Slopinimas, skrandžio H, K-ATPazės veiklos ir skrandžio epitelio ląstelių IL-8 sekrecijos į pyrrolizine išvestinių ML 3000

Slopinimas, skrandžio H, K-ATPazės veiklos ir skrandžio epitelio ląstelių IL-8 sekrecija iš pyrrolizine išvestinių ML 3000
tezės
Background pervežimas ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-chlorfenil ) -7-fenil-2,3-dihidro-1H-pyrrolizine-5-il] -acto rūgštis) yra tiek ciklooksigenazės ir 5-lipoksigenazės inhibitorius in vitro, ir rodo pažadas kaip naują nesteroidinio priešuždegiminio vaisto (NVNU). Skirtingai nuo įprastų NVNU, kurie yra susiję su skrandžio opas poveikio ML 3000 sukelia mažai arba jokios žalos skrandžio gleivinę, nors ji žymiai mažina skrandžio prostaglandinų sintezę.
Metodai
Kaip dalis stengiantis išsiaiškinti mechanizmus, sukeliančius skrandžio kalį organizme sulaikančių savybių ML 3000, mes studijavo ML 3000 poveikį H, K-ATPazės aktyvumas in vitro, nuo rūgšties kaupimosi izoliuotų skrandžio pakauškaulio ląstelių, ir IL-8 sekrecija skrandžio epitelinių ląstelių kultūroje.
rezultatai
SCH28080 jautrus H, K-ATPazės veikla labai išgrynintas kiaulių skrandžio mikrosomų buvo priklausomai nuo dozės slopina ML 3000 (IC 50 = 16,4 mikromolių). Slopinimas buvo grįžtamas ir nejautrus ML 3000 rūgštėjimą pH 2.0-8.0. Be triušių skrandžio pakauškaulio ląsteles,
ML 3000 priklausomai nuo dozės slopino histamino-skatino rūgšties susikaupimo (SSD 50 = 40 mkm) ir forskolinas stimuliuojama rūgšties susikaupimo (SSD 50 = 45 mkm). Galiausiai, žmogaus skrandžio adenokarcinoma (AGS) ląstelėse, ML 3000 priklausomai nuo dozės slopina tiek pradinis ir IL-1β-stimuliuojama (20 ng /ml) IL-8 sekrecijos su IC 50s 0,46 mikronų, o 1.1 mikromolių atitinkamai.
Išvada Viesbutis The duomenys rodo, kad ML 3000 paveikia rūgšties sekrecijos mechanizmų pasroviui cAMP mobilizacijos sukeltas histamino H 2 receptorių aktyvinimo, kad ji tiesiogiai slopina H, K-ATPazės konkrečią veiklą ir kad pradinis skrandžio epitelio ląstelių IL-8 sekrecijos slopinimo gali būti susijęs su ML 3000 slopinimo 5-lipoksigenazės veiklos. Galime daryti išvadą, kad šie skrandžio funkcija slopinantis duomenys gali grindžiamos skrandžio organizme sulaikančius savybes ML 3000. pervežimas Background
farmakologinės savybės nesteroidiniais priešuždegiminiais vaistais (NVNU), kyla iš jų slopinimo prostaglandinų sintezę iš arachidono rūgšties [1] , Slopinimas skrandžio prostaglandinų sintezės vis dėlto lydi sumažėjęs skrandžio gleivinės kraujotaką, kartu su: gleivinės jautrumas vietinio poveikio žalos iš dirgiklių įvairovė [2]. Daug žadanti farmakologinis strategija, siekiant išvengti skrandžio komplikacijomis nesteroidiniais vaistais nuo uždegimo dėmesys skiriamas vienu metu ciklooksigenazės ir 5-lipoksigenazės slopinimas, su slopina leukotrieno sintezę tikslo. 5-lipoksigenazę konvertuoja arachidono rūgšties leukotrienai, tarp kurių leukotrienų B4 lankosi chemotaktinis leukocitų ir taip prisideda prie uždegiminių mechanizmų, dėl kurių virškinimo trakto opų [3]. Pyrrolizine darinys ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-chlorophen-il) -7-fenil-2,3-dihidro-1H-pyrrolizine-5-il] -acto rūgštis) yra abiejų jų inhibitorius ciklooksigenazę ir 5-lipoksigenazę in vitro [4, 5], ir rodo žada kaip romano NVNU. ML 3000 sumažina skrandžio prostaglandinų E2 sintezę žiurkių skrandžio ir kraujo, nors reikšminga slopinimas skrandžio arba kraujas leukotrienų B4 sintezės nebuvo aptikta [6]. Svarbiausia, kad ML 3000 neturi įtakos leukocitų laikytis per žarnų pasaito venulių poveikį ir nesukelia skrandžio gleivinės pažaidų [6].
