH 6,1 je bilo potrebno, da se omogoči nastanek zaviralnega tiolne reaktivnega sulfoksida vmesnega [19]. Želodčnega mikrosome smo nato prenesli v standardni ATPaze pufru pri pH 7,4 in ATPaze aktivnost smo izmerili kot je opisano zgoraj. Specifična aktivnost H, K-ATPaze je bila izračunana kot razlika v mikrosomskih ATPaze aktivnosti v prisotnosti in odsotnosti posebne reverzibilne želodca H, K-ATPaze inhibitor SCH28080, in je bila izražena kot p.molov P i /mg beljakovin /h. H, K-ATPaze dejavnost sveže pripravljene prašičev želodca mikrosomih v razponu od 140 do 170 p.molov P i /mg beljakovin /h. Grafično prikazovanje podatkov kaže odstotno inhibicijo H, K-ATPaze dejavnost kot funkcijo sestavljenih koncentracij.
Primarna celica pripravek
celicah želodčne stene smo izolirali iz novozelandskih zajcev, pronaza /kolagenaze presnovo fundic sluznice čemur s obogatitev celic na sekvenčnih Nycodenz vzponi kot prej [20] opisano. Priprave parietalnih celic vsebuje približno 10 7 celic /želodec, od tega je bilo 80 ± 5% parietalnih celic, ki temeljijo na imunocitokemija s H, K-ATPaze-specifičnimi monoklonskimi protitelesi.
Acid Akumulacija Vsebnost
akumulacije Aminopyrine v parietalnih celice so ocenili v 96 tudi filtrirnih ploščah s Durapore membran, kot je bilo prej [21] opisano. Na kratko smo celice predhodno inkubirali s [ 14C] -aminopyrine nato 100.000 celic /200 ul na jamico smo inkubirali z ali brez testne spojine za 15 minut pred inkubacijo za nadaljnjih 30 minut v prisotnosti ali odsotnosti 100 uM histamina ali 100 uM forskolin. Vse določitve smo izvedli v štirih izvodih. Bazalno akumulacija aminopyrine je bil določen kot kopičenje aminopyrine v neobdelanih celic odštejejo od akumulacije v prisotnosti KSCN (odsev nespecifičnega izotopa ujetja v past). Grafično prikazovanje podatkov kaže odstotno inhibicijo akumulacije-histamina stimulirane kisline glede na celice v odvisnosti od sestavljenih koncentracij.
Adenokarcinomom želodca Celice
Človeški adenokarcinomom želodca celic (AGS celice, ATCC CRL 1739) so bile vzdrževane v AGS medij (Ham je F-12, 10% fetalni goveji serum, 100 enot /ml penicilina G, 0,25 jug /ml amfotericina B, 100 ug /ml streptomicina) pri 37 ° C v 5% CO 2/95% zraka inkubator in rabljeno med prehodov 42 in 56. za študij IL-8 izločanja smo AGS celice zasadili na 96-vdolbinami (50.000 celic /100 ul /vdolbino) in pustimo, da se veže za 18 ur pri 37 ° C v 5% CO 2/95% zraka. Celice smo nato inkubirali s testnimi spojinami v prisotnosti in odsotnosti IL-1β za 24 ur, pri kateri so časovni vzorci medija, odstranjenih iz vdolbinic in skladiščenih pri -70 ° C. IL-8 koncentracije vzorcih smo določili z encimsko imunskim testom (Humani IL-8 Duo Set za razvoj ELISA sistem, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Grafično prikazovanje podatkov kaže odstotno inhibicijo nestimuliranih ali stimuliran IL-8 izločanja kot funkcijo sestavljenih koncentracij
Statistična analiza
