Inhibition vun gastric H, K-ATPase Aktivitéit an gastric epithelial Zell IL-8 secretion vun der pyrrolizine kuckt virdrun ML 3000

Inhibition vun gastric H, K-ATPase Aktivitéit an gastric epithelial Zell IL-8 secretion vun der pyrrolizine kuckt virdrun ML 3000 VerfÜgung méiglech VerfÜgung Background VerfÜgung ML 3000 ([2,2-Police-6- (4-chlorophenyl ) -7-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizine-5-yl] -acetic Seier) ass eng inhibitor souwuel vun cyclooxygenase a 5-lipoxygenase kënschtlech, a weist verspriechen als Roman net-steroidal anti-demagogesch Alkohol- (NSAID). Anescht wéi konventionell NSAIDs déi mat gastric ulcerogenic Effekter verbonne sinn, ML 3000 bewierkt wéineg oder kee Schued fir d'gastric mucosa, obwuel et gastric prostaglandin Synthes vill depresses. VerfÜgung Method VerfÜgung Als Deel vun engem Effort Mechanismen ze klären der gastric Basisdaten sparing Eegeschafte vun ML 3000, mir d'Effete vun ML 3000 op H, K-ATPase Aktivitéit kënschtlech studéiert, op Seier Heefung an isoléiert gastric parietal Zellen, an op IL-8 secretion vun gastric epithelial Zellen an der Kultur. VerfÜgung Resultater
SCH28080-senisitive H, K-ATPase Aktivitéit an héich-stilvoller Fierkel gastric microsomes war Portioun-dependently vun ML 3000 (IC 50 = 16.4 μM) inhibited. Inhibition war Reversibelen, an Identitéit verléiert 2.0-8.0 3000 sauer an de pH Palette un ML. An Kanéngchen gastric parietal Zellen, VerfÜgung ML 3000 Portioun-dependently inhibited histamine-stimuléiert Seier Heefung (IC 50 = 40 μM) an forskolin-stimuléiert Seier Heefung (IC 50 = 45 μM). Styl, an mënschlechen gastric adenocarcinoma (AGS) Zellen, ML 3000 Portioun-dependently inhibited souwuel baseline an IL-1β-stimuléiert (20 Dummeldéng /ml) IL-8 secretion mat IC 50s vun 0,46 μM an 1,1 μM bzw..
Conclusioun VerfÜgung D'Donnéeën weg datt ML 3000 Seier-secretory Mechanismen afgerappt vum Camp Mobiliséierung vun histamine H 2 receptor Aktivéierung, datt et direkt bremst H, K-ATPase spezifesch Aktivitéit, an datt baseline gastric epithelial Zell entschlof schellt IL-8 secretory inhibition kann duerch ML 3000 inhibition vun 5-lipoxygenase Aktivitéit mediated ginn. Mir schléissen, datt dës gastric Funktioun inhibitory Daten der gastric sparing Eegeschafte vun ML 3000. VerfÜgung Background VerfÜgung D'pharmacological Eegeschafte vun nonsteroidal anti-demagogesch Drogen underlie kann (NSAIDs) entstoen hir Ennerdréckung vun prostaglandin Synthes aus arachidonic Seier [1] . Inhibition vun gastric prostaglandin syntheses ass awer begleet vun gastric mucosal ugekuerbelt ofgeholl, mat concomitant mucosal Empfindlechkeet op Javuier Verletzung vun enger Rei vun irritants [2]. A verspriecht pharmacological Strategie gastric komplizéiert vun NSAID Verwaltung ze verhënneren axéiert op concurrent cyclooxygenase a 5-lipoxygenase inhibition, mat dem Zil vun leukotriene Synthes suppressing. 5-lipoxygenase konvertéiert arachidonic Seier un leukotrienes, dorënner déi leukotriene B4 fir leukocytes chemotactic ass an doduerch dréit zu demagogesch Mechanismen gastrointestinal ulcers Virwaat [3]. D'pyrrolizine kuckt virdrun ML 3000 ([2,2-Police-6- (4-chlorophen-yl) -7-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizine-5-yl] -acetic Seier) ass eng inhibitor souwuel Cyclo-oxygenase a 5-lipoxygenase kënschtlech [4, 5], a weist verspriechen als Roman NSAID. ML 3000 verklengert gastric prostaglandin E2 Sythese zu Grenzwäerter Mo a Blutt, obwuel bedeitendst inhibition vun gastric oder Blutt leukotriene B4 Synthes net fonnt huet [6]. Wichteg, ML 3000 keen Effekt op leukocyte onvergläichleche zu mesenteric venules huet, a bewierkt keng gastric mucosal blesséiert [6]. VerfÜgung An Déier Modeller, ML 3000 gouf fonnt pharmacologically benign gin. Soumat huet de Massa keng Grenzwäerter locomotor Aktivitéit oder hexobarbital-entschlof ginn, hu kee Ausdauer