Ингибирование желудочной H, активность K-АТФазы и желудка эпителиальных клеток секреции IL-8 по пирролизин производное ML 3000

Ингибирование желудочной H, активность K-АТФазы и желудочный эпителиальных клеток секреции IL-8 с помощью пирролизин производной ML 3000
Аннотация
Справочная
ML 3000 ([2,2-диметил-6- (4-хлорфенил) -7-фенил-2,3-дигидро-1Н-пирролизин-5-ил] уксусной кислоты) является ингибитором обоих циклооксигеназы и 5-липоксигеназы в пробирке, и показывает обещание как новый нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП). В отличие от обычных НПВС, которые связаны с желудочным ульцерогенных эффектов, ML 3000 вызывает практически никакого повреждения слизистой оболочки желудка, даже если он значительно угнетает синтез простагландинов желудка.
Методы
В рамках усилий, чтобы прояснить механизмы, лежащие в основе желудка щадящие свойства из ML 3000, мы изучали влияние ML 3000 на H, активность K-АТФазы в пробирке, на накопление кислоты в изолированных париетальных клеток желудка, и на секрецию IL-8 с помощью желудочного эпителиальных клеток в культуре.
Результаты
SCH28080 чувствительных H, активность K-АТФазы в высокоочищенного свиных желудочных микросомах была дозозависимо ингибировалась ML 3000 (IC <югу> 50 = 16,4 мкМ). Ингибирование было обратимым, и нечувствительна к ML 3000 закисление в интервале рН 2,0-8,0. У кролика париетальных клеток желудка,
ML 3000 накопление дозозависимо ингибировал гистамин-стимулированной кислоты (IC <югу> 50 = 40 мкМ) и накопление форсколин-стимулированной кислоты (IC <югу> 50 = 45 мкМ). И, наконец, в человеческой аденокарциномы желудка (AGS) клеток, ML 3000 дозозависимо ингибирует как базовой линии, и ИЛ-1β-стимулированных (20 нг /мл), ИЛ-8 секрецию с IC <суб> 50s 0,46 мкМ и 1,1 мкМ соответственно.
Заключение
Эти данные указывают на то, что ML 3000 влияет на кислотно-секреторные механизмы вниз по течению от мобилизации цАМФ, индуцированные активацией Н <к югу> 2 рецепторов гистамина, что он непосредственно ингибирует H, K-АТФазы удельную активность и что базовый уровень желудочной эпителиальной клетки ИЛ-8 ингибирование секреторной может быть опосредовано ML 3000 ингибирование 5-липоксигеназы. Мы пришли к выводу, что эти ингибирующие данные функции желудка может лежать в основе желудочных щадящие свойства ML 3000.
Справочная информация
фармакологические свойства нестероидных противовоспалительных препаратов (НПВП) возникают в результате их подавления синтеза простагландинов из арахидоновой кислоты [1] , Ингибирование желудочной простагландинов синтезов сопровождается снижением однако слизистой оболочки желудка кровоток, с сопутствующей чувствительности слизистой оболочки к местному травм с помощью различных раздражающих веществ [2]. Перспективным фармакологическая стратегия, чтобы избежать желудочных осложнений введением НСПВС фокусируется на одновременных циклооксигеназы и ингибирование 5-липоксигеназы, с целью подавления синтеза лейкотриена. 5-липоксигеназы преобразует арахидоновую кислоту в лейкотриены, среди которых лейкотриен В4 хемотактичен для лейкоциты и тем самым вносит свой вклад в воспалительные механизмы, приводящие к желудочно-кишечных язв [3]. Пирролизин производное ML 3000 ([2,2-диметил-6- (4-chlorophen-ил) -7-фенил-2,3-дигидро-1Н-пирролизин-5-ил] уксусной кислоты) является ингибитором обоих циклооксигеназы и 5-липоксигеназы в пробирке [4, 5], а также показывает посыл как роман НПВС. ML 3000 снижает желудочный простагландина Е2 синтеза в желудке и крови у крыс, хотя значительное ингибирование желудочной или лейкотриенов крови синтеза B4 не был обнаружен [6]. Самое главное, что ML 3000 не оказывает никакого влияния на соблюдение лейкоцитарной в мезентериальных венул, и не вызывает повреждения слизистой желудка [6].
