Die Hemmung der Magen-H, K-ATPase-Aktivität und Magen-epithelialen Zell-IL-8-Sekretion durch die pyrrolizin Derivat ML 3000

Hemmung der Magensäure-H, K-ATPase-Aktivität und Magen Epithelzelle IL-8-Sekretion durch die pyrrolizin Derivat ML 3000
Zusammenfassung
Hintergrund
ML 3000 ([2,2-dimethyl-6- (4-chlorphenyl ) -7-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] -essigsäure) ist ein Inhibitor sowohl von Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase in vitro und zeigt Versprechen als neuartige nicht-steroidale entzündungshemmende Medikament (NSAID). Im Gegensatz zu herkömmlichen NSAIDs, die mit Magengeschwürwirkungen verbunden sind, ML 3000 bewirkt, dass keine oder nur geringe Schäden an der Magenschleimhaut, obwohl es Magen-Prostaglandin-Synthese signifikant senkt.
Methoden
Im Rahmen der Bemühungen um Mechanismen zu klären, die Magen-zugrunde liegenden verschonen Eigenschaften von ML 3000, haben wir die Auswirkungen von ML 3000 auf H, K-ATPase-Aktivität in vitro untersucht, auf Säure Akkumulation in isolierten Belegzellen des Magens, und auf IL-8-Sekretion von Magen-Epithelzellen in Kultur.
Ergebnisse
SCH28080 empfindlichen H, K-ATPase-Aktivität in hochgereinigte Schwein Magen-Mikrosomen wurde dosisabhängig von ML 3000 (IC 50 = 16,4 &mgr; M) gehemmt. Die Hemmung war reversibel und unempfindlich 2,0-8,0 3000 Versauerung im pH-Bereich bis ML. In Kaninchen Belegzellen des Magens,
ML 3000 dosisabhängig gehemmt Histamin-stimulierte Säure Akkumulation (IC 50 = 40 &mgr; M) und Forskolin-stimulierte Säure-Akkumulation (IC 50 = 45 &mgr; M). Schließlich in der menschlichen Adenokarzinom des Magens (AGS) Zellen, ML 3000 dosisabhängig hemmten sowohl der Basislinie und IL-1β-stimulierte (20 ng /ml) IL-8-Sekretion mit IC 50s von 0,46 &mgr; M und 1,1 &mgr; M auf.
Fazit
Die Daten zeigen, dass ML 3000 Säure-sekretorischen Mechanismen hinter cAMP Mobilisierung von Histamin-H 2-Rezeptor-Aktivierung, dass es direkt hemmt H, K-ATPase-spezifische Aktivität, und dass die Basis Magenepithelzellen Zelle induziert beeinflusst IL-8 sekretorischen Hemmung kann durch ML 3000 Hemmung der 5-Lipoxygenase-Aktivität vermittelt werden. Wir schließen daraus, dass diese Magen-Funktion hemmenden Daten, die die Magen-Sparing Eigenschaften von ML 3000.
Hintergrund
Die pharmakologischen Eigenschaften von nichtsteroidalen Antirheumatika zugrunde liegen können (NSAIDs) ergeben sich aus ihrer Unterdrückung der Prostaglandin-Synthese von Arachidonsäure [1] . Die Hemmung der Magen-Prostaglandin-Synthese wird jedoch begleitet von Durchblutung der Magenschleimhaut verringert wird, bei gleichzeitiger Schleimhaut Empfindlichkeit auf topische Verletzung durch eine Vielzahl von Reizstoffen [2]. Eine vielversprechende pharmakologische Strategie Magen Komplikationen der NSAID Verabreichung zu vermeiden, konzentriert sich auf die gleichzeitige Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase-Hemmung, mit dem Ziel der Leukotrien-Synthese zu unterdrücken. 5-Lipoxygenase wandelt Arachidonsäure in Leukotriene, unter denen Leukotrien B4 für Leukozyten chemotaktische und trägt dadurch zur Entzündungsmechanismen zu Magen-Darm-Geschwüren führen [3]. Die pyrrolizin Derivat ML 3000 ([2,2-dimethyl-6- (4-Chlorophen-yl) -7-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] -essigsäure) ist ein Inhibitor von sowohl Cyclooxygenase und 5-Lipoxygenase in vitro [4, 5], und zeigt versprechen als eine neue NSAID. ML 3000 reduziert Magen-Prostaglandin E2-Synthese in Rattenmagen und Blut, obwohl signifikante Hemmung der Magen-oder Blut Leukotrien B4-Synthese nicht nachgewiesen wurde [6]. Am wichtigsten ist, ML 3000 keinen Einfluss auf die Leukozytenadhärenz in mesenterialen Venolen hat, und verursacht keine Schädigung der Magenschleimhaut [6].