Gyvūnų modelių, ML 3000 buvo nustatyta, kad farmakologiškai gerybiniai. Taigi, šis junginys neturėjo įtakos žiurkių judėjimo aktyvumo ar hexobarbital sukeltos miego, neturėjo širdies ir kraujagyslių arba kvėpavimo poveikį žiurkėms ir šunims, buvo be įtakos nervų ir raumenų funkciją katėms ir sukelia nei skrandžio žalos nei peristaltiniu sutrikimams [7]. ML 3000 sukėlė silpną somatinė atsakymą Bisau kiaulių klubinės žarnos ir sukelia nedidelį trumpalaikį sumažinti šlapimo išsiskyrimas žiurkių [7]. Genotoksiškumo tyrimai rodo, kad ML 3000 neturi poveikio genų mutacijų dažniai bakterijų ar žinduolių ląstelių DNR sintezei, arba dažnumas chromosomų aberacijas žiurkių kaulų čiulpų ląstelių [8]. 14C žymėto ML 3000 paskirstymo ir išsiskiria su Tyrimai su žiurkėmis rodo enterohepatinę cirkuliaciją ir jo gliukuronintų konjugacija ML 3000 [9].
Farmakologines ML 3000, kaip mokėsi gyvūnų modelių rodo priešuždegiminiu, skausmą, antipiretines, antiasthmatic, ir antiaggregative veikla dozėmis, kad sukelia jokių skrandžio žalą [4, 10]. Ūmus ir lėtinis priešuždegiminių savybių ML 3000 studijavo pagalbinį sukeltos žiurkės letena edema modelį [11] rodo, kad nors indometacino yra šiek tiek stipresnis kaip priešuždegiminis agentas, ne skrandžio žala buvo pastebėta su ML 3000 iki 100 mg /kg kūno svorio /d PO, kadangi opas dozės (UD 50), skirtą indometacino buvo 7 mg /kg kūno svorio /d PO
Skrandžio opų, sukeltos NVNU žymiai apriboja šių vaistų naudingumas. Akivaizdu, kad anti-uždegiminių ir skrandžio sulaikantys savybių eksponuojami ML 3000 derinys daro šis junginys patrauklus kandidatas toliau studijuoti. Du skrandžio gleivinės funkcijos, kurios vaidina svarbų vaidmenį skrandžio opų yra rūgšties sekreciją ir interleukino-8 sekreciją. Rūgščių sekrecinių inhibitoriai yra viena iš labiausiai labai skiriami vaistai, atspindintis fiziologinį posakiu "Nr rūgštį, ne opa". Farmakologinio arba patofiziologinis pažeisdamas skrandžio gleivinės kliūčių atsargines sklaidą HCl veda prie greito erozijos skrandžio epitelio monosluoksnio ir dėl to opų gleivinės. Rūgšties sekrecijos slopinimo tuo Išorinis ląstelių histamino H2 receptorių (cimetidinas), arba tiesiogiai kovalentinis derivatizaciją ir nukenksminimo skrandžio protonų siurblio (omeprazolu, lansoprazolo, rabeprazolo, ezomeprazolu ir tt) iki antagonizmas yra rutina Melioracija ir skatinimo gijimą skrandžio opos. Taigi, skrandžio organizme nesulaikantys poveikis ML 3000, gali būti susiję su rūgšties sekrecijos slopinimu junginio.
Papildomą skrandžio lokalaus poveikio ML 3000 gali būti moduliaciją skrandžio sekrecijos pro-uždegiminių citokino IL-8. Aspirinas sukelta skrandžio žala buvo pranešta, kad būti susijęs su padidėjusia antralinių gamybos IL-8 [12]. Opas bakterija Helicobacter pylori
buvo įrodyta, kad padidinti greitį ir amplitudę IL-8 sekrecijos tiek in vitro ir in vivo [13-15], ir iki-reguliuoti IL-8 genų ekspresiją [16]. Panašūs IL-8 prosecretory poveikis vertinamas kaip IL-1β stimuliacijos skrandžio epitelio ląstelėmis. Palyginimas iš ML 3000 ir kitų nesteroidinių vaistų nuo uždegimo dėl šių skrandžio sekrecijos veiklą poveikis gali išsiaiškinti mechanizmą, pagal kurį ML 3000 apsaugo nuo skrandžio gleivinės pažeidimų išsidėstymą.
Siekiant išsiaiškinti mechanizmus, sukeliančius skrandžio sulaikantys savybės ML 3000, mes tyrė ML 3000 efektą dviem skrandžio gleivinės sekrecijos funkcijų su vaidmenų opų: sekrecijos druskos rūgšties ir sekrecijos į uždegimo citokinų interleukino-8. Mūsų duomenys rodo, kad ML 3000 slopina kiaulių skrandžio mikrosomų H, K-ATPazės aktyvumą, slopina histamino-skatino rūgštėjimą triušių skrandžio pakauškaulio ląstelių, ir slopina IL-1β stimuliuojama IL-8 sekreciją žmogaus skrandžio epitelinių ląstelių.