В моделях на животных, ML 3000 было установлено, что фармакологически доброкачественными. Таким образом, соединение не влияет на двигательную активность крысы или гексобарбитал индуцированных сна, не имели сердечно-сосудистые или респираторные эффекты у крыс и собак, было без влияния на нервно-мышечную функцию у кошек, и вызвал ни желудка, ни повреждений перистальтического нарушение [7]. ML 3000 вызвала слабый спазмогенное реакцию у подвздошной кишки морской свинки, и вызвало небольшое кратковременное снижение выхода мочи у крыс [7]. Генотоксичность исследования указывают на то, что ML 3000 не имеет никакого влияния на частоты мутаций генов в бактерии или клетках млекопитающих, на синтезе внеплановой ДНК, или по частоте хромосомных аберраций в клетках костного мозга крыс [8]. 14С-меченого ML 3000 распределения и выделительные исследования на крысах показывают энтерогепатическую циркуляцию и глюкуронид спряжения ML 3000 [9].
Фармакологический профиль ML 3000, как изучали на животных моделях показывает противовоспалительное, анальгезирующее, жаропонижающее, противоасматическое и антиагрегационной активность в дозе, которая не вызывает повреждений желудка [4, 10]. Острые и хронические противовоспалительные свойства ML 3000 изучали в адъювантной модели индуцированного отека лапы у крыс [11], показывают, что, хотя Индометацин несколько более активным, как противовоспалительное средство, никаких повреждений желудка с ML 3000 не было отмечено до 100 мг /кг /сут перорально, в то время как ульцерогенного доза (УД <суб> 50) для индометацина 7 мг /кг /сут перорально
зва желудка, индуцированного НПВС значительно ограничивает полезность этих препаратов. Очевидно, что сочетание противовоспалительных и желудочных свойства щадящих проявляемых ML 3000 делает это соединение привлекательным кандидатом для дальнейшего изучения. Две функции слизистой оболочки желудка, которые играют важную роль в язвой желудка являются секрецию кислоты и секрецию интерлейкина-8. секреторных ингибиторы Кислотные являются одними из самых высокооплачиваемых предписанных лекарств, что отражает физиологическую поговорку "Нет кислоты, нет язвы". Фармакологическая или патофизиологическая НЕСОБЛЮДЕНИЕМ из слизистой оболочки желудка барьеров для обратной диффузии HCl приводит к быстрой эрозии желудка эпителиального монослоя и, как следствие изъязвления слизистой оболочки. Ингибирование секреции кислоты путем антагонизма в отношении рецептора париетальных клеток гистамин H2 (циметидин) или путем непосредственного ковалентного дериватизации и инактивации желудочного протонного насоса (омепразол, лансопразол, рабепразола, эзомепразол и т.д.) является обычным делом для мелиоративных и содействия заживлению желудка язвы. Таким образом, желудочный щадящие эффекты ML 3000 могут быть связаны с кислотой секреторной ингибирования соединением.
Комплементарной желудочный щадящую эффект ML 3000 может включать в себя модуляцию желудочной секреции провоспалительных цитокинов IL-8. Аспирин-индуцированной травмы желудка Сообщалось, что связано с увеличением антрального производства IL-8 [12]. Ульцерогенное бактерия Helicobacter Pylori
Было показано, что увеличивает скорость и амплитуду секреции IL-8 как в пробирке и в естественных условиях [13-15], и вверх-регулируют экспрессию генов IL-8 [16]. Подобные эффекты ИЛ-8 prosecretory рассматриваются в результате IL-1 стимуляции эпителиальных клеток желудка. Сравнение эффектов ML 3000 и других НПВС на этих желудочных секреторных деятельности может пролить свет на механизм, с помощью которого ML 3000 предотвращает образование слизистой оболочки желудка поражений.
Для того чтобы выяснить механизмы, лежащие в основе желудка щадящие свойства из ML 3000, мы исследовал влияние ML 3000 на двух желудочную секреторной функции с ролями в ульцерогенезе: секреции соляной кислоты и секрецию цитокина интерлейкина-8. Наши данные показывают, что ML 3000 ингибирует свиней желудка микросомальное H, активность K-АТФазы, угнетает гистамин-стимулированной подкисление у кролика париетальных клеток желудка и ингибирует секрецию IL-1-стимулированных IL-8 с помощью эпителиальных клеток желудка человека.