In Tiermodellen ML 3000 wurde festgestellt, pharmakologisch gutartig sein. So hat die Verbindung nicht Ratte Bewegungsaktivität oder hexobarbital-induzierten Schlaf, hatte keine Herz-Kreislauf- oder Atemwegs Wirkungen bei Ratten und Hunden beeinflussen, ohne wurde auf neuromuskuläre Funktion bei Katzen beeinflussen und verursacht weder Magen-Schäden noch peristaltische Störung [7]. ML 3000 rief eine schwache spasmogenic Reaktion in Meerschweinchen-Ileum, und führte zu einer geringen Reduzierung von Transienten in Harnausscheidung bei Ratten [7]. Genotoxizität Studien zeigen, dass ML 3000 keine Auswirkungen auf die Gen-Mutation Frequenzen in Bakterien oder Säugetierzellen hat, auf unplanmäßige DNA-Synthese oder auf der Frequenz von Chromosomenaberrationen in Ratten-Knochenmarkzellen [8]. 14C-markierten ML 3000 Verteilung und Ausscheidungsorgane Studien an Ratten zeigen enterohepatischen Kreislauf und Glukuronidkonjugation von ML 3000 [9].
Das pharmakologische Profil von ML 3000, wie in Tiermodellen untersucht zeigt entzündungshemmend, schmerzlindernd, fiebersenkend, antiasthmatic und antiaggregative Aktivität bei einer Dosis, die keine Magenschäden verursacht [4, 10]. Die akuten und chronischen entzündungshemmenden Eigenschaften von ML 3000 studierte in der adjuvanten-induzierten Rattenpfote Ödeme Modell [11] zeigen, dass, obwohl Indometacin ist etwas stärker als entzündungshemmendes Mittel, kein Magen-Schäden mit ML 3000 bis zu 100 festgestellt wurde mg /kg /d po, ​​während die ulcerogene Dosis (UD 50) für Indometacin 7 war mg /kg /d po
Magen durch NSAIDs induzierten Ulzera schränkt erheblich den Nutzen dieser Medikamente. Offensichtlich ist die Kombination von entzündungshemmenden und Ulcus Sparing Eigenschaften zeigten von ML 3000 macht diese Verbindung zu einem attraktiven Kandidaten für weitere Untersuchungen. Zwei Magenschleimhaut Funktionen, die eine wichtige Rolle bei Magengeschwürbildung spielen, sind die Säuresekretion und Interleukin-8-Sekretion. Säure sekretorischen Inhibitoren gehören zu den am höchsten verschriebene Medikamente, was die physiologischen Sprichwort "keine Säure, kein Geschwür". Pharmakologische oder pathophysiologische Brechen der Magenschleimhaut Barrieren Diffusion von HCl führt zu einer schnellen Erosion der Magenepithelzellen einschichtigen und damit Ulzerationen der Schleimhaut zurück. Die Hemmung der Säuresekretion durch Antagonismus an der Belegzellen Histamin-H2-Rezeptor (Cimetidin) oder durch direkte kovalente Derivatisierung und Inaktivierung des Magen-Protonenpumpe (Omeprazol, Lansoprazol, Rabeprazol, Esomeprazol, etc.) ist Routine für Verbesserung und Förderung der Heilung von Magen Geschwüren. Somit kann die Magen Sparing Wirkung von ML 3000 kann durch die Verbindung zu Säure sekretorischen Hemmung bezogen werden.
Ein komplementärer Magen Sparing Wirkung von ML 3000 Modulation der Magensekretion des pro-inflammatorischen Zytokins IL-8 beinhalten. Aspirin-induzierte Magenverletzungen wurde berichtet mit erhöhter antral Produktion von IL-8 [12] in Verbindung gebracht werden. Die ulcerogene Bakterium Helicobacter pylori
hat sich gezeigt, die Geschwindigkeit und die Amplitude der IL-8-Sekretion in vitro und in vivo [13-15] zu erhöhen und zu hochregulieren IL-8-Genexpression [16]. Ähnliche IL-8 prosecretory Effekte werden als Ergebnis der IL-1β-Stimulation von Magen-Epithelzellen erkennen. Vergleich der Auswirkungen von ML 3000 und andere NSAIDs auf diesen Magen-sekretorischen Aktivitäten können den Mechanismus aufzuklären, mit dem ML 3000 die Bildung von Läsionen der Magenschleimhaut verhindert.
Um Mechanismen zur Klärung der Magen zugrunde liegenden Eigenschaften von ML 3000 sparsam, wir die Wirkung von ML 3000 auf zwei Magenschleimhaut sekretorischen Funktionen untersucht mit Rollen in ulcerogenesis: Sekretion von Salzsäure und Sekretion des inflammatorischen Cytokins Interleukin-8. Unsere Daten zeigen, dass ML 3000 Schwein Magen-Mikrosomen-H, K-ATPase-Aktivität hemmt, Histamin-stimulierte die Versauerung in Kaninchen Magenparietalzellen hemmt und hemmt die IL-1β-stimulierte IL-8-Sekretion durch menschliche Magenepithelzellen.
