Inhibiciju aktivnosti želučane H, K-ATPaze želučanim epitelnih stanica IL-8 sekrecija je pirolizina derivata ML 3000

Inhibiciju aktivnosti želučane H, K-ATPaze i želučanom epitelnih stanica IL-8 sekrecija je pirolizina derivata ML 3000 pregled apstraktna pregled Pozadina
ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-klorofenil ) -7-fenil-2,3-dihidro-1H-pirolizin-5-il] octena kiselina) je inhibitor ciklooksigenaze i 5-lipoksigenaze in vitro i pokazuje kao obećavajući novi nesteroidnim protuupalnim lijekom (NSAID). Za razliku od konvencionalnih NSAID koji su povezani s želučanog ulcerogenu efekata, ML 3000 uzrokuje malu ili nikakvu štetu na želučane sluznice, iako je znatno deprimira sintezu prostaglandina u želucu.
Metode
Kao dio napora da razjasni mehanizme na kojima se temelji na želudac štede svojstva ML 3000, studirao smo učinke ML 3000 na H, K-ATPaze aktivnost in vitro, na kiselom akumulacije u izoliranim želuca parijetalni stanice, a na sekreciju IL-8 u želucu epitelnih stanica u kulturi. pregled Rezultati
SCH28080 osjetljiv H, K-ATPaze u visoko pročišćeni svinjskih želučanih mikrosomima je ovisno o dozi inhibiran ML 3000 (IC 50 = 16,4 uM). Inhibicija je reverzibilan i neosjetljivi na ML 3000 zakiseljavanje u rasponu pH 2.0-8.0. U zečjih želučanih parijetalnih stanica, pregled ML 3000 nakupljanje inhibirati ovisno o dozi histamina stimulirane kiselina (IC 50 = 40 uM) i nakupljanje forskolin-stimulirana kiselina (IC 50 = 45 uM). Konačno, u humanog želučanog adenokarcinoma (AGS) stanica, ML 3000 inhibirati ovisno o dozi i osnovica i IL-1β-stimulirane (20 ng /ml) IL-8 sekrecija sa IC 50-0,46 uM i 1.1 uM respektivno.
Zaključak
podaci pokazuju da ML 3000 utječe kiseline sekretorni mehanizmi nizvodno od cAMP mobilizacije inducirane histaminom aktivacijom H 2 receptora, koja je izravno inhibira H, specifične aktivnosti K-ATPaze, te da osnovni želučanog epitela stanice IL-8 inhibiciju izlučivanje može biti posredovan ML 3000 inhibicijom 5-lipoksigenaze aktivnosti. Zaključimo da su ti inhibitorski podaci funkcije želuca može podlogu želučanog štede svojstva ML 3000.
Pozadina pregled farmakoloških svojstava nesteroidnih protuupalnih lijekova (NSAID), proizlaze iz njihovog suzbijanje sinteze prostaglandina iz arahidonske kiseline [1] , Inhibicija želučane prostaglandina sinteza prati međutim smanjenom želučane sluznice protok krvi, uz prateću osjetljivost sluznice na topičke ozljeda različitim iritansa [2]. Obećavajući farmakološka strategija kako bi se izbjegle želučane komplikacije NSAID uprave usmjeren je na istodoban ciklooksigenaze i inhibiciju 5-lipoksigenaze, s ciljem suzbijanja sintezu leukotrien. 5-lipoksigenaze pretvara arahidonske kiseline u leukotriene, među kojima je leukotrien B4 je hemotaktički za leukocite, te time doprinosi upalnom mehanizmu koji dovode do gastrointestinalnih čireva [3]. Pirolizina derivata ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-klorofenil-il) -7-fenil-2,3-dihidro-1H-pirolizin-5-il] octena kiselina) je inhibitor i ciklo-oxygenase i 5-lipoksigenaze in vitro [4, 5], a pokazuje obećanje kao roman NSAID. ML 3000 smanjuje želučane prostaglandin E2 sinteze u želucu štakora i krvi, iako je značajna inhibicija sinteze želuca ili krvi leukotrien B4 nije otkriven [6]. Ono što je najvažnije, ML 3000 nema nikakvog utjecaja na leukocita prianjanje u mezenteričkih venula, i ne uzrokuje želučane sluznice ozljede [6]. Netlogu U životinjskim modelima, ML 3000 je utvrđeno da je farmakološki benigni. Prema tome, spoj nije utjecao na aktivnost štakora lokomotornu ili heksobarbital inducirana snom imali kardiovaskularnih ili respiratorne učinak u štakora i pasa, je bez utjecaja na neuromuskularni funkcije kod mačaka i uzrokuje niti oštećenja želuca ni peristaltičke poremećaj [7]. ML 3000 evocirani slabu spasmogenic odgovor u ileuma zamorca i uzrokuje slab prolazno smanjivanje urina kod štakora [7]. Genotoksičnosti studije pokazuju da ML 3000 nema utjecaja na genske mutacije frekvencija u bakterijama ili stanicama sisavaca, na sintezu nepredviđeni DNA ili o učestalosti kromosomskih aberacija u stanicama koštane srži štakora [8]. 14C-označeni ML 3000 distribucije i sekrecijske studije kod štakora pokazuju enterohepatičku cirkulaciju i glukuronid konjugaciju ML 3000 [9].