Методы
Реагенты
ML 3000 и ZD-2138 были предоставлены Forest Laboratories, Inc., Нью-Йорк, штат Нью-Йорк, омепразол был обеспечен AstraZeneca R &Amp; D, Гетеборг, Швеция, SCH 28080 был из научно-исследовательского института Schering-Plough, Kenilworth, Нью-Джерси, TEDBC пришли из Tocris Куксон, Inc., Ballwin, MO, и NS 398 пришли из Cayman Chemicals, Inc., Анн-Арбор, Мичиган. Арахидоновая кислота, индометацин, ацетилсалициловая кислота, напроксен, ПГЕ <суб> 2, лейкотриены B4 и D4, и IL-1β были приобретены у Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Диметилсульфоксиде (Sigma-Aldrich) использовали для солюбилизации ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, и индометацин. Ацетилсалициловую кислоту и напроксен растворяли в АТФазы буфере для анализа (смотри ниже
). Арахидоновой кислоты и ПГЕ <суб> 2 растворяли в абсолютном этаноле, и омепразол, растворяли в метаноле. Лейкотриены В4 и D4 поставлялись растворяют в 70:30 смеси метанола и 17 мМ ацетата аммония. ИЛ-1β, растворяли в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4), 0,1% вес /об бычьего сывороточного альбумина. Все анализы с использованием этих соединений включены соответствующие средства управления растворитель и все растворители, присутствовали при концентрациях менее 1% вес /объем в конечной смеси для анализа.
Приготовление H, K-АТФазы
микросомального желудочной H, K-АТФазы получали из свиных гомогенатах слизистой оболочки желудка с помощью дифференциального и сахарозы /Ficoll шаг центрифугирования в градиенте, как описано ранее [17]. Этот препарат дает относительно тяжелый (7% Ficoll /1,1 М интерфейс сахарозы) GII микросомальной фракции, которая не показала задержку активности K-АТФазы, и который включал ~ 90% H, K-АТФазы, основанный на денситометрии в 94 кДа с помощью анализа SDS-PAGE. GII микросомах хранили при -80 ° С в 20% глицерине.
H, K-АТФазы пробирного
АТФ гидролитическая активность свиных желудочных микросомах определяли количественно, как ортофосфат высвобождения из АТФ субстрата с использованием колориметрического малахитовый зеленый процедуры [18] , АТФазы Анализы проводили в 96-луночных микропланшетов. Вкратце, 100 мкл /лунку аналитического буфера (60 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 2 мМ MgCl <суб> 2, 1 мМ EGTA, ± 7,5 мМ КСl, ± 50 мкМ SCH28080), содержащий 80 нг микросомальной H, K-АТФазы , ML 3000 (10 -9 М до 10 -4 М) или других соединений, и 1 мМ АТФ инкубировали в течение 30 мин при 37 ° с. Ферментативная активность останавливали добавлением (45 мкл /лунку) колориметрических реагента (0,07% малахитовый зеленый, 3,7 NH <суб> 2SO <суб> 4, 2,27% молибдата аммония тетрагидрат, 0,134% твин-20). Через 10 секунд, реакция цвета была разработана путем добавления (45 мкл /лунку) в 15% цитрата натрия. Через 45 мин при комнатной температуре, оптическую плотность лунок при 570 нм измеряли в ридере для микропланшетов.
Для измерения эффектов ML 3000 подкисления на ингибирование АТФ-азы, ML 3000 аликвоты (10 мМ в 5 мМ Трис-HCl) были титруют до рН от 2,0 до 7,4 в течение 30 мин. Желудочные микросомы суспендировали в стандартном буфере АТФазы анализа при рН 7,4, инкубировали в течение 30 мин с подкисленной аликвоты ML 3000 (16,6 мкМ конечной концентрации ML 3000), а затем активность АТФазы измеряли, как описано выше. Для измерения омепразол ингибирование активности H, K-АТФазы, желудочных микросомах взвешенных в АТФазы аналитическом буфере при рН 6,1, инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями омепразола. Омепразол подкисление до рН 6,1 было необходимо, чтобы обеспечить образование ингибирующей тиолом реактивная сульфоксида промежуточной [19]. Желудочные микросомы затем переносили в стандартный буфер АТФазы анализа при рН 7,4, и активность АТФазы измеряли, как описано выше. Удельная активность H, K-АТФазы рассчитывали как разницу в микросомальной АТФазы деятельности в присутствии и в отсутствие специфического обратимой желудочной H, K-АТФазы ингибитор SCH28080, и выражали как мкмолей P <суб> I /мг белка /ч. H, K-АТФазы свежеприготовленные свиней желудка микросомах колебалась от 140 до 170 мкмоль P <югу> I /мг белка /ч. Графическое изображение данных показывает процент ингибирования активности H, K-АТФазы в зависимости от концентрации соединения.