Methoden
Reagenzien
ML 3000 und ZD-2138 wurden von Forest Laboratories, Inc., New York, NY zur Verfügung gestellt, Omeprazol von Astrazeneca R &Verfügung gestellt wurde; D, Mölndal, Schweden, SCH 28080 wurde von Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, kam TEDBC von Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, und NS 398 kamen von Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arachidonsäure, Indometacin, Acetylsalicylsäure, Naproxen, PGE 2, Leukotriene B4 und D4 und IL-1β alle wurden von Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO erworben. Dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich) wurde verwendet ML3000 zu solubilisieren, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398 und Indomethacin. Acetylsalicylsäure und Naproxen wurden in ATPase-Assay-Puffer (siehe unten
) gelöst. Arachidonsäure und PGE 2 wurden in absolutem Ethanol gelöst und Omeprazol wurde in Methanol gelöst. Leukotriene B4 und D4 wurden in einer 70:30 Mischung aus Methanol und 17 mM Ammoniumacetat gelöst geliefert. IL-1β wurde in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (pH 7,4), 0,1% w /v Rinderserumalbumin gelöst. Alle Assays unter Verwendung dieser Verbindungen enthalten geeigneten Lösungsmittelkontrollen, und alle Lösungsmittel in Konzentrationen vorhanden waren, weniger als 1% w /v in der endgültigen Untersuchungsmischung.
Herstellung von H, K-ATPase
Mikrosomale Magen-H, K-ATPase Magenschleimhaut Homogenate durch differentielle und Sucrose /Ficoll Gradientenzentrifugation Schritt wurde aus Schweine hergestellt, wie zuvor beschrieben [17]. Dieses Präparat ergibt sich eine relativ schwere (7% Ficoll /1,1 M Saccharose-Schnittstelle) GII mikrosomalen Fraktion, die keine Latenzzeit von K-ATPase-Aktivität zeigte, und die umfasst ~ 90% H, K-ATPase, basierend auf Densitometrie eines 94 kDa-Bande durch SDS-PAGE-Analyse. GII Mikros bei -80 ° C in 20% Glycerin gelagert wurden.
H, K-ATPase-Assay
ATP hydrolytische Aktivität von Schweinemagenmikros wurde als Ortho Freisetzung von Substrat ATP quantifiziert ein kolorimetrisches Malachitgrün Verfahren unter Verwendung von [18] . ATPase-Assays wurden Mikrotiterplatten in 96-Well durchgeführt. Kurz gesagt, 100 &mgr; l /Vertiefung Assaypuffer (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCl, ± 50 uM SCH28080), 80 ng mikrosomalen H enthaltende, K-ATPase ML 3000 (10 -9 M bis 10 -4 M) oder andere Verbindungen, und 1 mM ATP wurde 30 min bei 37 ° C inkubiert. Die enzymatische Aktivität wurde durch Zugabe gestoppt (45 &mgr; l /Vertiefung) von kolorimetrischen Reagens (0,07% Malachitgrün, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% Ammoniummolybdat-Tetrahydrat, 0,134% Tween-20). Nach 10 Sekunden wurde die Farbreaktion durch Zugabe (45 &mgr; l /Vertiefung) von 15% Natriumcitrat entwickelt. Nach 45 Minuten bei Raumtemperatur, die Absorption der Vertiefungen bei 570 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät gemessen wurde.
Um die Auswirkungen der ML 3000 Versauerung auf ATPase-Hemmung, ML 3000 Aliquots (10 mM in 5 mM Tris-HCl) gemessen wurden im Bereich von 2,0 bis 7,4 für 30 min auf pH-Werte titriert. Gastric in Standard ATPase-Assay-Puffer suspendiert Mikrosomen bei pH 7,4 wurden 30 min mit angesäuerten Aliquots von ML 3000 (16,6 &mgr; M final ML 3000-Konzentration) und dann ATPase-Aktivität inkubiert wurde gemessen, wie oben beschrieben. Omeprazol Hemmung der H, K-ATPase-Aktivität, Magen-Mikrosomen in ATPase-Assay-Puffer bei pH 6,1 suspendiert zu messen wurden für 30 min mit unterschiedlichen Konzentrationen von Omeprazol inkubiert. Omeprazole Ansäuern auf pH 6,1 war notwendig, die Bildung der inhibitorischen thiolreaktive Sulfoxid zu ermöglichen Zwischen [19]. Die Magen-Mikrosomen wurden dann bei pH Standard ATPase Assay-Puffer übertragen 7,4 und ATPase-Aktivität wurde gemessen, wie oben beschrieben. Spezifische H, K-ATPase-Aktivität als Differenz in mikrosomalen ATPase-Aktivitäten in der Gegenwart und Abwesenheit des spezifischen reversiblen Magen H berechnet wurde, K-ATPase-Inhibitor SCH28080, und wurde ausgedrückt als umol P i /mg Protein /hr. H, K-ATPase-Aktivität von frisch präparierten Schweinemagenmikros reichten von 140 bis 170 &mgr; mol P i /mg Protein /h. Graphische Darstellung der Daten zeigt die prozentuale Hemmung der H, K-ATPase-Aktivität als Funktion der Verbindungskonzentration.