oder dorop Auswierkunge vun Grenzwäerter an Hënn betreffen, ouni sech op neuromuskulären Funktioun an Kazen betreffen, an ëmmer weder gastric Schued nach peristaltic Stéierung [7]. ML 3000 Album eng schwaach spasmogenic Äntwert zu guinea-Fierkel ileum, an ëmmer e klengen flüchteg Reduktioun am Pipi Wasserstoff an deër [7]. Genotoxicity Studie weisen, dass ML 3000 keng Auswierkungen op Gentherapie stattfannen Ofstänn zu Bakterien oder mammalian Zellen huet, op unscheduled DNA Synthes, oder op Frequenz vun chromosomal geometrescher Figur vun Grenzwäerter Réckemuerch hiirgestallt Zellen [8]. 14C-Label ML 3000 Verdeelung a excretory Studien an deër weg enterohepatic Circulatioun an glucuronide of ML 3000 [9]. VerfÜgung D'pharmacological Profil vun ML 3000 wéi am Déier Modeller studéiert weist anti-demagogesch, analgesic, antipyretic, antiasthmatic, an antiaggregative Aktivitéit op engem Doséierung datt kee gastric Schued Ursaachen [4, 10]. D'Visiteuren a chronescher anti-demagogesch Eegeschafte vun ML 3000 studéiert an d'adjuvant-entschlof Grenzwäerter leckt edema Modell [11] weisen, datt obwuel indomethacin ass e bësse méi mächtegst als eng anti-demagogesch bannendran, keng gastric Schued mat ML 3000 bis zu 100 bemierken war mg /kg /d po hierkommen d'ulcerogenic Dosis (UD 50) fir indomethacin 7 war mg /kg /d po VerfÜgung Gastric vun NSAIDs entschlof ulceration Limite bedeitend der Déngscht vun dësen Drogen. Kloer, d'Kombinatioun vun Anti-demagogesch an gastric sparing Eegeschafte Schatzkummer vum ML 3000 mécht dat Massa eng attraktiv Kandidat fir weider studéieren. Zwee gastric mucosal Funktiounen déi wichteg Roll vun gastric ulceration Leeschtung sinn Seier secretion an interleukin-8 secretion. Seier secretory inhibitors ginn ënnert déi héich-verschriwwen Medikamenter, bidden d'Fro gestallt adage "Nee Seier, keen oppent". Pharmacological oder pathophysiological Barriär vun der gastric mucosal Barrièren Diffusion vun HCl féiert zu rapid Ofkéier vun der gastric epithelial monolayer a konsequent ulceration vun der mucosa zu zréck. Inhibition vun Seier secretion vun antagonism um parietal Zell histamine H2 receptor (Bett), oder duerch direkt covalent derivatization an inactivation vun der gastric Proton Pompel (omeprazole, lansoprazole, rabeprazole, esomeprazole, etc) ass Iddi fir Responsabilitéit a Promotioun vun Heelung vun gastric ulcers. Soumat kënnen d'gastric sparing Auswierkunge vun ML 3000 kënnt vun der Massa zu Seier secretory inhibition Zesummenhang ginn. VerfÜgung A ergänzen gastric sparing Effet vun ML 3000 modulation vun gastric secretion vun der pro-demagogesch cytokine IL-8 abannen. Aspirin-entschlof huet gastric blesséiert gemellt gouf mat méi antral Produktioun vun IL-8 [12] verbonne ginn. D'ulcerogenic Bakterie Helicobacter pylori VerfÜgung gouf dës Quote an Amplituden vun IL-8 secretion souwuel eng kënschtlech an VIVO [13-15] ze klammen, a fir weider-regléieren IL-8 Gentherapie Ausdrock [16]. Ähnlech IL-8 prosecretory Effekter sinn als Resultat vun IL-1β Stimulatioun vun gastric epithelial Zellen gesinn. Verglach vun den Auswierkunge vun ML 3000 a vun anere NSAIDs op dës gastric secretory Aktivitéite kann de Mechanismus entschlësselen déi ML 3000 d'Équipe vun gastric mucosal lesions hält. VerfÜgung Fir Mechanismen ze klären der gastric Basisdaten Eegeschafte vun ML 3000 sparing, mir den Effet vun ML 3000 op zwou gastric mucosal secretory Funktiounen propagéieren mat Rollen an ulcerogenesis: secretion vun Salz- Seier, an secretion vun der demagogesch cytokine interleukin-8. Eis Donnéeë weisen datt ML 3000 Fierkel gastric microsomal H, K-ATPase Aktivitéit bremst, histamine-stimuléiert sauer zu Kanéngchen gastric parietal Zellen bremst, a bremst IL-1β-stimuléiert IL-8 secretion duerch mënschlech gastric epithelial Zellen. VerfÜgung Method
