L'inibizione della gastrica H, K-ATPasi attività e delle cellule epiteliali gastriche IL-8 secrezione dal pyrrolizine derivata ML 3000

Inibizione di gastrica H, K-ATPasi attività gastrica cellule epiteliali IL-8 secrezione dal pyrrolizine derivata ML 3000
Abstract
Background
ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-clorofenil ) -7-fenil-2,3-diidro-1H-pyrrolizine-5-il] acido acetico) è un inibitore della cicloossigenasi sia e 5-lipossigenasi in vitro, e mostra la promessa come nuovo farmaco antinfiammatorio non steroideo (FANS). A differenza dei FANS convenzionali che sono associati con effetti ulcerogeni gastrici, ML 3000 provoca poco o nessun danno alla mucosa gastrica, anche se deprime significativamente la sintesi delle prostaglandine gastriche.
Metodi
Come parte di uno sforzo per chiarire i meccanismi alla base della gastrico risparmiando proprietà di ML 3000, abbiamo studiato gli effetti di ML 3000 su H, K-ATPasi attività in vitro, su l'accumulo di acido nel isolate cellule parietali gastriche, e iL-8 la secrezione da parte delle cellule epiteliali gastriche in coltura.
Risultati
H SCH28080-sensibile, l'attività K-ATPasi in maiale altamente purificata microsomi gastrici è stato dose-dipendente inibita da ML 3000 (IC 50 = 16,4 micron). L'inibizione reversibile, e insensibile a ml 3000 acidificazione nel range di pH 2,0-8,0. Nelle cellule parietali gastriche di coniglio,
ML 3000 istamina stimolata l'accumulo di acido dose-dipendente inibito (IC 50 = 40 micron) e l'accumulo di acido forskolina-stimolata (IC 50 = 45 micron). Infine, in cellule di adenocarcinoma gastrico (AGS), ML 3000 dose-dipendente inibita sia basale e IL-1β-stimolata (20 ng /ml) di IL-8 secrezione con IC 50s di 0,46 mM e 1,1 mM, rispettivamente.
Conclusione
I dati indicano che ML 3000 colpisce meccanismi acido-secretori valle del cAMP mobilizzazione indotta da istamina attivazione H 2 recettore, che inibisce direttamente H, attività specifica K-ATPasi, e che basale gastrica cellule epiteliali IL-8 inibizione secretoria può essere mediato da ML 3000 inibizione dell'attività 5-lipossigenasi. Concludiamo che questi dati inibitori funzionalità gastrica potrebbero essere alla base delle proprietà risparmiatori gastrici di ML 3000.
Sfondo
Le proprietà farmacologiche di farmaci anti-infiammatori non steroidei (FANS) derivano dalla loro soppressione della sintesi delle prostaglandine dall'acido arachidonico [1] . L'inibizione della sintesi delle prostaglandine gastriche è accompagnata però da diminuzione gastrica flusso ematico della mucosa, con concomitante sensibilità mucosa lesioni topico da una varietà di irritanti [2]. Una strategia farmacologica promettente per evitare complicazioni gastriche di somministrazione FANS concentra sulla cicloossigenasi concorrente e inibizione 5-lipossigenasi, con l'obiettivo di sopprimere la sintesi dei leucotrieni. 5-lipossigenasi converte l'acido arachidonico in leucotrieni, tra cui leucotriene B4 è chemiotattico per leucociti e contribuisce a meccanismi infiammatori che portano alle ulcere gastrointestinali [3]. Il pyrrolizine derivata ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-chlorophen-il) -7-fenil-2,3-diidro-1H-pyrrolizine-5-il] acido acetico) è un inibitore di entrambi ciclo-ossigenasi e 5-lipossigenasi in vitro [4, 5], e mostra la promessa come un romanzo FANS. ML 3000 riduce gastrica delle prostaglandine E2 sintesi nello stomaco di ratto e di sangue, anche se significativa inibizione della sintesi B4 gastrica o leucotriene sangue non è stato rilevato [6]. Ancora più importante, ML 3000 non ha alcun effetto sulla leucocitaria rispetto a venule mesenteriche, e non provoca lesioni della mucosa gastrica [6].