Первичка Приготовление
париетальных клеток желудка были изолированы от новозеландских белых кроликов проназой /коллагеназой перевариванием фундальном слизистой оболочки с последующим обогащением клеток на прерывистых градиентах Nycodenz, как описано ранее [20]. Теменные препараты клеток содержала приблизительно 10 7 клеток /желудка, из которых 80 ± 5% были париетальных клеток, основанные на иммуногистохимии с H, K-АТФазы специфичных моноклональных антител.
Acid Накопительный пробирной
накопление аминопирин в теменной клетки оценивали в 96-луночных фильтровальных пластин с Durapore мембран, как описано ранее [21]. Вкратце, клетки предварительно инкубируют с [ 14C] -aminopyrine, а затем 100000 клеток /200 мкл на лунку инкубировали без или с тестируемыми соединениями в течение 15 минут до инкубации в течение еще 30 мин в отсутствие или в присутствии 100 мкМ гистамина или 100 мкМ форсколина. Все измерения проводили в четырех повторностях. Базальный накопление аминопирин определяли как аминопирин накопление в необработанных клетках, вычитаемых из накопления в присутствии KSCN (отражение неспецифического изотопа улавливающего). Графическое изображение данных показывает процент ингибировани гистамин-стимулированной накоплением кислоты клетками в зависимости от концентрации соединения.
Желудочный клетки аденокарциномы желудка человека
клетки аденокарциномы (AGS клетки, АТСС CRL 1739), были сохранены в АГС среда (Хэма F-12, 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 ед /мл пенициллина G, 0,25 мкг /мл амфотерицина в, 100 мкг /мл стрептомицина) при 37 ° с в 5% CO <суб> 2, /95% воздуха в инкубатор и использовали между проходами 42 и 56. для изучения секреции IL-8, AGS клетки высевали в 96-луночные планшеты (50000 клеток /100 мкл /лунку) и позволяли закрепляться в течение 18 часов при температуре 37 ° с в 5% CO <суб> 2, /95% воздуха. Затем клетки инкубировали с тестируемыми соединениями в присутствии и в отсутствие IL-1 в течение 24 ч, при которых образцы временные среды были удалены из лунок и хранили при -70 ° С. Концентрации IL-8 образцов определяли с помощью иммуноферментного анализа (IL-8 Duo-Set система разработки ELISA Человек, R &Amp; D Systems Inc., Миннеаполис, штат Миннесота). Графическое изображение данных показывает процент ингибирования нестимулированных или стимулированной секреции IL-8 в зависимости от концентрации соединений
Статистический анализ
Все эксперименты проводились по крайней мере, три раза. точек данных в каждом анализе представляют собой измерительные средства из трех образцов. Точки данных облегающие трехпараметрическоеописание логистическое уравнение были рентгенографического в качестве сигмоидального кривых доза-реакция с использованием статистического пакета Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Полумаксимальной ингибирующие концентрации (IC <суб> 50) и IC <суб> 50 95% доверительный интервал (ДИ) были рассчитаны с использованием Prism. Точки данных не облегающие три параметра логистическую а были нарисованы в виде простых кривых точка-точка. Стандартная ошибка была мерой дисперсии используется для погрешностями в графическое изображение данных
Результаты
Эффекты ML 3000 на H, K-АТФазы
желудочной H, активность K-АТФазы дозозависимо ингибировалась ML 3000, с полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC <суб> 50) 16,4 мкМ (CI = 6,84 - 39,3 мкмоль) (Фигура 1А). Ингибирующая активность ML 3000, сравнивали с классического ингибитора протонного насоса (ИПН), замещенный бензимидазол омепразол. На фиг.1В показан эффект омепразола на активность H, K-АТФазы при аналитических условиях, идентичных тем, которые на фиг.1А; вычисленная IC <суб> 50 для омепразола составила 1,7 мкМ (CI = 0,26 - 11,3 мкм). Эти данные показывают, что ML 3000 значительно менее эффективен, чем омепразол по отношению к желудочной H, K-АТФазы ингибирующая активность, по крайней мере, в условиях данного конкретного анализа в пробирке при указанных условиях. Для того, чтобы определить, отображается ли ML 