Vsi poskusi so bili opravljeni vsaj trikrat.; podatkovne točke v vsakem poskusu predstavljata merilnih sredstev iz vzorcev trojnih. Podatkovne točke opremljanje treh parametrov logistično enačbo so na grafu kot sigmoidne krivulje doza-odziv z uporabo statističnega paketa Prizma (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Polovica maksimalne inhibitorne koncentracije (IC 50) in IC 50 95 intervali% zaupanja (CI) smo izračunali tudi z uporabo Prism. Podatkovne točke, ki ne ustrezajo logističnega treh parametrov so bili pripravljeni kot enostavne krivulje od točke do točke. Standardna napaka je ukrep variance, ki se uporablja za palice napak v grafičnem prikazovanju podatkov
Rezultati
Učinki ML 3000 o H, K-aktivnosti ATPaze
želodca H, K-ATPaze aktivnost je bila v odvisnosti od odmerka zavira ML 3000, s polovično maksimalno inhibitorno koncentracijo (IC 50) 16.4 uM (CI = 6,84-39,3 pM) (slika 1A). Zaviralni aktivnost ML 3000 je bila primerjavi s klasičnim zaviralca protonske črpalke (PPI), substituiran benzimidazol omeprazol. Slika 1B prikazuje učinek omeprazola na H, K-ATPaze dejavnost v skladu s testnimi pogoji, enakimi tistim na sliki 1A; izračunana IC 50 za omeprazol je bil 1,7 pM (CI = ,26-11,3 um). Ti podatki kažejo, da je ML 3000 bistveno manj močan kot omeprazol v zvezi z želodčno H, K-ATPaze inhibitorno aktivnost, vsaj pri določanju tem in vitro testu pod določenimi pogoji. Ugotoviti, ali je ML 3000 prikazana primerljive kislino aktivacijskih lastnosti, je pol maksimalno inhibitorna koncentracija ML 3000 zvišati na drugačen pH in smo izmerili učinke na H, K-ATPaze aktivnosti. Kot je prikazano na sliki 2A, imela zakisljevanje ML 3000 ni pomembno vplivala na njeno H, K-ATPaze zaviralnega profilu. Ti podatki kažejo, da ML 3000, v nasprotju s omeprazol, ne zahteva zakisljevanje za indukcijo inhibitorno aktivnost. Glede na to, da so IPČ ireverzibilni inhibitorji H, K-ATPaze dejavnost, kovalentno veže na katalitične alfa podenoto, smo skušali ugotoviti, ali je bil ML 3000 zaviranje H, K-ATPaze povraten ali nepovraten. Želodca H so K-ATPaze-obogatene mikrosomi obdelamo z maksimalno-inhibitorno koncentracijo ML 3000 in nato razredčimo z velikim presežkom pufra za zmanjšanje ML 3000 koncentraciji od 100 um do 3,3 um. Rezultati, prikazani na sliki 2B, je pokazala, da redčenje ML 3000 obnovljena H, K-ATPaze dejavnost, in so v skladu z ML 3000 zaviranjem H, K-ATPaze dejavnost na reverzibilen način, tj., ML 3000 ne kovalentno derivatize bodisi podenote želodca H, K-ATPaze, vsaj pod pogoji sedanje vitro testom H, K-ATPaze aktivnosti. V zvezi s tem, ML 3000 je kinetično podoben SCH28080, posebno reverzibilni zaviralec želodca H, K-ATPaze. Slika 1 od odmerka odvisno inhibicijo H, K-ATPaze dejavnosti s ML 3000 (A) in ga omeprazolom (B). (A). Želodčne mikrosome suspendirani v ATPaze testnem pufru pri pH 7,4 inkubiramo 30 minut z različnimi koncentracijami ML 3000 in ATPaze aktivnost je bila nato izmerjena pri pH 7,4. Pol maksimalnega inhibitorna koncentracija (IC50) za ML 3000 je 16,4 pM (CI = 6,84-39,3 pM). (B). Želodčne mikrosome suspendirani v ATPaze testnem pufru pri pH 6,1 smo inkubirali 30 minut s spreminjanjem koncentracije omeprazola in nato prenese na standardni ATPaze pufru pri pH 7,4 za merjenje aktivnosti ATPaze. IC50 za omeprazol je bil 1,1 pM (CI = ,26-11,3 um). The-točke podatki kažejo srednjo ± S.E. iz treh neodvisnih testih na vsakem od katerih je bila izmerjena SCH28080 občutljiv ATPaze aktivnost v treh izvodih.