Reagents VerfÜgung ML 3000 an ZD-2138 waren déi Forest Laboratoiren, Inc., New York, NY gëtt, omeprazole vun Spuer R &gëtt war; D, Molndal, Schweden, Sch 28080 war vun Schering-Plough Research Institut, Kenilworth, NJ, huet TEDBC aus Tocris Vëloen, Inc., Ballwin, MO, an NS 398 koum vum Cayman Chemikalien, Inc., Ann Arbor, MI. Arachidonic Seier, indomethacin, acetyl salicylic Seier, naproxen, PGE 2, leukotrienes B4 an D4, an IL-1β all waren aus Fläch-Aldrich Corp., St. Louis, MO chrétienne. Police sulfoxide (Fläch-Aldrich) war benotzt ML3000 zu solubilize, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, an indomethacin. Acetyl salicylic Seier an naproxen sech zu ATPase assay Prellbock (berode infra VerfÜgung) opgeléist. Arachidonic Seier an PGE 2 sech an absolute Ethanol opgeléist, an omeprazole war zu methanol opgeléist. Leukotrienes B4 an D4 sech zu enger 70:30 Mix vun methanol an 17 mm ammonium acetate opgeléist Pleséier. IL-1β war zu phosphate-gefiermt Salins (pH 7,4), 0,1% w /v Bovine serum albumin opgeléist. All assays dësen awer mat abegraff passenden Léisungsmëttelbad Kontrollen, an all Léisungsmëttelen um Konzentratioune präsent waren manner wéi 1% w /v an der Finale assay Mëschung. VerfÜgung Virbereedunge H, K-ATPase VerfÜgung Microsomal gastric H, K-ATPase gastric mucosal homogenates vun Ënnerscheed an sucrose /Ficoll Schrëtt packt centrifugation war vum Fierkel virbereet wéi virdru beschriwwen [17]. Dës Virbereedung noginn engem relativ schwéier (7% Ficoll /1,1 M sucrose Interface) GII microsomal Ëmwandlung, déi kee latency vun K-ATPase Aktivitéit huet, an dat sech aus ~ 90% H, K-ATPase, baséiert op densitometry vun engem 94 kDa Band vun SDS-PAGE Analyse. GII microsomes bei -80 ° C zu 20% glycerol gespäichert goufen. VerfÜgung H, K-ATPase Assay VerfÜgung ATP hydrolytic Aktivitéit vun Fierkel gastric microsomes war den orthophosphate Fräiloosse vu Realitéiten ATP quantitated engem colorimetric MALACHITE gréng Prozedur benotzt [18] . ATPase assays sech microplates zu 96-gutt duerchgefouert. Kuerz, 100 μl /gutt assay Prellbock (60 mm Tris-HCl, pH 7.4, 2 mm MgCl 2, 1 mm EGTA, ± 7.5 mm KCl, ± 50 μM SCH28080), 80 NG microsomal H wouvun, K-ATPase , ML 3000 (10 -9 M bis 10 -4 M) oder aner awer och, an 1 mm ATP war fir 30 min bei 37 ° C incubated. Enzymatic Aktivitéit war vun Zousätzlech gestoppt (45 μl /gutt) vun colorimetric reagent (0.07% MALACHITE gréng, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% ammonium molybdate tetrahydrate, 0,134% Tween-20). No 10 Sekonnen, war d'Faarf Reaktioun vun Zousätzlech (45 μl /gutt) vun 15% Natrium citrate entwéckelt. No 45 min bei Raumtemperatur, absorbance vun der Wells bei 570 nm zu engem microplate Lieser gemooss gouf. VerfÜgung Fir d'Auswierkunge vun ML 3000 sauer op ATPase inhibition, ML 3000 aliquots (10 mm an 5 mm Tris-HCl) moossen sech rangéiert vun 2.0 bis 7.4 fir 30 min ze pHs titrated. Gastric zu Standard ATPase assay gefiermt suspendéiert microsomes um pH 7,4 sech fir 30 min mat acidified aliquots vun ML 3000 (16.6 μM Finale ML 3000 Konzentratioun) an dann ATPase Aktivitéit incubated gemooss gouf den uewe beschriwwen. omeprazole inhibition vun H, K-ATPase Aktivitéit, gastric microsomes zu ATPase assay gefiermt um pH 6.1 Spär ze moossen sech fir 30 min mat variabelen Konzentratioune vun omeprazole incubated. Omeprazole sauer ze pH 6.1 war néideg Formatioun vun der inhibitory thiol-reaktiv sulfoxide ze erlaben Tëscherapport [19]. D'gastric microsomes sech dann um pH zu Standard ATPase assay gefiermt transferéiert 7.4, an ATPase Aktivitéit gemooss gouf den uewe beschriwwen. Spezifësch H, K-ATPase Aktivitéit wéi d'Differenz zu microsomal ATPase Aktivitéiten an der Presenz a Flichte vun de spezifeschen Reversibelen gastric H berechent hat, K-ATPase inhibitor SCH28080, a war och als μmoles P i /mg FAQ /HR. H, K-ATPase Aktivitéit frësch-virbereet Fierkel gastric microsomes