Farmakološki profil ML 3000 kao proučavana u životinjskim modelima prikazuje protuupalno, analgetik, antipiretik, Antihistaminski i antiaggregative aktivnost pri dozi koja ne izaziva oštećenje želuca [4, 10]. Akutne i kronične protuupalna svojstva ML 3000 ispitivani su u induciranom edem šape modelu štakora [11] pokazuju da iako su indometacin nešto je potentan kao protuupalno sredstvo, ne gastrointestinalnih oštećenja zabilježen je sa ML 3000 do 100 mg /kg /d po, ​​dok je ulcerogenu doze (UD 50) za indometacin je 7 mg /kg /d po pregled želučane čireve izazvanog NSAR značajno ograničava korisnost tih lijekova. Jasno, kombinacija anti-upalni i želučanih svojstvima štede izloženih ML 3000 čini ovaj spoj atraktivan kandidat za daljnja proučavanja. Dva želučane sluznice funkcije koje igraju važnu ulogu u želučane ulceracije su sekreciju kiseline i lučenje interleukina-8. inhibitori izlučivanja kiseline su među visoko propisane lijekove, što je odraz fiziološke poslovica "bez kiseline, bez čira". Farmakološka i patofiziološki prekršio želučane sluznice prepreka za sigurnosno difuziju HCl dovodi do brze erozije želučanog epitela jednoslojne i posljedičnog ulceracije sluznice. Inhibicija sekrecije kiseline antagonizmom na parijetalne stanice histaminskog H2 receptora (cimetidin), ili izravnim kovalentne derivatizacijom i inaktivacije želučanog protonske pumpe (omeprazol, lansoprazola, rabeprazola esomeprazola, itd) je rutina za poboljšanje i promociji zarastanja želuca čira na želucu. Tako, želučani štede učinci ML 3000 se mogu odnositi na izlučivanja kiseline inhibicije spoja.
Komplementarna želučani učinak poštede ML 3000 može uključivati ​​moduliranje želučane sekrecije proupalnog citokina IL-8. ozljeda želučane aspirin inducirana je da je to povezano s povećanom antralnog proizvodnju IL-8 [12]. Ulcerogene bakterija Helicobacter pylori pregled je pokazala da se poveća brzina i amplitude sekrecije IL-8 i in vitro i in vivo [13-15] i za povišenje IL-8 ekspresije gena [16]. Slični IL-8 prosecretory efekti se vide kao rezultat stimulacije IL-1 želučanog epitela. Usporedba učinaka ML 3000 i drugih nesteroidnih protuupalnih lijekova na ovim želučane sekrecije aktivnosti mogu rasvijetliti mehanizam kojim ML 3000 sprječava stvaranje želučanih oštećenja sluznice.
Kako bi se razjasnila mehanizme na kojima se temelji na želudac poštedu svojstva ML 3000, mi istraživali učinak ML 3000 dva želučane sluznice sekretornih funkcije s uloge u ulcerogenesis: sekreciju solne kiseline i sekreciju upalnih citokina interleukina-8. Naši podaci pokazuju da ML 3000 inhibira sirovog želučane mikrosomalne H, K-ATPaze, inhibira histaminom stimulirane zakiseljavanje u zečjih želučanih parijetalnih stanica, inhibira IL-1 p-stimulirane IL-8 sekreciju ljudskih epitelnim stanicama želuca.