Metodai
Reagentai
ML 3000 ir ZD-2138 buvo numatyta miško Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazolo buvo pateikta AstraZeneca R & D Molndal, Švedija, SCH 28080 buvo iš Schering-Plough tyrimų institutas, Kenilworth, NJ, TEDBC atėjo iš Tocris Cookson, Inc. Ballwin, MO, o NS 398 atvyko iš Kaimanų Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arachidono rūgšties, indometacino, acetilsalicilo rūgšties, naproksenas, PGE 2, leukotrienai B4 ir D4, ir IL-1β visi buvo įsigytas iš Sigma-Aldrich Corp, St Louis, MO. Dimetilsulfoksido (Sigma-Aldrich) buvo naudojamas tirpinti ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, ir indometacino. Acetilsalicilo rūgšties ir naprokseno buvo ištirpinta ATPazės buferis, dietanolaminas (Vide Infra
). Arachidono rūgštis ir PGE 2 buvo ištirpinta absoliučiame etanolyje, ir omeprazolo buvo ištirpinta metanolyje. Leukotrienai B4 ir D4 buvo tiekiami ištirpinti 70:30 mišinio metanolio ir 17 mM amonio acetato. IL-1β buvo ištirpintas tirpalo fosfato buferio druskų tirpalu (pH 7,4), 0,1% m /v jaučio serumo albuminas. Visi tyrimai atliekami naudojant šiuos junginius įtraukti tinkamą tirpiklį, kontrolę, ir visi tirpikliai buvo koncentracijos yra mažiau nei 1% w /v galutiniame bandymo mišinio.
Parengiamosios iš H, K-ATPazės
Mikrosomų skrandžio H, K-ATPazės buvo parengta iš kiaulių skrandžio gleivinės homogenatai skirtumą ir sacharozės /Ficoll žingsnis gradiento centrifuguojant, kaip aprašyta anksčiau [17]. Šis preparatas duoda gana sunkus (7% Ficoll /1,1 m sacharozės sąsajos) GII mikrosomų frakcija, kuri neparodė K ATPazės veiklos vėlavimą, ir kurios sudaro ~ 90% H, K-ATPazės, remiantis densitometrija dėl 94 kDa juosta SDS-PAGE analizės. GII mikrosomų buvo laikomi -80 ° C 20% glicerolio.
H, K-ATPazės Analizės
ATF hidrolizės veikla Kiaulių skrandžio mikrosomų buvo kiekybiškai kaip ortofosfatu atleidimo nuo substrato ATP naudojant spalviniu žaliojo malachito procedūrą [18] , ATFazės tyrimai-gerai 96 mikrolėkštelės buvo atlikti. Trumpai tariant, 100 mikrol /gerai tyrimas buferis (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mm MgCl 2, 1 mM EGTA, ± 7.5 mm KCl, ± 50 mkm SCH28080), kurio 80 ng mikrosomų H, K-ATPazės ML 3000 (10 -9 M 10 -4 M) arba kitų junginių, ir 1 mM ATP buvo inkubuojami 30 min 37 ° C temperatūroje. Fermentinis veikla buvo sustabdyta pridedant (45 iL /gerai) ir kolorimetrinę reagento (0.07% žaliojo malachito, 3,7 "NH 2SO tirpale 4, 2,27% amonio molibdatas tetrahidratas, 0,134% Tween-20). Po 10 sekundžių, spalvinė reakcija buvo sukurtas to (45 mikrol /gerai) 15% natrio citrato. Po 45 min kambario temperatūroje, absorbcija ties 570 nm šulinių buvo matuojamas mikroplokštelių skaitytojui.
Matuoti ML 3000 rūgštėjimo poveikį ATPazės slopinimo ML 3000 mėginiai (10 mm 5 mm Tris-HCl) buvo didinama iki pH reikšmių, svyruoja nuo 2,0 iki 7,4 30 min. Skrandžio mikrosomų suspenduotos standartinio ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4 buvo inkubuojami 30 min su parūgštinto alkivotos ML 3000 (16,6 mkm galutinis ML 3000 koncentracijos) ir tada ATPazės aktyvumas buvo matuojamas kaip aprašyta aukščiau. Matuoti omeprazolo slopinimą, yra H, K-ATPazės veiklos, skrandžio mikrosomų suspenduotos ATPazės bandymo buferis, kurio pH 6,1 buvo inkubuojami 30 min su įvairių koncentracijų omeprazolio. Omeprazolis rūgštinimas iki pH 6.1 buvo būtina, kad susidarytų slopinančio tiolio-reaktyvus sulfoksido tarpinio [19]. tada skrandžio mikrosomų buvo perkelti į standartinę ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4, ir ATPazės aktyvumas buvo matuojamas kaip aprašyta aukščiau. Konkretus H, K-ATPazės veikla buvo apskaičiuota kaip į mikrosomų ATPazės veiklą skirtumas, esant arba nesant konkretaus grįžtamojo skrandžio H, K-ATPazės inhibitorius SCH28080 ir buvo išreikštas μmoles p i /mg baltymo /val. H, K-ATPazės veikla šviežiai paruošti kiaulių skrandžio mikrosomų svyravo nuo 140 iki 170 μmoles P I /mg baltymo /val. Grafinis vaizdavimas duomenų rodo proc slopina H, K-ATPazės veiklą kaip kombinuotųjų koncentracijos funkcija.