gounge vun 140 bis 170 μmoles P i /mg FAQ /HR. Grapheschen Wierker vun den Donnéeën weist Prozent inhibition vun H, K-ATPase Aktivitéit als Funktioun vun Massa Konzentratioune. VerfÜgung primär Zell Virbereedunge VerfÜgung Gastric parietal Zellen aus Neuseeland White Kanéngercher vun pronase /collagenase Verdauung vun fundic mucosa isoléiert sech duerno vum Räichtum vun Zellen op erauskomm Nycodenz Iwwergäng wéi virdru beschriwwen [20]. Parietal Zell Preparatiounen aus ronn 10 7 Zellen /Mo, vun deenen 80 ± 5% parietal Zellen op immunocytochemistry mat H, K-ATPase-spezifesch monoclonal antibody. VerfÜgung Saier Heefung Assay VerfÜgung Aminopyrine Heefung an parietal baséiert sech Zellen war am 96 grad agin Placke mat Durapore Schläimhait évaluéieren, wéi virdru beschriwwen [21]. Kuerz, goufen Zellen preincubated mat [ 14C] -aminopyrine an dann 100.000 Zellen /200 μl pro och ouni oder mat Test awer fir 15 Minutten virun incubation fir eng weider 30 min an d'Feele oder Präsenz vun 100 μM histamine incubated sech oder 100 μM forskolin. All alles sech am quadruplicate gesuergt. Basal aminopyrine Heefung war den aminopyrine Heefung an onbehandelt Zellen aus Heefung an der Präsenz vun KSCN (eng Reflexioun vun Net-spezifesch Isotop reegel) subtracted alles. Grapheschen Wierker vun den Donnéeën weist Prozent inhibition vun histamine-stimuléiert Seier Heefung vun den Zellen als Funktioun vun Massa Konzentratioune. VerfÜgung Gastric Adenocarcinoma BTS VerfÜgung Mënscherechter gastric adenocarcinoma Zellen (AGS Zellen, ATCC loosen 1739), huet sech am AGS haten mëttel- (Ham d'F-12, 10% an et Bovine serum, 100 Unitéiten /ml penicillin G, 0,25 ug /ml amphotericin B, 100 ug /ml streptomycin) bei 37 ° C an engem 5% CO 2/95% Loft incubator a benotzt tëscht Passage 42 an Q56 fir Studie vun IL-8 secretion, goufen AGS Zellen an 96-gutt Placke plated (50.000 Zellen /100 μl /gutt) a fir 18 HR bei 37 ° C an 5% CO zu befestegt erlaabt 2/95% Loft. Zellen sech dann mat Test awer an der Presenz a Flichte vun IL-1β fir 24 HR, op déi Zäit Echantillon vun mëttelfristeg incubated sech aus der Wells geläscht a bei -70 ° C gespäichert. IL-8 Konzentratioune vun der Echantillon vun Aktivitéit-Hausnummeren immunosorbent assay (Human IL-8 Duo-Set Elisa Entwécklung System, R & D Wunnengen Galaxy är ganz Famill, Punktzuel) bestëmmt goufen. Grapheschen Wierker vun den Donnéeën weist Prozent inhibition vun unstimulated oder stimuléiert IL-8 secretion wéi eng Funktioun vun Massa Konzentratioune VerfÜgung statistique Analys VerfÜgung All Experimenter waren op d'mannst dräi mol duerchgefouert. Eckdate vun all assay vertrieden Miessung heescht aus triplicate Echantillon. Eckdate Milieu eng dräi Parameter Logistikzenter Equatioun sech als sigmoidal Portioun-Äntwert Kéiren mat der Prism statistesch Pak (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) graphed. Halschent-Bäschten inhibitory Konzentratioune (IC 50) an IC 50 95% Vertraue Intervalle (CI) goufen och Prism berechent benotzt. Eckdate net eng dräi Parameter Logistikzenter Milieu sech als einfach Punkt-ze-Punkt Kéiren zréckgräifen. Standard Feeler d'Mesure vun Varianz war fir Feeler Baren zu grafeschen Wierker benotzt vun Donnéeën VerfÜgung Resultater VerfÜgung Effects vun ML 3000 op H, K-ATPase Aktivitéit VerfÜgung Gastric H, K-ATPase Aktivitéit Portioun-dependently war inhibited vun ML 3000, mat engem hallef-Bäschten inhibitory Konzentratioun (IC 50) vun 16,4 μM (CI = 6,84 - 39,3 μM) (Dorënner 1A). D'inhibitory Aktivitéit vun ML 3000 war zu deem vun enger klassescher Proton Pompel inhibitor (PPI) Verglach, d'benzimidazole omeprazole Aen. Figur 1B weist den Effet vun omeprazole op H, K-ATPase Aktivitéit ënner assay Konditiounen sëlwecht wéi an Figur 1A; der berechent IC 50 fir omeprazole war 1,7 μM (CI = 0,26 - 11,3 μM). Dës Donnéeë weisen datt ML 3000 ass däitlech manner mächtegst