Metode
Reagensi
ML 3000 i ZD-2138 osigurana su Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazol se pruža AstraZeneca R & D, Molndal, Švedska, SCH 28.080 je iz Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC došao iz Tocris Cookson, Inc., ballwin, MO i NS 398 je došao iz Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arahidonsku kiselinu, indometacin, acetil salicilna kiselina, naproksen, PGE 2, leukotrieni B4 i D4 i IL-1β su svi stečene od Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimetil sulfoksid (Sigma-Aldrich) se koristi za otapanje ML3000, SCH28080, ZD-2138, NS TEDBC, 398 i indometacin. Acetilsalicilna kiselina i naproksen otopi se u puferu za ispitivanje ATPaze (vide infra pregled). Arahidonske kiseline i PGE 2 otopi se u apsolutnom etanolu i omeprazol se otopi u metanolu. Leukotrieni B4 i D4 su dobavljeni otopi u 70:30 mješavinu metanola i 17 mM amonijevog acetata. IL-1β je otopljen u fiziološkoj otopini puferiranoj fosfatom (pH 7.4), 0.1% w /v goveđeg serumskog albumina. Svi testovi koji koriste ove spojeve uključene odgovarajuće kontrole otapala, a sve otapala su prisutni u koncentracijama u manje od 1% w /v u konačnom ispitnoj smjesi, pregled priprave H, K-ATPaze pregled Mikrosomalna želučane H, K-ATPaze je dobiven iz svinjskim želučane sluznice homogenatima strane diferencijala i /Ficoll centrifugiranja gradijentu saharoze kao što je ranije [17] što je opisano. Ovaj pripravak daje relativno tešku (7% Ficoll /1,1 M saharoze sučelje) GII mikrosomalne frakcije, koja nije pokazivala latenciju aktivnosti K-ATPaze, a koji se sastoji ~ 90% H, K-ATPazu, na temelju densitometrijom od 94 kDa vrpca SDS-PAGE analize. GII Mikrosomi su pohranjeni na -80 ° C u 20% glicerol.
H, K-ATPaze testu pregled ATP hidrolitičko djelovanje svinjskih želučanih mikrosomima se kvantificira kao ortofosfata oslobađanje iz supstrata ATP pomoću kolorimetrijskog malahitnog zelenila postupka [18] , ATPaze Ispitivanja su provedena u mikropločama s 96 jamica. Ukratko, 100 ul /jamici pufera za ispitivanje (60 mM Tris-HCl, pH 7.4, 2 mM MgCh 2, 1 mM EGTA, ± 7.5 mM KCl, ± 50 um SCH28080), koji sadrži 80 ng mikrosomalne H, K-ATPaze ML 3000 (10 -9 M 10 -4 M) ili drugim spojevima, i 1 mM ATP je inkubirana 30 minuta na 37 ° C. Enzimska aktivnost se zaustavi dodatkom (45 ul /jažica) kolorimetrijsko reagensa (0,07% malahitnog zelenila, 3.7 NH ​​ 2SO 4, 2,27% amonij molibdat tetrahidrata, 0.134% Tween-20). Nakon 10 sekundi, obojena rekacija je razvijena dodatkom (45 ul /jažici) i 15% natrijev citrat. Nakon 45 minuta na sobnoj temperaturi, apsorbancija jažice na 570 nm je mjerena pomoću čitača mikroposuda.