Slika 2 Učinek ML 3000 kisanja za H, K-ATPaze aktivnost (A), in ML 3000 zaviranje H, K-ATPaze dejavnost je reverzibilna (B). (A) ML 3000 alikvote (10 mmol v 5 mM Tris-HCl) smo titrirali do pH od 2,0 do 7,4 za 30 minut pred poleg standardnega ATPaze testnem pufru (pH 7,4), ki vsebuje želodčnih mikrosomov. (B) želodcu mikrosome smo obdelali z maksimalno-inhibitorno koncentracijo (100 uM) ML 3000. smo suspenzijo mikrosomalnega nato razredčimo z velikim presežkom pufra za zmanjšanje ML 3000 koncentraciji od 100 um do 3,3 um. V obeh (A) in (B) se peres podatki kažejo povprečje ± S.E. iz treh neodvisnih preiskavah, v vsakem od katerih je bila izmerjena SCH28080 občutljiv ATPaze dejavnost v treh izvodih.
arahidonske kisline in prostaglandinov E 2 (PGE 2) tudi odvisnosti od odmerka zaviral H, K-ATPaze dejavnost, s IC 50 16,7 pM (CI = 8,9-31,5 LM) in 15 um (CI = 3,96-57,3 um) v tem zaporedju (slika 3A in 3B). Ker ML 3000 kaže tudi zaviranje 5-lipoksigenaze, smo preučevali učinke dveh zaviralcev lipoksigenaznih na mikrosomskih H, K-ATPaze dejavnost. Slika 4A prikazuje, da je 2- (1-tienil) etil 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), ki je močan inhibitor 5-, 12- in 15-lipoxygenses, zaviral mikrosomalnega H, K-ATPaze dejavnost z IC 50 za 22,6 LM (CI = 6,3-81,2 um). V nasprotju s tem je 5-lipoksigenaze specifični zaviralec 6 - ((3-fluor-5- (metoksi-3,4,5,6-tetrahidro-2H-piran-4-il) fenoksi) metil) chinolin (ZD-2138 ) je imela minimalen učinek na H, K-ATPaze dejavnost (~ 20% inhibicijo pri 10 -5 M) (slika 4B). Ti podatki so skladni z želodčno mikrosomski 12- in 15-lipoksigenaz ki imajo vlogo pri H, aktivacija K-ATPaze, ali z neposredno povezavo z TEDBC s H, K-ATPaze podenote spreminjajo encimov konformacijo in s tem aktivnost. Jasno je, da obe razlagi sta provokativna in zasluži dodatne študije. Slika 3 Zaviranje H, K-ATPaze dejavnost, ki arahidonske kisline (A) in prostaglandinov E 2 (B). Želodčne mikrosome suspendirani v ATPaze testnem pufru pri pH 7,4 inkubiramo 30 minut z različnimi koncentracijami arahidonske kisline ali aktivnost PGE2 in ATPaze smo potem merjeno pri pH 7,4. IC50 za arahidonske kisline je 16,7 pM (CI = 8,9-31,5 um) in IC50 za PGE2 bila 15 uM (CI = 3,96-57,3 um). The-točke podatki kažejo srednjo ± S.E. iz treh neodvisnih testih na vsakem od katerih je bila izmerjena SCH28080 občutljiv ATPaze aktivnost v treh izvodih.
Slika 4 inhibicijo H, K-ATPaze dejavnosti, ki jih zaviralca TEDBC je 5-, 12- in 15-lipoksigenaze (A), in 5-lipoksigenaze ZD-2138 (B). Želodčne mikrosome suspendirani v ATPaze testnem pufru pri pH 7,4 inkubiramo 30 minut z različnimi koncentracijami TEDBC ali ZD-2138 in ATPaze aktivnost je bila nato izmerjena pri pH 7,4. V (A), se točke so podatki kažejo srednjo SCH28080 občutljive aktivnosti ATPaze izmerjeno v treh izvodih v enem od treh neodvisnih testih; tipične podatki so prikazani. The-točke, podatki v (B) kažejo pomeni ± S.E. iz treh neodvisnih testih na vsakem od katerih je SCH28080 občutljiv ATPaze aktivnost merjena v treh izvodih.