wéi omeprazole mat Respekt ze gastric H, K-ATPase inhibitory Aktivitéit, op d'mannst an de Kader vun dësem besonneschen kënschtlech assay ënnert der spezifizéierter Konditiounen. Fir erauszefannen, ob ML 3000 ähnlecher Seier-Aktivéierung Eegeschaften, eng hallef-Bäschten inhibitory Konzentratioun vun ML 3000 ugewisen ass fir verschidde pHs titrated an d'Effeten op H, K-ATPase Aktivitéit huet gemooss. Als zu Dorënner 2A gewisen, sauer vun ML 3000 hat kee groussen Effet op seng H, K-ATPase inhibitory Profil. Dës Donnéeë weisen, datt ML 3000, am Géigesaz zu omeprazole, brauchen net sauer fir Aféierungs- vun inhibitory Aktivitéit. Tatsaach, datt PPIs irreversibel inhibitors vun H, K-ATPase Aktivitéit sinn, covalently fir de Katalysator α subunit bindend, géng mir bis ob inhibition vun H, K-ATPase ML 3000 festzestellen Reversibelen oder irreversibel ass. Gastric H, K-ATPase-beräichert microsomes sech mat engem maximally-inhibitory Konzentratioun vun ML 3000 behandelt an duerno mat enger grousser iwwerschësseg vun gefiermt verdënntem der ML 3000 Konzentratioun vu 100 μM zu 3,3 μM ze reduzéieren. D'Resultater, dës Distanz an Dorënner 2B, uginn, datt dilution vun ML 3000 H, K-ATPase Aktivitéit restauréiert, an sinn konsequent mat ML 3000 inhibiting H, K-ATPase Aktivitéit zu engem Reversibelen Manéier, dh., ML 3000 net covalently derivatize entweder subunit vun der gastric H, K-ATPase, op d'mannst ënner de Bedingunge vun der presentéieren kënschtlech assay vun H, K-ATPase Aktivitéit. An dëser Hisiicht, ML 3000 ass kinetically gläicht SCH28080, déi spezifesch Reversibelen inhibitor vun gastric H, K-ATPase. Figur 1 Portioun-ofhängeg inhibition vun H, K-ATPase Aktivitéit vun ML 3000 (A) an duerch omeprazole (B). (A). Gastric microsomes um zu ATPase assay gefiermt suspendéiert pH 7,4 sech fir 30 min incubated mat Konzentratioune vun ML 3000 an ATPase Aktivitéit verännerlech war dann am pH 7.4 gemooss. D'Halschent-Bäschten inhibitory Konzentratioun (IC50) fir ML 3000 war 16,4 μM (CI = 6.84-39.3 μM). (B). Gastric microsomes zu ATPase assay gefiermt um pH suspendéiert 6.1 ware fir 30 min incubated mat Konzentratioune vun omeprazole verännerlech, an Virée dann zu Standard ATPase assay gefiermt um pH 7.4 fir ATPase Aktivitéit Miessung. D'IC50 fir omeprazole war 1,1 μM (CI = 0,26 - 11,3 μM). D'Daten-Punkte weisen mengen ± s.e. aus dräi onofhängeg assays zu all vun deem war SCH28080-senisitive ATPase Aktivitéit zu triplicate gemooss. VerfÜgung 2 Effekt vun ML 3000 sauer op H, K-ATPase Aktivitéit (A), an ML 3000 inhibition vun H, K-ATPase Aktivitéit Dorënner ass Reversibelen (B). (A) ML 3000 aliquots (10 mm an 5 mm Tris-HCl) sech un pHs vun 2.0 bis 7.4 fir 30 min ier Nieft Standard ATPase assay Prellbock (pH 7.4) mat gastric microsomes rangéiert titrated. (B) Gastric microsomes sech mat engem maximally-inhibitory Konzentratioun behandelt (100 μM) vun ML 3000. D'microsomal Ophiewe da mat engem groussen iwwerschësseg vun gefiermt verdënntem war den ML 3000 Konzentratioun vu 100 μM zu 3,3 μM ze reduzéieren. An souwuel (A) an (B), weisen d'Daten-Punkten bedeit ± s.e. aus dräi onofhängeg assays zu all vun deem war SCH28080-senisitive ATPase Aktivitéit zu triplicate gemooss. Arachidonic Seier an prostaglandin E VerfÜgung 2 (PGE 2) och dodrunner-dependently inhibited H, K-ATPase Aktivitéit, mat IC 50 vun 16,7 μM (CI = 8,9 - 31,5 μM) an 15 μM (CI = 3,96 - 57,3 μM) bzw. (Dorënner 3A an 3B). Zanter ML 3000 och 5-lipoxygenase inhibition weist, studéiert mir d'Effete vun zwee lipoxygenase inhibitors op microsomal H, K-ATPase Aktivitéit. Figur 4A weist dass 2- (1-thienyl) ethyl 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), e mächtege inhibitor vun 5-, 12- a 15-lipoxygenses, inhibited microsomal H, K-ATPase Aktivitéit mat engem IC 50 vun 22,6 μM (CI = 6.3 - 81,2 μM). Am Géigesaz, de 5-lipoxygenase-spezifesch inhibitor 