In modelli animali, ML 3000 è stato trovato per essere farmacologicamente benigna. Così, il composto non ha influenzato l'attività locomotoria ratto o dormire hexobarbital indotto, non ha avuto effetti cardiovascolari o respiratorie nel ratto e cani, è stato senza influire sulla funzione neuromuscolare nei gatti, e ha causato né danni né gastrico disturbi peristaltica [7]. ML 3000 evocata una risposta spasmogenic debole ileo di cavia, e ha causato una piccola riduzione transitoria diuresi nei ratti [7]. Gli studi di genotossicità indicano che ML 3000 non ha effetti su frequenze mutazione genica in batteri o cellule di mammifero, sulla sintesi di DNA non programmata, o sulla frequenza di aberrazioni cromosomiche in cellule di midollo osseo di ratto [8]. ML 3000 distribuzione e escretori studi marcate con 14C a ratti indicano circolazione enteroepatica e glucuronoconiugazione di ML 3000 [9].
Il profilo farmacologico di ML 3000 come studiato in modelli animali mostra anti-infiammatori, analgesici, antipiretici, l'attività antiasthmatic, e antiaggregative ad una dose che provoca alcun danno gastrico [4, 10]. Le proprietà acute e croniche anti-infiammatoria di ML 3000 studiati nel ratto modello paw edema adiuvante indotta [11] mostrano che, sebbene indometacina è alquanto più potente come un agente anti-infiammatorio, nessun danno gastrico è stato osservato con ML 3000 fino a 100 mg /kg /die po, considerando che la dose ulcerogeno (UD 50) per indometacina era 7 mg /kg /die po
ulcera gastrica indotta da FANS limita notevolmente l'utilità di questi farmaci. Chiaramente, la combinazione di proprietà anti-infiammatorie e gastriche sparing esposti da ML 3000 rende questo composto un candidato per ulteriore studio. Due gastrica funzioni della mucosa che svolgono un ruolo importante nella ulcerazione gastrica sono la secrezione acida e l'interleuchina-8 secrezione. Acid inibitori di secrezione sono tra i farmaci più altamente prescritti, che riflette l'adagio fisiologico "No acido, senza ulcera". sfondamento farmacologico o fisiopatologico delle barriere mucosa gastrica per eseguire diffusione di HCl porta alla rapida erosione del monostrato epiteliale gastrica e conseguente ulcerazioni della mucosa. L'inibizione della secrezione acida da un antagonismo a livello del recettore parietale dell'istamina cella H2 (cimetidina), o da derivatizzazione covalente diretto e l'inattivazione della pompa gastrica protonica (omeprazolo, lansoprazolo, rabeprazolo, esomeprazolo, ecc) è di routine per la selezione e la promozione della guarigione di gastrico ulcere. Così, gli effetti risparmiatori gastrici di ML 3000 possono essere correlati a inibizione della secrezione acida dal composto.
Un complementare effetto risparmio gastrica di ML 3000 può comportare la modulazione della secrezione gastrica della citochina pro-infiammatoria IL-8. lesioni gastriche aspirina indotta stato segnalato per essere associate a un aumento della produzione antrale di IL-8 [12]. Il batterio ulcerogeno Helicobacter pylori
ha dimostrato di aumentare il tasso e l'ampiezza di IL-8 secrezione sia in vitro che in vivo [13-15], e up-regolare IL-8 espressione genica [16]. Simili effetti di IL-8 prosecretory sono visti come risultato della stimolazione IL-1β delle cellule epiteliali gastriche. Confronto degli effetti di ML 3000 e di altri FANS su queste attività di secrezione gastrica può chiarire il meccanismo con cui ML 3000 impedisce la formazione di lesioni della mucosa gastrica.
Per chiarire i meccanismi sottostanti gastrici risparmiando proprietà di ML 3000, abbiamo studiato l'effetto di ML 3000 su due gastriche funzioni secretorie della mucosa con ruoli in ulcerogenesis: secrezione di acido cloridrico, e la secrezione della citochina infiammatoria interleuchina-8. I nostri dati mostrano che ML 3000 inibisce maiale gastrica microsomiale H, K-ATPasi attività, inibisce l'acidificazione istamina stimolata in cellule parietali gastriche di coniglio, e inibisce IL-1β-stimolata la secrezione di IL-8 da parte delle cellule epiteliali gastriche umane.