Pirminis ląstelių paruošimo
Skrandžio parietalinės ląstelės buvo izoliuotas nuo Naujosios Zelandijos baltųjų triušių iki pronase /kolagenazės virškinimo fundic gleivinės po iki praturtėjimo ląstelių ir nenuolatinio Nycodenz gradientų, kaip aprašyta anksčiau [20]. Pakauškaulio ląstelių preparatai pateikta maždaug 10 7 ląstelių /skrandžio, iš kurių 80 ± 5% buvo parietalinės ląstelės remiantis imunocitocheminiais su H, K-ATPazės-specialusis monokloninis antikūnas.
Rūgšties susikaupimo prabavimo
Aminopyrine kaupimo į Parietal ląstelės buvo įvertintas 96 bei filtrų plokštės su Durapore membranas, kaip aprašyta anksčiau [21]. Trumpai tariant, ląstelės buvo iš anksto inkubuojamas su [ 14C] -aminopyrine ir tada 100.000 ląstelių /200 mikrol už šulinio buvo inkubuojami su ar be bandymo junginių likus 15 minučių iki inkubacijos dar 30 min nesant ar esant 100 mkm histamino arba 100 mkm forskolinas. Visi matavimai buvo atliekami keturiais egzemplioriais. Bazinis aminopyrine kaupimas buvo nustatyta kaip aminopyrine kaupimo į neapdorotų ląstelių atimama iš sankaupa KSCN akivaizdoje (iš nespecifinio izotopo gaudymas spąstais refleksijos). Grafinis vaizdavimas duomenų rodo proc slopinamas histamino skatino rūgšties kaupimosi Iki ląstelių kaip kombinuotųjų koncentracijos funkcija.
Skrandžio adenokarcinoma Ląstelės
žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių (AGS ląsteles, ATCC BEL 1739), buvo prižiūrimi AGS terpė (Ham "F-12, 10% vaisiaus jaučio serumo, 100 vienetų /ml penicilino G, 0,25 ug /ml amfotericino B, 100 ug /ml streptomicino) 37 ° C temperatūroje, 5% CO 2/95% oro inkubatorius ir naudojamas tarp ištraukas 42 ir 56. tyrimų IL-8 sekrecijos, AGS ląstelės buvo padengtą į 96-duobučių lėkštelėse (50000 ląstelių /100 mikrol /duobutėje) ir leidžiama pridėti 18 val 37 ° C temperatūroje 5% CO 2/95% oro. tada ląstelės buvo inkubuojamos su bandymo junginių, esant arba nesant IL-1β už 24 val ir tuo metu mėginiai terpėje buvo pašalinta iš šulinėlių ir saugomi -70 ° C temperatūroje. IL-8 koncentracijos mėginių buvo nustatomas pagal imunofermentine tyrime (žmogaus IL-8 Duo-Set ELISA kūrimo sistema, R & D Systems Inc, Mineapolis, MN). Grafinis vaizdavimas duomenų rodo proc slopina Nestimuliuotų arba stimuliuojama IL-8 sekrecijos kaip kombinuotųjų koncentracijos funkcija
statistinė analizė
Visi eksperimentai buvo atliekami ne rečiau kaip tris kartus.; duomenų taškų kiekvienam tyrimui atstovauti matavimo priemones iš trijų dalių mėginiuose. Duomenų taškai montavimo trijų parametrų logistikos lygtį buvo grafika kaip sigmoidal dozė ir atsako kreivių naudojant prizmę statistinį paketą (GraphPad Software, Inc., San Diegas, CA). Half-didžiausias slopinimas koncentracijos (SSD 50) ir IC 50 95% pasikliautinieji intervalai (PI), taip pat buvo apskaičiuotas naudojant prizmę. Duomenų taškai ne montavimo trijų parametrų logistikos buvo parengtos kaip paprastas taškas-taškas kreivė. Standartinė paklaida buvo dispersinė priemonė naudojama klaidų barų grafinis duomenų
rezultatai
poveikio ML 3000 apie H, K-ATPazės veiklos
Skrandžio H, K-ATPazės veikla buvo priklausomai nuo dozės slopino ML 3000, su pusiau maksimalus inhibitorių koncentracija (SSD 50) 16,4 mikrometrai (PI = 6,84-39,3 mkm) (1A pav.) Slopinantis aktyvumas ML 3000 buvo palyginti su klasikiniu protonų siurblio inhibitorių (PSI), pakeisto benzimidazolas omeprazolo. 1b paveiksle parodytas omeprazolio apie H, K-ATPazės veiklos pagal bandymo sąlygoms, tapačias 1A pav poveikį; apskaičiuota SSD 50 omeprazolio buvo 1,7 mikrometrai (CI = 0,26 - 11,3 mikronų). Šie duomenys rodo, kad ML 3000 yra žymiai silpniau negu omeprazolis, susijusių su skrandžio H, K-ATPazės slopinantį aktyvumą,, bent jau šio konkretaus in vitro tyrimą nustatymo pagal nurodytomis sąlygomis. Norėdami nustatyti, ar ML 3000 rodomas palyginamus rūgšties aktyvacijos savybes, per pusę maksimalus slopinantis koncentracija ML 3000 buvo titruojama iki kitu PPM, o ant H, K-ATPazės veiklos poveikis buvo matuojamas. Kaip parodyta 2A pav, rūgštėjimas ML 3000 neturėjo esminės įtakos jo H, K-ATPazės slopinančio profilio. Šie duomenys rodo, kad ML 3000, priešingai nei omeprazolis, nereikalauja rūgštėjimą indukcijai slopina. Atsižvelgiant į tai, kad PSI yra negrįžtamas inhibitoriai H, K-ATPazės