6 - ((3-fluor-5- (methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-4-yl) phenoxy) Duerch) chinolin (ZD-2138 ) haten eng minimal Effekt op H, K-ATPase Aktivitéit (~ 20% inhibition um 10 -5 M) (Dorënner 4B). Dës Donnéeë sinn konsequent mat gastric microsomal 12- a 15-lipoxygenases spillt eng Roll am H, K-ATPase Aktivéierung, oder mat direktem Interaktioun vun TEDBC mat H, K-ATPase subunits Wou muss ech Aktivitéit conformation an domat Aktivitéit. Kloer, sinn souwuel Interpretatiounen provocative a Verdingscht weider studéieren. Figur 3 Inhibition vun H, K-ATPase Aktivitéit vun arachidonic Seier (A) an prostaglandin E 2 (B). Gastric microsomes um zu ATPase assay gefiermt suspendéiert pH 7,4 sech fir 30 min incubated mat Konzentratioune vun arachidonic Seier oder PGE2 an ATPase Aktivitéit verännerlech war dann am pH 7.4 gemooss. IC50 fir arachidonic Seier war 16,7 μM (CI = 8,9 - 31,5 μM), an der IC50 fir PGE2 war 15 μM (CI = 3,96 - 57,3 μM). D'Daten-Punkte weisen mengen ± s.e. aus dräi onofhängeg assays zu all vun deem war SCH28080-senisitive ATPase Aktivitéit zu triplicate gemooss. VerfÜgung 4 Inhibition vun H, K-ATPase Aktivitéit vun der 5-, 12- a 15-lipoxygenase inhibitor TEDBC (A) well, an de 5-lipoxygenase inhibitor ZD-2138 (B). Gastric microsomes um zu ATPase assay gefiermt suspendéiert pH 7,4 sech fir 30 min mat variabelen Konzentratioune vun TEDBC oder ZD-2138 an ATPase Aktivitéit incubated war dann am pH 7.4 gemooss. An (A), den Daten-Punkte weisen mengen SCH28080-senisitive ATPase Aktivitéit gemooss zu triplicate an ee vun dräi onofhängeg assays; typesch Daten sinn gewisen. D'Daten-Punkten an (B) show mengen ± s.e. aus dräi onofhängeg assays zu all vun deem SCH28080-senisitive ATPase Aktivitéit zu triplicate gemooss gouf. VerfÜgung Fir d'H, K-ATPase inhibitory Effet vun ML 3000 mat aneren NSAIDS, mir gemooss d'Auswierkunge vun acetyl salicylic Seier, NS ze vergläichen 398, naproxen, an indomethacin op Proton Pompel Aktivitéit. All véier NSAIDS sech ouni inhibitory Auswierkungen op microsomal H, K-ATPase Aktivitéit um Konzentratioune bis 10 -4 M (10 -3 M fir acetyl salicylic Seier) (Dorënner 5A, 5B, 5C an 5D). Indomethacin war virdrun Untersuchungshaft gastric H, K-ATPase um bësse méi héich Konzentratioun (K i = 0,67 × 10 -3 M) [22] inhibit. Eis Daten differenzéiert kloer ML 3000 aus anere NSAIDS zu Conditioune vun inhibitory Effekt op gastric H, K-ATPase Aktivitéit; der mechanistic Basis fir dësen Ënnerscheed, an de Potential Korrelatioun mat der observéiert gastric-sparing Besëtz vun ML 3000, bleiwe propagéieren gin. Figur 5 Effects vun acetyl salicylic Seier, NS 398, naproxen, an indomethacin op H, K-ATPase Aktivitéit. Gastric microsomes um zu ATPase assay gefiermt suspendéiert pH 7,4 sech fir 30 min incubated mat Konzentratioune vun acetyl salicylic Seier verännerlech, NS 398, naproxen, oder indomethacin an ATPase Aktivitéit war dann am pH 7.4 gemooss. D'Daten-Punkte weisen mengen SCH28080-senisitive ATPase Aktivitéit gemooss zu triplicate an ee vun dräi onofhängeg assays; typesch Donnéeën an all Fall VerfÜgung Styl ob der ML 3000 inhibition vun gastric H, K-ATPase de Massa d'Effekter op putative funktionell spigelt leukotriene metabolic Weeër gewise ginn., gastric microsomes präsent an Schwäin an Uerdnung ze etabléieren, studéiert mir d'Effete vun leukotriene B4 an D4 op H, K-ATPase Aktivitéit. Creme Problemer precluded LTB4 oder LTD4 Konzentratioune ënnersicht méi wéi 1 μM. Als zu Dorënner 6A an 6B gewisen, awer weder leukotriene all inhibitory Aktivitéit géint H, K-ATPase um gestallt Konzentratioune (10 -9-10 -8 M); nëmmen op den Net-Fro gestallt Konzentratioune méi wéi 10 -7 M war et all bedeitend attenuation vun H, K-ATPase Aktivitéit. Figur 6 Effects vun leukotrienes B4 an D4 op SCH28080-senisitive H, K-ATPase spezifesch Aktivitéiten. Gastric microsomes zu ATPase