Metodi
Reagenti
ML 3000 e ZD-2138 sono stati forniti da Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazolo è stato fornito da AstraZeneca R & D, Molndal, Svezia, SCH 28080 era da Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC venuto da Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, e NS 398 è venuto da Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. L'acido arachidonico, indometacina, acido acetilsalicilico, naprossene, PGE 2, leucotrieni B4 e D4, e IL-1β sono stati tutti acquistati da Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimetilsolfossido (Sigma-Aldrich) è stato utilizzato per solubilizzare ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, e indometacina. l'acido acetilsalicilico e naprossene sono stati sciolti in tampone ATPasi (vide infra
). L'acido arachidonico e PGE 2 sono stati sciolti in etanolo assoluto, e omeprazolo è stato sciolto in metanolo. Leucotrieni B4 e D4 sono stati forniti sciolto in una miscela 70:30 di metanolo e acetato di ammonio 17 mM. IL-1β è stata sciolta in tampone fosfato isotonico (pH 7,4), 0,1% w /v di siero albumina bovina. Tutti i saggi che utilizzano questi composti inclusi opportuni controlli con solvente, e tutti i solventi erano presenti a concentrazioni inferiori a 1% w /v nella miscela finale del dosaggio
. Preparazione di H, K-ATPasi
Microsomal gastrica H, K-ATPasi è stato preparato da maiale gastrici omogenati mucose da differenziale e saccarosio /Ficoll passo gradiente di centrifugazione secondo quanto descritto in precedenza [17]. Questa preparazione produce un relativamente pesante (7% Ficoll /1.1 M interfaccia saccarosio) frazione microsomiale GII, che ha mostrato alcuna latenza di attività K-ATPasi, che comportava ~ 90% H, K-ATPasi, sulla base di densitometria di un kDa banda 94 mediante analisi SDS-PAGE. microsomi GII sono stati conservati a -80 ° C in 20% glicerolo.
H, K-ATPasi Assay
ATP attività idrolitica di maiale microsomi gastrici è stato quantificato come la liberazione ortofosfato dal substrato ATP utilizzando una procedura di verde malachite colorimetrico [18] . saggi ATPasi sono state condotte in 96 pozzetti. Brevemente, 100 microlitri /cuscinetto e dosaggio (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, ± 7.5 mM KCl, ± 50 pM SCH28080), contenente 80 ng microsomiale H, K-ATPasi , ML 3000 (10 -9 M a 10 -4 M) o altri composti, e 1 mM ATP è stata incubata per 30 min a 37 ° C. L'attività enzimatica è stato fermato con l'aggiunta (45 ml /pozzetto) di reagente colorimetrico (0,07% verde malachite, 3.7 NH ​​ 2SO 4, 2,27% di ammonio molibdato tetraidrato, 0,134% Tween-20). Dopo 10 secondi, la reazione del colore è stato sviluppato mediante aggiunta (45 ul /pozzetto) di citrato di sodio al 15%. Dopo 45 min a temperatura ambiente, l'assorbanza delle soluzioni a 570 nm è stata misurata in un lettore di micropiastre.
Per misurare gli effetti di ML 3000 acidificazione sull'inibizione della ATPasi, ML 3000 aliquote (10 mM in 5 mM Tris-HCl) erano titolato a pH vanno da 2.0 a 7.4 30 min. microsomi gastrico sospese in tampone ATPasi serie a pH 7,4 sono stati incubati per 30 minuti con aliquote acidificata di ML 3000 (16,6 mM finale ML 3000 concentrazione) e poi ATPasi attività è stata misurata come descritto sopra. Per misurare l'inibizione omeprazolo dell'attività H, K-ATPasi, microsomi gastrici sospese in tampone ATPasi a pH 6,1 sono stati incubati per 30 minuti con concentrazioni variabili di omeprazolo. acidificazione Omeprazolo a pH 6,1 è stato necessario per permettere la formazione del inibitorio solfossido tiolo reattivo intermedio [19]. I microsomi gastriche sono stati poi trasferiti tampone ATPasi standard al pH 7,4, e ATPasi attività è stata misurata come descritto sopra. Specifica attività H, K-ATPasi è stato calcolato come la differenza di attività microsomiale ATPasi in presenza e in assenza dello specifico reversibili H gastrica, K-ATPasi inibitore SCH28080, ed è stata espressa come umoli P i /mg di proteina /hr. H, K-ATPasi attività di maiale appena preparato microsomi gastrici variava da 140 a 170 umoli P I /mg di proteina /hr. rappresentazione grafica dei dati mostra percentuale di inibizione dell'attività H, K-ATPasi in funzione delle concentrazioni di composti.