3000 сравнимые свойства кислотно-активации, полумаксимальную ингибирующую концентрацию ML 3000 титровали до различного значени х рН и измеряли влияние на активность H, K-АТФазы. Как показано на рисунке 2А, ​​подкисление ML 3000 не оказало существенного влияния на его H, K-АТФазы ингибиторной профиль. Эти данные указывают на то, что ML 3000, в отличие от омепразола, не требует подкисления для индукции ингибирующей активности. Учитывая, что ИЦП являются необратимыми ингибиторами активности H, K-АТФазы, ковалентного связывания с каталитическим -субъединицы, мы попытались определить, был ли ML 3000 ингибирование H, K-АТФазы обратимым или необратимым. Желудочный Н, K-АТФазы-обогащенные микросом обрабатывали максимально ингибирующей концентрацией ML 3000 и затем разводили большим избытком буфера, чтобы уменьшить концентрацию 3000 мл из 100 мкМ до 3,3 мкМ. Результаты, показанные на фигуре 2В, показали, что разбавление ML 3000 восстанавливается активность H, K-АТФазы, и совместимы с ML 3000 ингибирования H, активности K-АТФазы в обратимо, то есть., ML 3000 не ковалентно дериватизации либо субъединицу желудочной H, K-АТФазы, по крайней мере, в условиях настоящего теста ин витро активности H, K-АТФазы. В этом отношении, ML 3000 кинетически похож на SCH28080, специфического обратимым ингибитором желудочной H, K-АТФазы. Рисунок 1 Зависимое от дозы ингибирование активности H, K-АТФазы ML 3000 с помощью (а) и омепразолом (B). (А). Желудочные микросомы суспендировали в буфере для анализа АТФазы при рН 7,4, инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями ML 3000 и активности АТФазы Затем измеряли при рН 7,4. Полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC 50) для ML 3000, составил 16,4 мкМ (CI = 6.84-39.3 мкМ). (В). Желудочные микросомы суспендировали в буфере для анализа АТФазы при рН 6,1, инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями омепразола, а затем переносили в стандартный буфер АТФазы анализа при рН 7,4 для измерения активности АТФазы. IC 50 для омепразола составил 1,1 мкМ (CI = 0,26 - 11,3 мкм). Эти данные показывают,-пропускные пункты среднее ± С.Э. из трех независимых анализов в каждом из которых SCH28080 чувствительных АТФазы активность измеряли в трех экземплярах. Рисунок 2
Эффект ML 3000 подкислением на активность H, K-АТФазы (А), и ML 3000 ингибирование H, активность K-АТФазы обратима (в). (А) ML 3000 аликвоты (10 мМ в 5 мМ Трис-HCl) титруют до рН от 2,0 до 7,4 в течение 30 мин перед добавлением к стандартному АТФазы аналитического буфера (рН 7,4), содержащем желудочных микросомах. (B) Желудочные микросомы обрабатывали максимально ингибирующей концентрации (100 мкМ) ML 3000. микросомальной суспензию затем разводили большим избытком буфера, чтобы уменьшить концентрацию 3000 мл из 100 мкМ до 3,3 мкМ. В обоих случаях (А) и (В), данные-точки показывают среднее ± С.Э. из трех независимых анализов в каждом из которых SCH28080 чувствительных АТФазы активность измеряли в трех экземплярах.
арахидоновой кислоты и простагландина Е <суб> 2 (ПГЕ <суб> 2) также дозозависимо ингибировал H, активность K-АТФазы, с IC <суб> 50 мкМ 16.7 (ДИ = 8,9 - 31,5 мкм) и 15 мкМ (CI = 3,96 - 57,3 мкМ) соответственно (рис 3A и 3B). Так как ML 3000 также показывает ингибирование 5-липоксигеназы, мы изучали эффекты двух ингибиторов липоксигеназы на микросомальной H, активность K-АТФазы. На фиг.4А показано, что 2- (1-тиенил) этил 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), мощный ингибитор 5-, 12- и 15-lipoxygenses, ингибируется микросомальной H, K-АТФазы с IC <суб> 50 из 22,6 мкМ (CI = 6,3 - 81,2 мкм). В отличие от этого, 5-липоксигеназы-специфический ингибитор 6 - ((3-фтор-5- (метокси-3,4,5,6-тетрагидро-2Н-пиран-4-ил) фенокси) метил) chinolin (ZD-2138 ) имели минимальный эффект на Н, активность K-АТФазы (~ 20% ингибирования при 10 -5 М) (фиг.4В). Эти данные согласуются с желудочной микросомальной 12- и 15-липоксигеназы, играющих роль в H, активация K-АТФазы, или при непосредственном взаимодействии с TEDBC