veiklos, kovalentiškai jungiasi prie katalizinio alfa subvieneto, siekėme nustatyti, ar ML 3000 slopinimas H, K-ATPazės buvo grįžtamas arba negrįžtamas. Skrandžio H, K-ATPazės-praturtintas mikrosomų buvo gydomi maksimaliai-slopinančio koncentracijos ML 3000 ir po to atskiesti su dideliu viršija buferinio tirpalo, kad sumažinti ML 3000 koncentracija yra nuo 100 m iki 3.3 pM. Rezultatai, parodyta 2B pav nurodė, kad skiesti ML 3000 atkurta H, K-ATPazės aktyvumo ir yra suderinamas su ML 3000 slopina H, K-ATPazės veikla grįžtamojo būdu, ty., ML 3000 nėra kovalentiškai derivatize arba subvienetas skrandžio H, K-ATPazės, bent jau pagal dabartinio in vitro tyrimą iš H, K-ATPazės veiklos sąlygų. Šiuo atžvilgiu, ML 3000 yra kinetiškai panašus į SCH28080, konkretaus laikinai slopina skrandžio H, K-ATPazės. 1 pav dozės priklausomas iš H, K-ATPazės veiklos pagal ML 3000 (A) ir pagal omeprazolio (B). (A). Skrandžio mikrosomų suspenduotos ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4 buvo inkubuojami 30 min su įvairiomis koncentracijomis mililitrų 3000 ir ATPazės aktyvumo tada buvo matuojamas, esant pH 7,4. Pusinės eliminacijos maksimalus slopinanti koncentracija (IC50) ML 3000 buvo 16,4 mkm (PI = 6,84-39,3 mkm). (B). Skrandžio mikrosomų suspenduotos ATPazės bandymo buferis, kurio pH 6.1 buvo inkubuojami 30 min su įvairiomis koncentracijomis omeprazolio, ir tada perkelti į standartines ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4 už ATPazės veiklos matavimo. Dėl omeprazolo IC50 buvo 1,1 mikrometrai (CI = 0,26 - 11,3 mikronų). Duomenų taškai rodo vidurkis ± Fondų biržoje iš trijų nepriklausomų tyrimų į kiekvieną iš kurių SCH28080-jautrus ATPazės aktyvumas buvo matuojamas tris kartus.
2 paveikslas poveikis ML 3000 parūgštinant dėl ​​H, K-ATPazės aktyvumo (A), ir ML 3000 slopinimas H, K-ATPazės veiklos yra grįžtamas (B). (A), ML 3000 mėginiai (10 mM 5 mM Tris-HCl) buvo didinama iki pH reikšmių, svyruoja nuo 2,0 iki 7,4 30 min prieš pridedant į standartinę ATPazės buferis, dietanolaminas (pH 7,4), kurių sudėtyje yra skrandžio mikrosomas. (B) Skrandžio mikrosomų buvo gydomi maksimaliai slopinantis koncentracijos (100 mikromolių), iš ML 3000. mikrosominio pakaba buvo tada atskiesti dideliu viršija buferio sumažinti ML 3000 koncentracija nuo 100 m iki 3.3 mikromolių. Tiek (A) ir (B), duomenų taškai rodo vidurkis ± Fondų biržoje iš trijų nepriklausomų tyrimų, į kurių kiekvieną SCH28080 jautrus ATPazės aktyvumas buvo matuojamas trimis egzemplioriais.
arachidono rūgšties ir prostaglandinų E 2 (PGE 2) taip pat priklausomai nuo dozės slopina H, K-ATPazės veiklą, su SSD 50 16,7 mikrometrai (PI = 8,9-31,5 mkm) ir 15 mikrometrai (PI = 3,96-57,3 mikronų) atitinkamai (3A pav ir 3B). Nuo ML 3000 taip pat rodo, 5-lipoksigenazės slopinimas, mes studijavo dvejus lipoksigenazės inhibitorių apie mikrosominiu H, K-ATPazės veiklos poveikį. 4a paveikslas rodo, kad 2- (1-tienil) etil 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), galingas inhibitorius 5-, 12-, ir 15-lipoxygenses, slopinamas mikrosominio H, K-ATPazės veikla su IC 50 iš 22,6 mikrometrai (PI = 6,3-81,2 mkm). Priešingai, 5-lipoksigenazės-specifinis inhibitorius 6 - ((3-fluoro-5- (metoksi-3,4,5,6-tetrahidro-2H-piran-4-il) fenoksi) metil) chinolin (ZD-2138 ) turėjo minimalų poveikį H, K-ATPazės veikla (~ 20% slopinimas 10 -5 M) (4B paveiksle). Šie duomenys sutampa su skrandžio mikrosomų 12- ir 15-lipoxygenases vaidina vaidmenį H, K-ATPazės aktyvavimo, arba su tiesiogine sąveika su TEDBC su H, K-ATFazės subvienetų keičiant fermento raumeningumo ir todėl veiklą. Aišku, abu aiškinimai provokuojantis ir nusipelno tolesnio tyrimo. 3 pav slopinimas iš H, K-ATPazės veikla, kurią arachidono rūgšties (A) ir prostaglandinų E 2 (B). Skrandžio mikrosomų suspenduotos ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4 buvo inkubuojami 30 min su įvairiomis koncentracijomis arachidono rūgšties arba PGE2 ir ATPazės aktyvumo tada buvo matuojamas, esant pH 7,4. IC50 arachidono rūgšties buvo 16,7 mikrometrai (PI = 8,9-31,5 mkm) ir už PGE2 IC50 buvo 15 mikrometrai (PI = 3,96-57,3 mikronų). Duomenų taškai rodo vidurkis ± Fondų biržoje iš trijų nepriklausomų tyrimų į kiekvieną iš kurių SCH28080-jautrus ATPazės aktyvumas buvo matuojamas tris kartus.