Primary Cell Preparation
Magenparietalzellen von New Zealand White-Kaninchen durch Pronase /Kollagenase-Verdau von Fundus Schleimhaut isoliert wurden, gefolgt durch Anreicherung von Zellen auf diskontinuierlichen Nycodenz-Gradienten, wie zuvor beschrieben [20]. Parietal Zellpräparate enthalten etwa 10 7 Zellen /Magen, von denen 80 ± 5% Belegzellen auf Immunzytochemie mit H, K-ATPase-spezifischen monoklonalen Antikörper.
Säureansammlung Assay
Aminopyrin Akkumulation in parietalen Basis waren Zellen wurden in 96-Well-Filterplatten mit Durapore-Membranen untersucht, wie zuvor beschrieben [21]. Kurz gesagt, wurden Zellen vorinkubiert mit [ 14C] -Aminopyrin und dann 100.000 Zellen /200 &mgr; l pro Vertiefung mit oder ohne Testverbindungen für 15 Minuten vor der Inkubation für weitere 30 min in Abwesenheit oder Gegenwart von 100 uM Histamin inkubiert wurden oder 100 &mgr; M Forskolin. Alle Bestimmungen wurden in vierfacher Ausfertigung durchgeführt. Basal Aminopyrin Akkumulation wurde wie Aminopyrin Akkumulation in unbehandelten Zellen von Akkumulation in Gegenwart von KSCN (Reflexion von unspezifischen Isotop Trapping) subtrahiert bestimmt. Graphische Darstellung der Daten zeigt die prozentuale Hemmung der Histamin-stimulierte Säure Akkumulation von den Zellen als eine Funktion der Verbindungskonzentrationen.
Gastric Adenokarzinomzellen
menschlichen Magen Adenokarzinomzellen (AGS-Zellen, ATCC CRL 1739) wurden in AGS beibehalten Medium (Hams F-12, 10% fötalem Rinderserum, 100 Einheiten /ml Penicillin G, 0,25 ug /ml Amphotericin B, 100 ug /ml Streptomycin) bei 37 ° C in einer 5% CO 2/95% Luft Inkubator und verwendet, um zwischen Durchgängen 42 und 56. für Studien der IL-8-Sekretion wurden AGS-Zellen in 96-well-Platten ausplattiert (50.000 Zellen /100 &mgr; l /Vertiefung) und für 18 Stunden bei 37 ° C in 5% CO anhaften 2/95% Luft. Die Zellen wurden dann mit Testverbindungen in Gegenwart und in Abwesenheit von IL-1β für 24 Stunden, zu welcher Zeit Proben von Medium inkubiert wurden aus den Vertiefungen entfernt und bei -70 ° C gelagert. IL-8-Konzentrationen der Proben durch enzyme-linked immunosorbent assay (Human IL-8-Duo-Set ELISA-Entwicklungssystem, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN) bestimmt. Graphische Darstellung der Daten zeigt die prozentuale Inhibierung der nichtstimulierten oder stimulierten IL-8-Sekretion als Funktion der Verbindungskonzentrationen
Statistical Analysis
Alle Experimente wurden mindestens dreimal durchgeführt. Datenpunkte in jedem Assay repräsentieren Meßmittel aus dreifachen Proben. Datenpunkte Einpassen eines drei-Parameter logistischen Gleichung wurden als sigmoidale Dosis-Wirkungs-Kurven unter Verwendung des Prism-Statistikpaket (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) graphisch dargestellt. Die halbmaximale Hemmkonzentration (IC 50) und IC 50 95% Konfidenzintervall (CI) wurden ebenfalls Prism berechnet. Die Datenpunkte keine drei Parameter logistische Montage wurden als einfache Punkt-zu-Punkt-Kurven gezeichnet. Standardfehler das Maß der Abweichung war für Fehlerbalken in grafische Darstellung verwendet Daten
Ergebnisse

• CD44 /CD24 Expression bei rezidivierendem Magenkrebs: eine retrospektive analysis
• Beziehung zwischen postprandialen Veränderungen in der Herz Funktion des linken Ventrikels, Glukose und Insulin-Konzentrationen, die Magenentleerung und Sättigung bei gesunden subjects