H, K-АТФазы субъединицы фермента изменение конформации и, следовательно, активность. Очевидно, что обе интерпретации носят провокационный характер и заслуживают дальнейшего изучения. Рисунок 3 Ингибирование H, активность K-АТФазы арахидоновой кислотой (А) и простагландин Е 2 (В). Желудочные микросомы суспендировали в буфере для анализа АТФазы при рН 7,4, инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями арахидоновой кислоты или PGE2 и активности АТФазы Затем измеряли при рН 7,4. IC 50 для арахидоновой кислоты составила 16,7 мкМ (CI = 8,9 - 31,5 мкм), а IC50 дл PGE2 составляла 15 мкМ (CI = 3,96 - 57,3 мкм). Эти данные показывают,-пропускные пункты среднее ± С.Э. из трех независимых анализов в каждом из которых SCH28080 чувствительных АТФазы активность измеряли в трех экземплярах. Рисунок 4
ингибирование активности H, K-АТФазы в 5-, 12- и 15-липоксигеназы ингибитор TEDBC (А), и 5-липоксигеназы ингибитор ZD-2138 (В). Желудочные микросомы суспендировали в буфере для анализа АТФазы при рН 7,4, инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями TEDBC или ZD-2138 и активности АТФазы Затем измеряли при рН 7,4. В (А), данные-точки показывают среднее SCH28080-чувствительный АТФазы, измеренный в трех экземплярах в одном из трех независимых анализов; Типичные данные показаны. Информационно-точки в (B) показывают среднее значение ± С.Э. из трех независимых анализов в каждой из которых была измерена SCH28080 чувствительных АТФазы в трех экземплярах.
Для сравнения ингибирующее действие H, K-АТФазы ML 3000 из с другими НПВС, мы измерили эффекты ацетилсалициловой кислоты, NS 398, напроксен, индометацин и на активность протонного насоса. Все четыре НПВС были без ингибирующих эффектов на микросомальной H, активность K-АТФазы в концентрации до 10 -4 М (10 -3 М для ацетилсалициловой кислоты) (рис 5A, 5B, 5C и 5D). Индометацин Ранее сообщалось, ингибируют желудочную H, K-АТФазы при несколько более высокой концентрации (К <югу> I = 0,67 × 10 -3 М) [22]. Наши данные четко дифференцировать ML 3000 от других НПВС с точки зрения тормозящего действия на желудочную H, активность K-АТФазы; механистической основой для этой разницы, а потенциал корреляции с наблюдаемым желудка щадящие свойство ML 3000, по-прежнему предстоит исследовать. Рисунок 5 Влияние ацетилсалициловой кислоты, NS 398, напроксен, индометацин и на активность H, K-АТФазы. Желудочные микросомы суспендировали в буфере для анализа АТФазы при рН 7,4, инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями ацетилсалициловой кислоты, NS 398, напроксен, или индометацин и активности АТФазы Затем измеряли при рН 7,4. Эти данные показывают,-пропускные пункты среднее SCH28080-чувствительный АТФазы, измеренный в трех экземплярах в одном из трех независимых анализов; Типичные данные представлены в каждом конкретном случае.
И наконец, для того, чтобы установить, является ли ингибирование желудочной H ML 3000, K-АТФазы отражение эффекты, получавшей соединение по предположительных функциональных лейкотриенов метаболических путей, присутствующих в свиных желудочных микросомах, мы изучали эффекты лейкотриенов B4 и D4 на активность H, K-АТФазы. проблемы растворимости препятствует изучению концентрации LTB4 или LTD4 больше, чем 1 мкМ. Как показано на фиг.6А и 6В, ни лейкотриенов проявлял ингибиторной активностью в отношении H, K-АТФазы при физиологических концентрациях (10 -9-10 -8 М); только при нефизиологических концентрациях, превышающих 10 -7 М был там любое значительное ослабление активности H, K-АТФазы. Рисунок 6 Эффекты лейкотриенов B4 и D4 на SCH28080-чувствительной H, K-АТФазы удельной активности. Желудочные микросомы суспендировали в буфере для анализа АТФазы при рН 7,4, инкубировали в течение 30 мин с различными концентрациями лейкотриенов B4 или лейкотриена D4 и активности АТФазы Затем измеряли при рН 7,4. Эти данные показывают,-пропускные пункты среднее ± С.Э. из трех независимых анализов в каждой из которых была измерена SCH28080 чувствительных АТФазы в трех экземплярах.