pav slopinant 4 iš H, K-ATPazės veiklos pagal 5-, 12-, ir 15-lipoksigenazės inhibitoriaus TEDBC (A), ir 5-lipoksigenazės inhibitorius ZD-2138 (B). Skrandžio mikrosomų suspenduotos ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4 buvo inkubuojami 30 min su įvairaus koncentracijos TEDBC arba ZD-2138 ir ATPazės aktyvumo tada buvo matuojamas, esant pH 7,4. (A) duomenų taškai rodo vidutinį SCH28080-jautrią ATPazės veikla matuojama tris kartus vienoje iš trijų nepriklausomų tyrimų; tipiniai duomenys rodomi. Į duomenų taškų (b) nurodoma, vidurkis ± Fondų biržoje iš trijų nepriklausomų tyrimų į kiekvieną iš kurių SCH28080-jautrus ATPazės aktyvumas buvo matuojamas tris kartus.
Siekiant palyginti H, K-ATPazės slopinamąjį poveikį ML 3000 su kitais NVNU, mes matuojamas acetiletiltetrametiltetraliną salicilo rūgšties, NS poveikį 398, naproksenas, ir indometacino nuo protonų siurblio veikla. Visi keturi NVNU buvo be slopinamąjį poveikį mikrosominiu H, K-ATPazės veiklos koncentracija iki 10 -4 M (10 -3 M acetilsalicilo rūgšties) (5a paveiksle, 5B, 5C ir 5D). Indometacino buvo pranešta anksčiau, slopina skrandžio H, K-ATPazės ne šiek tiek didesnės koncentracijos (K i = 0,67 × 10 -3 m) [22]. Mūsų duomenys aiškiai atskirti ML 3000 iš kitų NVNU, kalbant apie slopinamasis poveikis skrandžio H, K-ATPazės veikla; Mechanistinis pagrindas šio skirtumo, ir galimą koreliaciją su pastebėtas skrandžio sulaikančių turto ML 3000, dar turi būti ištirta. 5 paveikslas poveikis acetilsalicilo rūgšties, NS 398, naproksenas, ir indometacino ant H, K-ATPazės veikla. Skrandžio mikrosomų suspenduotos ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4 buvo inkubuojami 30 min su įvairiomis koncentracijomis acetilo salicilo rūgšties, NS 398, naprokseno, arba indometacino ir ATPazės aktyvumo tada buvo matuojamas, esant pH 7,4. Duomenų taškai rodo vidutinį SCH28080-jautrią ATPazės veikla matuojama tris kartus vienoje iš trijų nepriklausomų tyrimų; tipiniai duomenys parodė, kiekvienu atveju.
Galiausiai, siekiant nustatyti, ar ML 3000 slopinimas skrandžio H, K-ATPazės rodo junginio poveikį tariamų funkcinių leukotrienų medžiagų apykaitos esančių kiaulių skrandžio mikrosomų, mes studijavo poveikį leukotrienų B4 ir D4 ant H, K-ATPazės veikla. Tirpumas klausimai neleidžiama studijuoti LTB4 arba LTD4 koncentracija yra didesnė kaip 1 mkm. Kaip parodyta 6a ir 6b pav, nei leukotrienų parodė jokios slopina nuo H, K-ATPazės ne fiziologinių koncentracijos (10 -9-10 -8 M); tik ne fiziologinių koncentracija didesnė kaip 10 -7 M ten buvo koks nors reikšmingas slopinimas H, K-ATPazės veikla. 6 pav poveikis leukotrienų B4 ir D4 ant SCH28080 jautraus H, K-ATPazės konkrečios veiklos. Skrandžio mikrosomų suspenduotos ATPazės buferis, dietanolaminas, esant pH 7,4 buvo inkubuojami 30 min su įvairių koncentracijų leukotrienų B4 arba leukotrieno D4 ir ATPazės aktyvumo tada buvo matuojamas, esant pH 7,4. Duomenų taškai rodo vidurkis ± Fondų biržoje iš trijų nepriklausomų tyrimų, į kurių kiekvieną SCH28080 jautrus ATPazės aktyvumas buvo matuojamas trimis egzemplioriais.