assay gefiermt um pH suspendéiert 7,4 sech fir 30 min mat variabelen Konzentratioune vun leukotriene B4 oder leukotriene D4 an ATPase Aktivitéit incubated war dann am pH 7.4 gemooss. D'Daten-Punkte weisen mengen ± s.e. aus dräi onofhängeg assays zu jidderengen vun deenen am triplicate SCH28080-senisitive ATPase Aktivitéit gemooss gouf. VerfÜgung Effects vun ML 3000 op gastric parietal Zell histamine-stimuléiert Seier Heefung VerfÜgung ML 3000 Portioun-dependently inhibited histamine-stimuléiert (100 μM) Seier Heefung vun Kanéngchen gastric parietal Zellen, mat engem hallef-Bäschten inhibitory Konzentratioun (IC 50) vun 40 μM (Dorënner 7A). ML 3000 och dodrunner-dependently inhibited forskolin-stimuléiert (100 μM) Seier Heefung vun Kanéngchen gastric parietal Zellen, mat engem IC 50 vun ~ 45 μM (Dorënner 7B). Dës Donnéeë weisen, datt ML 3000 parietal Zell Seier-secretory Mechanismen afgerappt vum Camp Mobiliséierung entschlof vun histamine H 2 receptor Aktivéierung betreffen. D'Donnéeë sinn konsequent mat ML 3000 inhibition vun secretion parietal Zell Seier doraus direkt Interaktioun vun ML 3000 mat der gastric H, K-ATPase. Allerdéngs, d'discepancy tëscht ML 3000 IC 50 an microsomal vesicles (15 μM) an an isoléiert parietal Zellen (40-45 μM) hindeit datt ML 3000 Zougang zu der intracellular H, K-ATPase unzekräizen an parietal Zellen Emstänn kann vun permeability Contrainten bei de Plasma Membran. Geff ML 3000 kënnen ze cytoplasmic metabolic Modifikatioune Thema gin déi inhibitory as vun de Massa limitéiert. Figur 7 ML 3000 bremst Seier Heefung an Kanéngchen gastric parietal Zellen. (A) Dose-ofhängeg inhibition vun ML 3000 vun histamine-stimuléiert (100 μM) Seier Heefung vun Kanéngchen gastric parietal Zellen (IC50 = 40 μM). (B) Dose-ofhängeg inhibition vun ML 3000 vun forskolin-stimuléiert (100 μM) Seier Heefung vun Kanéngchen gastric parietal Zellen (IC50 = 45 μM). D'Daten-Punkte weisen mengen ± s.e. vu véier onofhängegen assays zu all vun deem war Seier Heefung an parietal Zellen am zweete gemooss. VerfÜgung Endlech, wéi mat microsomal H, K-ATPase, aner NSAIDS wéi acetyl salicylic Seier, naproxen, an NS 398 (bis fonnt huet bis Konzentratioune vun 10 -4 M) hu keen Effekt op Seier Heefung vun isoléiert Kanéngchen parietal Zellen (Donnéeën net gewisen) VerfÜgung Effects vun ML 3000 op IL-1β-entschlof IL-8 secretion zu Mënsch gastric adenocarcinoma (AGS) Zellen VerfÜgung Ënner baseline Konditiounen, AGS Zellen (5 × 10 4 zu 100 μl Kultur mëttelfristeg) secreted IL-8 iwwer eng Period vun 24 HR zu enger Konzentratioun vun ~ 225 PG /ml mëttelfristeg. Wann déi IL-1β (1 Dummeldéng /ml) stimuléiert, AGS Zell IL-8 secretion iwwer eng Period vun 24 HR war ~ 27-fantastesch fräi, zu enger Konzentratioun vun ~ 6000 PG /ml. ML 3000 inhibited souwuel baseline an IL-1β-stimuléiert IL-8 secretion, mat IC 50s vun 0,46 μM (CI = 0,09 - 2,4 μM) an 1,1 μM (CI = 0,52 - 2,2 μM) bzw. (Dorënner 8A an 8B ). Figur 8 Effects vun ML 3000 op IL-1β-entschlof IL-8 secretion zu Mënsch gastric adenocarcinoma (AGS) Zellen. ML 3000 inhibited souwuel baseline (A) an IL-1β-stimuléiert (B) IL-8 secretion, mat IC50s vun 0,46 μM (CI = 0,09 - 2,4 μM) an 1,1 μM (CI = 0,52 - 2,2 μM) bzw.. De 5-lipoxygenase-spezifesch inhibitor ZD-2138 zougedréckt Portioun-ofhängeg inhibition vun baseline AGS Zell IL-8 secretion (C), mat enger IC50 vun 58 nm (CI = 15,6 - 218 nm) an minimal Effekt op AGS Zell IL-1β -stimulated IL-8 secretion (D). D'Daten-Punkte weisen mengen ± s.e. aus dräi onofhängeg assays zu all vun deem IL-8 Konzentratioune vun triplicate gemooss goufen. VerfÜgung De 5-lipoxygenase-spezifesch inhibitor (ZD-2138), deen ouni Effekt op microsomal H war, K-ATPase Aktivitéit, zougedréckt Portioun-responsiven inhibition vun baseline AGS Zell IL-8 secretion (Dorënner 8C), mat engem IC 50 vun 58 nm (CI = 15,6 - 218 nm). ZD-2138 zougedréckt minimal