Эффекты ML 3000 на накопление кислоты желудочного обкладочных клеток гистамин-стимулированной
ML 3000 дозозависимо ингибировал гистамин-стимулированной (100 мкМ) кислоты накопление кроличьими париетальных клеток желудка, с полумаксимальной ингибирующей концентрации (IC <суб> 50) 40 мкМ (рис 7А). ML 3000 также дозозависимо ингибировал форсколин-стимулированной (100 мкМ) кислоты накопление кроликов париетальных клеток желудка, с IC <суб> 50 ~ 45 мкм (рис 7б). Эти данные указывают на то, что ML 3000 влияет на механизмы париетальных клеток кислотно-секреторной вниз по течению от мобилизации цАМФ, вызванного гистамином H <югу> 2 активации рецептора. Эти данные согласуются с ML 3000 ингибирования секреции обкладочных клеток кислоты в результате прямого взаимодействия ML 3000 с желудочной H, K-АТФазы. Тем не менее, наблюдающееся расхождение между ML 3000 IC <суб> 50 в микросомальных везикул (15 мкМ) и в изолированных клетках теменных (40-45 мкМ) предполагает, что ML 3000 доступ к внутриклеточным H, K-АТФазы отделение в париетальных клетках может быть замедлен проницаемостью ограничений на плазматической мембране. В качестве альтернативы, ML 3000 может подвергаться цитоплазматических метаболических изменений, которые ограничивают ингибиторной активности соединения. Рисунок 7 ML 3000 ингибирует накопление кислоты в кроличьи париетальных клеток желудка. (А) Зависимое от дозы ингибирование ML 3000 (100 мкМ) накопление гистамина-стимулированной кислоты кроличьими париетальных клеток желудка (IC50 = 40 мкМ). (В) Зависимое от дозы ингибирование ML 3000 (100 мкМ) накопления форсколин-стимулированной кислоты кроличьими клетками желудочных париетальных (IC50 = 45 мкМ). Эти данные показывают,-пропускные пункты среднее ± С.Э. из четырех независимых анализов в каждом из которых измеряли накопление кислоты в париетальных клеток в двух повторах.
Наконец, как было обнаружено с микросомальной H, K-АТФазы, другими НПВС, такие как ацетил салициловая кислота, напроксен и NS 398 (до концентрации 10 -4 М) не оказывал влияния на накопление кислоты с помощью изолированных кролика париетальных клеток (данные не показаны)
эффекты ML 3000 на ИЛ-1β-индуцированной секреции IL-8 в аденокарциномы желудка человека (AGS) клетки
в соответствии с исходными условиями, AGS клеток (5 × 10 4 в 100 мкл культуральной среды) секретируется ИЛ-8 в течение 24 ч до концентрации ~ 225 пг /мл среды. Когда стимулируются IL-1 (1 нг /мл), клетки секреции AGS IL-8 в течение 24 ч была увеличена ~ 27 раз, до концентрации ~ 6000 пг /мл. ML 3000 ингибировал как базовой линии, и-1 β стимулированный IL секрецию IL-8, с IC <суб> 50х 0,46 мкМ (CI = 0,09 - 2,4 мкМ) и 1,1 мкМ (CI = 0,52 - 2,2 мкМ), соответственно (фиг.8А и 8В ). Рисунок 8 Влияние ML 3000 на ИЛ-1β-индуцированной секреции IL-8 в человеческой аденокарциномы желудка (AGS) клеток. ML 3000 ингибировал как базовой линии (А) и ИЛ-1β-стимулированных (B) IL-8 секрецию, с IC50s 0,46 мкМ (CI = 0,09 - 2,4 мкМ) и 1,1 мкМ (CI = 0,52 - 2,2 мкМ), соответственно. 5-липоксигеназы-специфический ингибитор ZD-2138 показал дозозависимое ингибирование исходных уровней АГС клеточной секреции IL-8 (С), при IC50 58 нМ (CI = 15,6 - 218 нм) и минимальным воздействием на АГС клеток IL-1 β -stimulated секрецию ИЛ-8 (D). Эти данные показывают,-пропускные пункты среднее ± С.Э. из трех независимых анализов в каждой из которых были измерены IL-8 концентрации в трех экземплярах.