Za primerjavo H, K-ATPaze inhibitornega učinka ML 3000 z drugimi NSAIDS, smo izmerili učinke acetilsalicilne kisline, NS 398, naproksen, in indometacin na aktivnost protonske črpalke. Vsi štirje nesteroidna protivnetna zdravila bilo brez inhibitornih učinkov na mikrosomskih H, K-ATPaze aktivnost pri koncentracijah do 10 -4 M (10 -3 M za acetilsalicilne kisline) (slika 5a, 5b, 5c in 5d). Indometacin so že poročali, da zavirajo želodčni H, K-ATPaze na nekoliko višjo koncentracijo (K i = 0,67 × 10 -3 M) [22]. Naši podatki jasno razlikovati ML 3000 z drugimi NSAID v smislu zaviralnega učinka na želodčni H, K-ATPaze dejavnost; mehanične podlaga za to razliko, in morebitna korelacija z opazovano-želodčni varčujejo premoženja ML 3000, je treba še raziskati. Slika 5 Vpliv acetilsalicilno kislino, NS 398, naproksen in indometacin na H, K-ATPaze dejavnost. Želodčne mikrosome suspendirani v ATPaze testnem pufru pri pH 7,4 inkubiramo 30 minut z različnimi koncentracijami acetilsalicilne kisline, NS 398, naproksen ali indometacina in ATPaze aktivnost je bila nato izmerjena pri pH 7,4. The-točke podatki kažejo srednjo SCH28080 občutljive aktivnosti ATPaze izmerjeno v treh izvodih v enem od treh neodvisnih testih; tipični podatki so prikazani v vsakem primeru.
Končno, da bi ugotovili, ali je zaviranje želodčne H ML 3000, K-ATPaze odraža učinke učinkovine na domnevno funkcionalnih levkotrienom presnovnih poti, prisotnih v prašičjih želodčnih mikrosomih, smo preučevali učinke levkotrien B4 in D4 na H, K-ATPaze dejavnost. vprašanja topnost izključena študiju LTB4 ali LTD4 koncentracije večje od 1 um. Kot je prikazano na sliki 6A in 6B, ni niti levkotrienskega pokazali nobene inhibitorno aktivnost proti H, K-ATPaze pri fizioloških koncentracijah (10 -9-10 -8 M); le na ne-fizioloških koncentracijah, večjih od 10 -7 M je tam vsako pomembno oslabi H, K-ATPaze dejavnost. Slika 6 Vpliv levkotrienov B4 in D4 na SCH28080 občutljive H, specifične aktivnosti K-ATPaze. Želodčne mikrosome suspendirani v ATPaze testnem pufru pri pH 7,4 inkubiramo 30 minut z različnimi koncentracijami levkotriena B4 ali levkotriena D4 in ATPaze aktivnost je bila nato izmerjena pri pH 7,4. The-točke podatki kažejo srednjo ± S.E. iz treh neodvisnih preiskavah, v vsakem od katerih je bila izmerjena SCH28080 občutljiv ATPaze dejavnost v treh izvodih.