Effekt op IL-1β-stimuléiert IL-8 secretion vun AGS Zellen (Dorënner 8D). H, K-ATPase inhibition vun ML 3000, wou mer am Moment Etude bewisen hunn, underlie net IL-8 secretory inhibition vun dësem Modell well immunocytochemistry mat H, K-ATPase-spezifesch monoclonal antibody kee H weist, K-ATPase Ausdrock zu AGS Zellen (Donnéeën net gewisen). VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung Dës Etude Informatiounen iwwer d'Auswierkunge vun ML 3000 op Aspekter vun gastric Physiologie déi zu ulcerogenesis dinn. Dräi experimentell Modeller vun gastric Funktioun huet propagéieren; héichgradeg-stilvoller funktionell H, K-ATPase (Proton Pompel) aus der gastric mucosa vum Schluechthaus leifste, isoléiert Kanéngchen gastric parietal Zellen isoléiert, an mënschlechen gastric adenocarcinoma Zellen an der Kultur. Am éischte Modell, ML 3000 inhibited Proton Pompel mat engem IC 50 vun 16,4 μM. D'Proton Pompel inhibitor (PPI) omeprazole ugewisen eng IC 50 vun 1,1 μM am selwechten assay. Anescht PPIs, ML 3000 inhibitory Aktivitéit war onofhängeg vun pH a war Reversibelen. Selektiv an Net-selektiv NSAIDS zougedréckt kee H, K-ATPase inhibitory Aktivitéit an der selwechter assay. Am zweete Modell, ML 3000 inhibited souwuel histamine an forskolin-stimuléiert Seier Heefung (IC 50 = 40 an 45 μM), konsequent mat ML 3000 Proton Pompel inhibition. Am drëtte Modell, ML 3000 inhibited souwuel baseline an IL-1β-stimuléiert interleukin-8 secretion aus AGS Zellen (IC 50 = 0.46 an 1,1 μM bzw.), obwuel de Fonds Effekt op de 5-lipoxygenase inhibitory Aktivitéit allerdéngs schéngt vun ML 3000 (Dorënner 8D). VerfÜgung IC Publizéiert 50 fir omeprazole mat Respekt ze gastric Proton Pompel Aktivitéit Gamme vu 470 nm bis 36 μM je op d'Konditioune vun der assay [23-25]. Fir aner PPIs, picoprazole IC 50 ass 2 μM [26], rabeprazole IC 50 ass 72 nm [23], an lansoprazole IC 50 ass 2.1 μM [27]. D'Panoplie vun publizéiert PPI IC 50 Wäerter fir microsomal H, K-ATPase spigelt de mechanistic Noutwennegkeet fir Massa sauer Tëscherapport Opstellung vun engem thiol-reaktiv sulfoxide ze erlaben, wat dann irreversibly derivatizes H, K-ATPase α cysteine ​​Reschter subunit féierende dramatesch mat omeprazole inhibition vun Seier Heefung an isoléiert parietal Zellen ze Aktivitéit inhibition. VerfÜgung och dës ML 3000 Daten Kontrast. Seier secretory Muecht IC 50s (an isoléiert parietal Zellen) vum Proton Pompel inhibitors (PPIs) wéi omeprazole, rabeprazole, an lansoprazole sinn an der Rei 59 nm bis 360 nm [27, 28]. Déi grouss as vun PPIs am Kontext vun Seier secretory Muecht am Verglach zu microsomal H, K-ATPase (IC rangéiert 50s aus 72 nm bis 40 μM) däitlech méi komplett Seier Aktivatioun vun PPIs an isoléiert canaliculi parietal Zell wéi an ferdeg an microsomal kënschtlech assays um pH 6.1 oder méi héich. VerfÜgung D'PGE 2 Daten si am Géigesaz zu enger leschter Etude vun deem kee inhibitory Effet vun PGE 2 op Fierkel gastric H, K-ATPase [29] gemellt huet . Differenzen an der konkreter ATPase assay an datt Etude benotzt kënne fir dës Ënnerscheeder Kont. Zanter ML3000 an arachidonic Seier sinn anionic amphiphiles, hir inhibitory Auswierkunge vun spezifesch Interaktioune mat H Resultat hätt, K-ATPase subunit bindend Siten, oder vu manner-spezifesch hydrophobic Interaktioune mat H, K-ATPase-verbonne microsomal Membran Fetten, oder eng Kombinatioun vun d'reversibility vun ML 3000 inhibition vun H, K-ATPase Aktivitéit kënschtlech, vun Dorënner 2B gewisen, Kontraster mat de Mënscherechter vun H, K-ATPase inhibition vun agesprong benzimidazoles wéi omeprazole oder lansoprazole zwee Facteuren. VerfÜgung.

• CD44 /CD24 Expression zu onbekannt gastric Kriibs: eng Retrospektiv analysis
• Relatioun tëscht postprandial Ännerungen am härzwierksam lénks ventricular Funktioun, Zocker a Insulin Konzentratioune, gastric emptying, an satiety an gesond subjects