Za mjerenje učinaka ML 3000 zakiseljavanja na ATPaze inhibicije ML 3000 alikvot (10 mM u 5 mM Tris-HCl) su titriran do pH vrijednosti u rasponu od 2,0 do 7,4 za 30 min. Želučani Mikrosomi suspendirane u normalnim ATPaze test puferu na pH 7.4 se inkubira 30 minuta s zakiseljenim alikvota ML 3000 (16.6 uM krajnje ML 3000 koncentracija), a zatim ATPazna aktivnost je mjerena kao što je gore opisano. Za mjerenje omeprazol inhibiciju aktivnosti H, K-ATPaze, želučanih mikrosomi su suspendirane u puferu za ispitivanje ATPaze na pH 6.1 se inkubira 30 minuta s različitim koncentracijama omeprazola. Omeprazol zakiseljavanja do pH 6.1 je potrebno za formiranje inhibitorne tiol-reaktivnim sulfoksid intermedijera [19]. Želučani Mikrosomi su onda preneseni u standardnom puferu za ispitivanje ATPaze na pH 7,4, a aktivnost ATPaze se mjeri kao što je gore opisano. Specifičnu aktivnost H, K-ATPaze se izračunava kao razlika u mikrosomalnog ATPaze aktivnosti u prisutnosti i odsutnosti specifičnih reverzibilnog želučane H, K-ATPaze inhibitora SCH28080, i izražena je kao μmoles P i /mg proteina /h. H, K-ATPaze svježe pripremljeni svinjskih želučanih mikrosoma u rasponu od 140 do 170 μmoles P I /mg proteina /h. Grafički prikaz podataka pokazuje postotak inhibicije aktivnosti H, K-ATPaze, kao funkcija koncentracije spoja. Pregled primarne stanične Priprava pregled želucu parijetalne stanice su izolirane iz novozelandskim bijelim štakorima prema pronazom /kolagenazom digestijom fundusa sluznice slijedi strane obogaćivanju stanica na diskontinuirane Nycodenz gradijentima kao što je ranije [20] što je opisano. Stanični preparati parijetalni sadržavala približno 10 7 stanica /želucu, 80 ± 5% bilo parijetalnim stanicama na osnovi imunocitokemiju s H, K-ATPaze-specifičnim monoklonskim antitijelima kiselina nakupljanja ispitivanju.
Aminopyrine akumulacije u parijetalni stanica je određena u 96 filter ploča sa Durapore membranama, kao što je prethodno opisano [21]. Ukratko, stanice su prethodno inkubirane sa [ 14C] -aminopyrine i 100,000 stanica /200 ul po jamici inkubirane su sa ili bez testnih spojeva tijekom 15 minuta prije inkubacije tijekom daljnjih 30 minuta, u odsutnosti ili prisutnosti 100 uM histamina ili 100 uM forskolin. Sva određivanja provedena su četiri puta. Bazalna akumulacija aminopyrine je određen kao aminopyrine akumulacije u netretiranim stanicama oduzme od nakupljanja u prisutnosti KSCN (refleksija nespecifičnim izotopa hvatanje). Grafički prikaz podataka pokazuje postotak inhibicije akumulacije histaminom stimulirane kiseline u stanicama kao funkcija koncentracije spoja.
Želučani adenokarcinoma
humanog želučanog adenokarcinoma (AGS stanice, ATCC CRL 1739.), drži se u AGS mediju (Hamov F-12, 10% fetalnog goveđeg seruma, 100 jedinica /ml penicilina G, 0.25 ug /ml amfotericina B, 100 ug /ml streptomicina) na 37 ° C u CO s 5% 2/95% zrak inkubator i korišteni između pasaža 42 i 56. za studije sekrecije IL-8, AGS stanice su stavljene u pločice s 96 jamica (50.000 stanica /100 ul /jažici) i ostavi se primiti tijekom 18 sati na 37 ° C u 5% CO 2/95% zraka. Stanice su zatim inkubirane sa test spojem u prisutnosti i odsutnosti IL-1 tijekom 24 h, za koje vrijeme su uzorci medija uklonjen iz jažica i pohranjeni na -70 ° C. IL-8 koncentracija u uzorcima određeni su imunoenzimski testu (ljudski IL-8 ELISA set Duo razvoj sustava, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Grafički prikaz podataka pokazuje postotak inhibicije nestimulirane ili stimulirane sekrecije IL-8, kao funkcija koncentracije spoja pregled Statistička analiza pregled Svi eksperimenti su provedeni na najmanje tri puta. točke podataka u svakom testu predstavljaju sredstva za mjerenje iz uzoraka trostrukih. Točke podataka koji odgovaraju tri parametra logističke jednadžbe su prikazani u grafu kao krivulja sigmoidal dozu pomoću prizme statističku (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Polu-maksimalno inhibitorne koncentracije (IC 50) i IK 50 95 intervali% pouzdanosti (CI) i izračunate su pomoću prizme. Podaci točke ne priliči tri parametra logističku jedan su izvučeni kao jednostavne point-to-point krivulje. Standardna pogreška je mjera odstupanja koristi za barove pogreškama u grafičkom prikazu podaci

• CD44 /CD24 ekspresije u recidivom raka želuca: retrospektivna analysis
• Odnos postprandijalne promjena srčanih funkcija lijeve klijetke, glukoze i koncentracija inzulina, pražnjenjem želuca, i sitosti u zdravom subjects