effects ML 3000 skrandžio Išorinis ląstelių histamino skatino rūgšties kaupimosi
ML 3000 priklausomai nuo dozės slopino histamino-stimuliuojama (100 mkm) rūgšties susikaupimo triušio skrandžio pakauškaulio ląstelių, su pusiau maksimalus inhibitorių koncentracija (SSD 50) 40 mkm (7a pav.) ML 3000, taip pat priklausomai nuo dozės slopina forskolin stimuliuojama (100 mkm) rūgšties kaupimosi triušio skrandžio pakauškaulio ląstelių, su IC 50 ~ 45 mkm (7b pav.) Šie duomenys rodo, kad ML 3000 paveikia Išorinis mobiliuosius rūgščių-sekrecijos mechanizmų pasroviui cAMP mobilizacijos sukeltos histamino H 2 receptorių aktyvinimo. Duomenys atitinka ML 3000 slopinimu Išorinis ląstelių rūgšties sekrecijos atsiradusios tiesiogiai sąveikaujant ML 3000 su skrandžio H, K-ATPazės. Tačiau tarp ML 3000 IC 50 discepancy į mikrosomų pūslelių (15 mkm) ir pavieniais pakauškaulio ląstelių (40-45 mikronų) teigia, kad ML 3000 prieiga prie ląstelėje H, K-ATPazės skyrius per pakauškaulio ląstelių gali būti pristabdytas iki pralaidumo suvaržymų plazminės membranos. Arba ML 3000, gali būti taikomos citoplazmos apykaitos pakeitimų, kurie riboja slopinančio potenciją junginio. 7 pav ML 3000, slopina rūgšties kaupimąsi triušių skrandžio pakauškaulio ląsteles. (A), Dozė priklauso nuo slopinimo ML 3000 histamino stimuliuojama (100 mikromolių) rūgšties kaupimosi triušio skrandžio pakauškaulio ląstelių (IC50 = 40 mkm). (B), dozės priklausomas slopinimo ML 3000 forskolin stimuliuojama (100 mikromolių) rūgšties kaupimosi triušio skrandžio pakauškaulio ląstelių (IC50 = 45 mikromolių). Duomenų taškai rodo vidurkis ± Fondų biržoje iš keturių nepriklausomų tyrimų į kiekvieną iš kurių rūgšties susikaupimo į parietalinėse ląstelėse buvo matuojamas du kartus.
Galiausiai, kaip buvo nustatyta, su mikrosominiu H, K-ATPazės kitų nesteroidinių priešuždegiminių vaistų, pavyzdžiui, acetilsalicilo rūgšties, naprokseno, ir NS 398 (iki koncentracija 10 -4 M), neturėjo rūgšties kaupimosi efektą izoliuotų triušių pakauškaulio ląstelių (duomenys nerodomas)
poveikis ML 3000 apie IL-1β sukeltos IL-8 sekrecijos žmogaus skrandžio adenokarcinoma (AGS) ląstelės
bazinėmis sąlygomis, AGS ląsteles (5 × 10 4 100 mikrol kultūros terpė) išsiskiria IL-8 per 24 val laikotarpį iki ~ 225 pg /ml terpės koncentracija. Kai stimuliuojama IL-1β (1 ng /ml), AGS ląstelių IL-8 sekrecijos per 24 val laikotarpį buvo padidintas ~ 27 kartų, kad, atsižvelgiant ~ 6000 pg /ml koncentracijos. ML 3000 slopino ir pradinis lygis ir IL-1β stimuliuojama IL-8 sekrecija, IC 50s 0,46 mikrometrai (CI = 0,09 - 2,4 mkm) ir 1,1 mikrometrai (CI 0,52 - 2,2 mkm) atitinkamai (pav 8A ir 8B ). 8 pav poveikis ML 3000 apie IL-1β sukeltos IL-8 sekrecijos žmogaus skrandžio adenokarcinoma (AGS) ląsteles. ML 3000 slopino ir bazinį (A) ir IL-1β stimuliuojama (B) IL-8 sekrecija, IC50s 0,46 mikrometrai (CI = 0,09 - 2,4 mkm) ir 1,1 mikrometrai (CI 0,52 - 2,2 mkm) atitinkamai. 5-lipoksigenazę konkrečių inhibitorius ZD-2138 parodė, dozės priklausomas nuo pradinės AGS ląstelių IL-8 sekrecijos (C), su 58 nM IC50 (PI = 15,6 - 218 nm) ir minimaliu poveikiu AGS ląstelių IL-1β -stimulated IL-8 sekrecijos (D). Duomenų taškai rodo vidurkis ± Fondų biržoje iš trijų nepriklausomų tyrimų į kiekvieną iš kurių IL-8 koncentracija buvo matuojamas tris kartus,.