Učinki ML 3000 na parietalnih celic kopičenje kisline v želodcu-histamina spodbudila
ML 3000 v odvisnosti od odmerka zaviral histamina spodbujene (100 uM) kislina akumulacije s zajcev celicah želodčne stene, s polovično maksimalno inhibitorno koncentracijo (IC 50) 40 pM (slika 7A). ML 3000 tudi v odvisnosti od odmerka zaviral z forskolin stimulirano (100NM) kisline kopičenje s zajcev celicah želodčne stene, z IC 50 ~ 45 pM (Slika 7B). Ti podatki kažejo, da ML 3000 vpliva na mehanizme parietalnih celic kisline, sekretorni smeri toka cAMP sredstev, ki jih histamin H 2 aktivaciji receptorja inducirane. Podatki so skladni s ML 3000 inhibicijo izločanja parietalnih celic kisline, ki izhaja iz neposredne interakcije med ML 3000 z želodčno H, K-ATPaze. Vendar pa discepancy med ML 3000 IC 50 v mikrosomskimi mehurčke (15 uM) in v izoliranih parietalnih celicah (40-45 um) kaže, da ML 3000 dostop do znotrajcelične H, lahko upočasni K-ATPaze predelek v parietalnih celicah z prepustnih omejitev v plazemsko membrano. Alternativno lahko ML 3000 predmet citoplazme metabolnih sprememb, ki omejujejo inhibitorno potentnost spojine. Slika 7 ML 3000 zavira kopičenje kisline v kunčjih celicah želodčne stene. (A) inhibicijo odmerka odvisen ML 3000 s (100 uM) kisline akumulacijo-histamina spodbudila zajcev želodca parietalnih celicah (IC50 = 40 um). (B) od odmerka odvisno inhibicijo ML 3000 s (100 uM) kisline akumulacijo-forskolin spodbudila zajcev celicah želodčne stene (IC50 = 45 pM). The-točke podatki kažejo srednjo ± S.E. iz štirih neodvisnih testih na vsakem od katerih je bila izmerjena kislino akumulacija v parietalnih celicah v dvojniku.
Končno, kot je bilo ugotovljeno z mikrosomskih H, K-ATPaze, druge NSAIDS kot acetilsalicilno kislino, naproksen in NS 398 (do koncentracije 10 -4 M) ni imela nobenega vpliva na kopičenje kisline, ki jo izoliranih zajec parietalnih celicah (podatki niso prikazani)
Učinki ML 3000 za IL-1β inducirane IL-8 izločanje v človeški adenokarcinomom želodca (AGS) celice
Pod osnovnih pogojih, AGS celice (5 x 10 4 v 100 ul gojišče) izloča IL-8 v obdobju 24 ur do koncentracije ~ 225 pg /ml medija. Ko zazna IL-1β (1 ng /ml), AGS celični IL-8 izločanja obdobju 24 ur je povečala ~ 27-krat, do koncentracije ~ 6000 pg /ml. ML 3000 zaviral tako izhodišče in IL-1β spodbujene IL-8 izločanje z IC 50-ih letih 0,46 uM (CI = 0,09-2,4 LM) in 1,1 uM (CI = 0,52-2,2 LM) v tem zaporedju (slika 8A in 8B ). Slika 8 Učinki ML 3000 za IL-1β inducirane IL-8 izločanja v celicah človeškega adenokarcinomom želodca (AGS). ML 3000 zaviral tako osnovo (A) in IL-1β spodbujene (B), IL-8 izločanje, s IC50s od 0,46 uM (CI = 0,09-2,4 LM) in 1,1 uM (CI = 0,52-2,2 um) oz. 5-lipoksigenaze specifični inhibitor ZD-2138 je pokazala, od odmerka odvisno inhibicijo izhodiščno AGS celic IL-8 izločanja (C), z IC50 58 nm (CI = 15,6 - 218 nm) in minimalen vpliv na AGS celic IL-1β -stimulated IL-8 izločanje (D). The-točke podatki kažejo srednjo ± S.E. iz treh neodvisnih preiskavah, v vsakem od katerih so bile izmerjene IL-8 koncentracije v treh izvodih.
5-lipoksigenaze specifičen inhibitor (ZD-2138), ki je bil brez učinka na mikrosomskih H, K-ATPaze dejavnost, je pokazala odmerek odzivno zaviranje izhodiščno AGS celic IL-8 izločanja (slika 8c), z IC 50 58 nM (CI = 15,6-218 nm). ZD-2138 je pokazala, minimalen vpliv na IL-1β stimulirane IL-8 izločanja, ki ga AGS celic (slika 8d). H, zaviranje K-ATPaze ML 3000, ki smo ga pokazali v tej študiji ne osnova za IL-8 inhibicijo sekretornih v tem modelu, ker imunocitokemija s H, K-ATPaze specifično monoklonsko protitelo ne kaže H, K-ATPaze izraz v AGS celicah (podatki niso prikazani).