cellulare primaria Preparazione
cellule parietali gastriche sono stati isolati da coniglio bianco New Zealand da Pronasi /collagenasi digestione della mucosa fundica seguito dall'arricchimento delle cellule su gradiente discontinuo Nycodenz come precedentemente descritto [20]. preparazioni di cellule parietali contenevano circa il 10 7 cellule /stomaco, di cui l'80 ± 5% erano cellule parietali sulla base di immunocitochimica con H, K-ATPasi-anticorpo monoclonale specifico
. Acid accumulo Assay
Aminopirina accumulo in parietale le cellule sono state valutate in 96 piastre filtranti e con membrane Durapore, come descritto in precedenza [21]. Brevemente, le cellule sono state preincubate con [ 14C] -aminopyrine quindi 100.000 cellule /200 pl per pozzetto sono stati incubati senza o con composti di prova per 15 minuti prima di incubazione per altri 30 minuti in assenza o presenza di 100 mM di istamina o 100 micron forskolin. Tutte le determinazioni sono state eseguite in quadruplicato. accumulo aminopyrine basale è stata determinata come accumulo aminopyrine nelle cellule non trattate sottratti accumulo in presenza di KSCN (un riflesso non specifico isotopo trapping). rappresentazione grafica dei dati mostra inibizione percentuale di accumulo di acido istamina-stimolata da parte delle cellule in funzione delle concentrazioni di composti.
cellule Adenocarcinoma gastrico
cellule di adenocarcinoma gastrico umane (cellule AGS, ATCC CRL 1739), sono stati mantenuti in AGS mezzo (di Ham F-12, 10% di siero fetale bovino, 100 unità /ml di penicillina G, 0,25 ug /ml di amfotericina B, 100 ug /ml di streptomicina) a 37 ° C in un CO 5% dell'aria 2/95% incubatore e usati tra i passaggi 42 e 56. per gli studi di IL-8 secrezione, cellule AGS sono state piastrate in piastre da 96 pozzetti (50.000 cellule /100 pl /pozzetto) e lasciate attaccare per 18 ore a 37 ° C in 5% CO 2/95% di aria. Le cellule sono state poi incubate con i composti di prova in presenza e in assenza di IL-1β per 24 ore, in cui campioni di tempo di mezzo sono stati rimossi dai pozzetti e conservati a -70 ° C. IL-8 concentrazioni dei campioni sono stati determinati mediante test ELISA (Human IL-8 Duo-Set sistema di sviluppo ELISA, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN). rappresentazione grafica dei dati mostra inibizione percentuale di non stimolato o stimolato la secrezione di IL-8 in funzione delle concentrazioni di composti
Analisi statistica
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti almeno tre volte.; punti dati in ogni test rappresentano mezzi di misura da campioni in triplicato. I punti dati corrispondono una equazione logistica parametro tre erano rappresentate come curve dose-risposta sigmoidali utilizzando il pacchetto statistico Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). le concentrazioni di Half-massimale inibitorie (IC 50) e IC 50 95 intervalli% di confidenza (IC) sono stati calcolati utilizzando Prism. I punti dati non corrispondono un parametro di tre logistica sono stati disegnati come semplici curve point-to-point. Errore standard era la misura della varianza utilizzato per le barre di errore in rappresentazione grafica dei dati
Risultati
Effetti della ML 3000 su H, K-ATPasi attività