5-lipoksigenazės-konkrečią inhibitorių (ZD-2138), kuris buvo be poveikio mikrosominiu H, K-ATPazės veikla, parodė dozė-reaguoja slopinimas pradinis AGS ląstelių IL-8 sekrecijos (8c pav), su IC 50 58 nm (CI = 15,6-218 nm). ZD-2138 parodė minimalų poveikį IL-1β stimuliuojamos IL-8 išsiskyrimą, AGS ląstelių (8d pav). H, K-ATPazės slopinimo ML 3000, kuri mes parodėme šiame tyrime nėra grindžiami IL-8 sekrecijos slopinimas šiame modelyje, nes imunocitocheminiais su H, K-ATPazės-specialusis monokloninis antikūnas nerodo H, K-ATPazės išraiška į AGS ląstelių (duomenys neparodyti).
Diskusijos
Šis tyrimas suteikia informacijos apie ML 3000 poveikiu aspektų skrandžio fiziologija susijusių opų. Buvo išnagrinėtos trys eksperimentiniai modeliai skrandžio funkciją; labai išvalytas funkcinis H, K-ATPazės (protonų siurblio) izoliuota nuo skrandžio gleivinę, pagal skerdyklos paršiukų, izoliuotų triušių skrandžio parietalinių ląstelių, ir žmogaus skrandžio adenokarcinoma ląstelių kultūros. Pirmoje modelį, ML 3000 slopina protonų siurblio su IC 50 16,4 mikromolių. Tuo, kad protonų siurblio inhibitoriumi (PSI) omeprazolis rodomas IC 50 1,1 pM toje pačioje tyrimu. Skirtingai PSI ML 3000 slopinantis aktyvumas buvo nepriklausoma nuo pH ir buvo grįžtamas. Selektyvūs ir neselektyvių NSAID neparodė H, K-ATPazės slopinantį aktyvumą, toje pačioje tyrimu. Per antrąjį modelį ML 3000 slopino ir histaminą ir forskolin stimuliuojama rūgšties susikaupimo (SSD 50 = 40 ir 45 mikronų), atitinkantis ML 3000 protonų siurblio slopinimo. Pagal trečiąjį modelį ML 3000 slopino ir pradinis lygis ir IL-1β stimuliuojama interleukino-8 sekreciją iš AGS ląstelių (IC 50 = 0,46 ir 1,1 mkm atitinkamai), nors pastarasis efektas pasirodo nesusiję su 5-lipoksigenazės slopina iš ML 3000 (8d pav).
Leidimo IC 50 omeprazolio, susijusių su skrandžio protonų siurblio veiklos intervale nuo 470 nM iki 36 mikromolių priklausomai nuo tyrimo metodo [23-25] sąlygomis. Dėl kitų PSI, picoprazole SSD 50 yra 2 mkm [26], rabeprazolo IC 50 yra 72 nM [23], o lansoprazolo SSD 50 yra 2,1 mkm [27]. Platus paskelbtas PPI IC 50 vertės mikrosominiu H, K-ATPazės atspindi mechaniškai būtinumą junginio rūgštėjimo leisti formavimas tiolio reaktyvusis sulfoksido tarpinė, kuri tada negrįžtamai derivatizes H, K-ATFazės α subvieneto cisteino liekanų pirmaujančių fermentų slopinimas.
Šie ML 3000 duomenys taip pat kontrastuoja dramatiškai kartu su omeprazolu slopinimu rūgšties kaupimosi izoliuotų pakauškaulio ląsteles. Rūgščių sekrecijos talpa IC 50s (izoliuotuose pakauškaulio ląstelių) iš protonų siurblio inhibitorių (PSI), pavyzdžiui, omeprazoliu rabeprazolio ir lansoprazolo yra intervale 59 nm iki 360 nm [27, 28]. Kuo didesnis stiprumas PSI į rūgšties sekrecijos talpos kontekste, palyginti su mikrosomų H, K-ATPazės (SSD 50s svyruoja nuo 72 nm iki 40 mikromolių) atspindi išsamesnį rūgšties aktyvavimo PSI pavieniais Išorinis ląstelių kanalėliuose nei įvyksta per vitro mikrosomų tyrimai, esant pH 6,1 arba didesnis.
PGE 2 duomenys, priešingai nei ankstesniame tyrime, kurio ne slopinantis poveikis PGE 2 kiaulių skrandžio H, K-ATPazės [29] buvo pranešta , Skirtumai konkretaus ATPazės tyrimas, naudojamas tame tyrime gali atsiskaityti už šį neatitikimą. Nuo ML3000 ir arachidono rūgštis yra anijoninių amfipatiškumas, jų slopinimas gali atsirasti specifinių sąveikos su H, K-ATFazės subvieneto jungimosi vietų, arba iš mažiau konkrečių hidrofobinės sąveikos su H, K-ATPazės susijusių mikrosomų membranų lipidų, arba jų derinys abu veiksniai.
mililitrų 3000 slopinimu H, K-ATPazės aktyvumas in vitro, kaip parodyta 2B pav grįžtamumą, kontrastuoja su H, K-ATPazės slopinimo negrįžtamumo pagal pakeistiems benzimidazolams pavyzdžiui, omeprazolą ar lansoprazolo.

• CD44 /CD24 raiška pasikartojančių skrandžio vėžiu: retrospektyvinė analizė
• Ryšys tarp valgio pokyčių širdies kairiojo skilvelio funkcija, gliukozės ir insulino koncentraciją, skrandžio išsituštinimą, ir sotumo sveikų subjects