Razprava
Ta študija vsebuje informacije o učinkih ML 3000 o vidikih želodca fiziologije, povezane z razjed. bile upoštevane tri eksperimentalni modeli funkcije želodca; visoko prečiščena funkcionalna H, K-ATPaze (protonske črpalke) izolirali iz želodčne sluznice klavnic Hogs, isolated zajec celicah želodčne stene in človeških adenokarcinomom želodca celic v kulturi. V prvem modelu ML 3000 zaviral protonske črpalke z IC 50 z dne 16.4 iM. Inhibitor protonske črpalke (PPI) omeprazol prikazana z IC 50 1,1 uM v istem poskusu. V nasprotju z zaviralci protonske črpalke, je ML 3000 inhibitorno aktivnost neodvisna od pH in je reverzibilna. Selektivni in neselektivna nesteroidna protivnetna zdravila ni pokazala H, K-ATPaze inhibitorno aktivnost v enakem testu. V drugem modelu ML 3000 zaviral tako histamina in kopičenje-forskolin spodbudila kisline (IC 50 = 40 in 45 um), v skladu z ML 3000 inhibicijo protonske črpalke. V tretjem modelu ML 3000 zaviral tako osnovo in IL-1β-stimulirane interlevkin-8 izločanje iz AGS celic (IC 50 = 0,46 in 1,1 uM zaporedju), čeprav se zdi, da ta učinek ni povezana s 5-lipoksigenaze inhibitorno aktivnost ML 3000 (slika 8D).
Objavljeno IC 50 za omeprazol v zvezi z želodčno protonske črpalke območju aktivnost od 470 nM do 36 uM, odvisno od pogojev testa [23-25]. Za druge IPČ, picoprazole IC 50 je 2 LM [26], rabeprazol IC 50 je 72 nM [23], in lansoprazol IC 50 je 2,1 pM [27]. Široka paleta objavljenega PPI IC 50 vrednosti za mikrosomskih H, K-ATPaze odraža sistematično nujnost spojine zakisljevanje, da se omogoči oblikovanje tiolne-reaktivni sulfoksida intermediat, ki nato nepovratno derivatizes H, K-ATPaze α podenote cisteinske ostanke, ki vodijo encimske inhibicije.
Ti ML 3000 podatki tudi močno razlikujejo omeprazol inhibicijo kopičenje kisline v izoliranih parietalnih celic. Acid sekretorni zmogljivosti IC 50 let (v izoliranih parietalnih celic) z zaviralci protonske črpalke (PPI), kot so omeprazol, rabeprazola in lansoprazola so v razponu od 59 nm do 360 nm [27, 28]. Večja moč IPC v okviru kisline sekretorni zmogljivosti v primerjavi z mikrosomski H, K-ATPaze (IC 50 let, od 72 nm do 40 um) kaže bolj popolno aktivacijo kisline IPČ v izoliranem parietalnih celic kanalčkov, kot se pojavlja v leta vitro mikrosomskih teste pri pH 6,1 ali več.
PGE 2 podatki so v nasprotju s prejšnjo raziskavo, v kateri 2 na prašičjega želodca H, k-ATPaze [29] so poročali ne zaviralni učinek PGE . Razlike v posebnem ATPaze testu, ki se uporablja v tej študiji, lahko predstavljajo to neskladje. Ker ML3000 in arahidonska kislina sta anionski amphiphiles, da bi njihove zaviralni učinki izhajajo iz specifičnih interakcij z H, K-ATPaze podenot veznih mest ali iz manj posebnih hidrofobne interakcije s H, K-ATPaze, povezanih mikrosomskih membranskih lipidov, ali kombinacija oba dejavnika.
reverzibilnosti ML 3000 zaviranjem aktivnosti H, K-ATPaze in vitro, je prikazano na sliki 2B, v nasprotju z nepovratnosti inhibicije H, K-ATPaze s substituiranimi benzimidazoli kot so omeprazol in lansoprazol.

• CD44 /CD24 Izražanje v ponavljajočimi raka želodca: retrospektiva analysis
• Razmerje med obroku sprememb srčne funkcije levega prekata, koncentracije glukoze in inzulina, praznjenje želodca in sitosti v zdravem subjects