5-липоксигеназы-специфический ингибитор (ZD-2138), который был без влияния на микросомальной H, активность K-АТФазы, показал от дозы ингибирование базовой линии AGS клеток секреции IL-8 (рис 8в), с IC <суб> 50 из 58 нМ (CI = 15,6 - 218 нМ). ZD-2138 показал минимальное влияние на ИЛ-1β-стимулированную секрецию IL-8 клетками AGS (рис 8D). Н, К-АТФазу ингибирование ML 3000, который мы показали в настоящем исследовании, не лежать в основе IL-8 ингибирование секреторной в этой модели, так как иммуноцитохимия с H, K-АТФазы-специфическое моноклональное антитело не проявляет H, K-АТФазы выражение в AGS клетках (данные не показаны).
Обсуждение
Данное исследование содержит информацию о влиянии ML 3000 по различным аспектам физиологии желудка, связанной с ульцерогенеза. Были исследованы три экспериментальные модели функции желудка; высокоочищенного функционал Н, К-АТФазы (протонного насоса), выделенные из слизистой оболочки желудка боен свиней, изолированных кроличьих париетальных клеток желудка и желудочных клеток аденокарциномы человека в культуре. В первой модели, ML 3000 ингибирует протонный насос с IC <подразделам> 50 16,4 мкМ. Ингибитор протонного насоса (ИПН) омепразол отображается ИМС <суб> 50 1,1 мкм в том же самом анализе. В отличие от ИПН, ингибирующая активность ML 3000 не зависит от рН и была обратимой. Селективные и неселективные НПВП не показали H, ингибирующей активностью в отношении K-АТФазы в том же самом анализе. Во второй модели, ML 3000 подавлял гистамин и накопление форсколин-стимулированной кислоты (СК <суб> 50 = 40 и 45 мкм), что согласуется с ингибированием протонного насоса ML 3000. В третьей модели ML 3000 ингибировал как базовой линии, и-1 β стимулированный IL секреции интерлейкина-8 из клеток AGS (IC <суб> 50 = 0,46 и 1,1 мкМ соответственно), хотя последний эффект проявляется не связан с 5-липоксигеназы ингибиторной активностью из ML 3000 (Рисунок 8D).
Опубликовано IC <суб> 50 для омепразола по отношению к желудочным интервале терапевтической активности протонного насоса от 470 нм до 36 мкм в зависимости от условий анализа [23-25]. Для других ИПН, picoprazole IC <суб> 50 составляет 2 мкМ [26], рабепразол IC <суб> 50 составляет 72 нМ [23], и лансопразол IC <суб> 50 составляет 2,1 мкМ [27]. Широкий диапазон опубликованных PPI IC <суб> 50 значений для микросомальной H, K-АТФазы отражает механистическую необходимость соединения подкисления, чтобы позволить образование тиол-реактивным сульфоксида промежуточного продукта, который затем необратимо derivatizes H, K-АТФазы α субъединицей остатков цистеина ведущих для ингибирования фермента.
Эти данные ML 3000 также резко контрастирует с омепразола ингибирования накопления кислоты в изолированных париетальных клеток. Кислотные секреторную емкость IC <суб> 50s (в изолированных париетальных клеток) ингибиторов протонной помпы (ИПП), такие как омепразол, рабепразол и лансопразол находятся в диапазоне 59 до 360 нм [27, 28]. Чем больше потенции ИПН в контексте кислоты мощностью секреторной по сравнению с микросомальной H, K-АТФазы (ИК <суб> 50s в пределах от 72 нМ до 40 мкМ) отражает более полной активации кислоты ИПН в изолированной обкладочных клеток канальцев, чем имеет место в в микросомальных пробирке анализы при рН 6,1 или выше.
PGE <суб> 2 данных, в отличие от предыдущего исследования, в котором нет тормозящее действие ПГЕ <суб> 2 на свиной желудка H, K-АТФазы не сообщалось [29] , Различия в конкретном анализе АТФазы, используемого в этом исследовании можно объяснить это несоответствие. Так как ML3000 и арахидоновая кислота являются анионные амфифильные, их ингибирующее действие может быть результатом специфических взаимодействий с H, K-АТФазы субъединиц сайты связывания, или из менее специфических гидрофобных взаимодействий с Н, K-АТФазы, ассоциированных с микросомальной мембранных липидов, или их комбинации оба фактора.
обратимости ML 3000 ингибирования активности H, K-АТФазы в пробирке, как показано на рисунке 2B, контрастирует с необратимости ингибирования H, K-АТФазы путем замещенных бензимидазолов, таких как омепразол или лансопразол.

• CD44 /CD24 экспрессия в рецидивами рака желудка: ретроспективный анализ
• Взаимосвязь между постпрандиальной изменениями в сердечной концентрации функции левого желудочка, глюкозы …