gastrica H, K-ATPasi attività era dose-dipendente inibita da ML 3000, con una concentrazione inibitoria metà-massimale (IC 50) di 16,4 pM (CI = 6.84 - 39.3 mM) (Figura 1A). L'attività inibitoria della ML 3000 è stata confrontata con quella di un inibitore della pompa protonica classica (PPI), la sostituiti benzimidazolo omeprazolo. Figura 1B mostra l'effetto di omeprazolo sull'attività H, K-ATPasi in condizioni di saggio identiche a quelle della figura 1A; l'IC calcolato 50 per l'omeprazolo era di 1,7 micron (CI = ,26-11,3 micron). Questi dati mostrano che ML 3000 è considerevolmente meno potenti omeprazolo rispetto al H gastrica, K-ATPasi attività inibitoria, almeno nel contesto di questo particolare test in vitro in condizioni specificate. Per determinare se ML 3000 visualizzato proprietà acido-attivazione comparabili, una concentrazione inibente la metà-massimale di ML 3000 è stata titolata a diversi pH e gli effetti sull'attività H, K-ATPasi sono stati misurati. Come mostrato in Figura 2A, acidificazione ML 3000 non ha avuto effetto significativo sulla sua H, K-ATPasi profilo inibitorio. Questi dati indicano che ML 3000, in contrasto con omeprazolo, non necessita acidificazione per induzione dell'attività inibitoria. Dato che i PPI sono inibitori irreversibili di attività H, K-ATPasi, covalentemente legandosi alla subunità α catalitica, abbiamo cercato di determinare se ML 3000 inibizione della H, K-ATPasi era reversibile o irreversibile. Gastrica H, K-ATPasi microsomi-arricchiti sono stati trattati con una concentrazione massimo inibitorio di ML 3000 e quindi diluita con un grande eccesso di tampone per ridurre la ML 3000 concentrazione da 100 micron a 3,3 micron. I risultati, illustrati nella Figura 2B, hanno indicato che la diluizione di ML 3000 restaurata attività H, K-ATPasi, e sono coerenti con ML 3000 H inibendo l'attività K-ATPasi in modo reversibile, vale a dire., ML 3000 non lo fa in modo covalente derivatize sia subunità del H gastrica, K-ATPasi, almeno nelle condizioni della presente prova in vitro di attività H, K-ATPasi. A questo proposito, ML 3000 è cinematicamente simile SCH28080, specifico inibitore reversibile gastrica H, K-ATPasi. Figura 1 inibizione dose-dipendente dell'attività H, K-ATPasi by ML 3000 (A) e omeprazolo (B). (UN). microsomi gastrico sospese in tampone ATPasi a pH 7,4 sono stati incubati per 30 minuti con concentrazioni variabili di ML 3000 e ATPasi stata poi misurata a pH 7,4. La concentrazione inibitoria metà-massimale (IC50) per ML 3000 è stato di 16,4 micron (CI = 6,84-39,3 micron). (B). microsomi gastrico sospese in tampone ATPasi a pH 6,1 sono stati incubati per 30 minuti con concentrazioni variabili di omeprazolo, e quindi trasferiti al tampone ATPasi normale a pH 7,4 per la misurazione dell'attività ATPasi. La IC50 per l'omeprazolo era di 1,1 micron (CI = ,26-11,3 micron). I punti dati mostrano S.E. media ± da tre saggi indipendenti in ciascuno dei quali ATPasi attività SCH28080-sensitive è stata misurata in triplicato.
Figura 2 Effetto di ML 3000 acidificazione sull'attività H, K-ATPasi (A), e ML 3000 inibizione H, K-ATPasi attività è reversibile (B). (A) ML 3000 aliquote (10 mM in 5 mM Tris-HCl) sono stati titolati per pH che vanno da 2.0 a 7.4 per 30 minuti prima dell'aggiunta di tampone ATPasi standard (pH 7,4) contenente microsomi gastrici. (B) microsomi gastriche sono stati trattati con una concentrazione massimo-inibitoria (100 mM) di ML 3000. La sospensione microsomiale stata quindi diluita con un grande eccesso di tampone per ridurre la ML 3000 concentrazione da 100 micron a 3,3 micron. In entrambi (A) e (B), i punti dati mostrano media ± S.E. da tre saggi indipendenti in ciascuno dei quali l'attività ATPasi SCH28080 sensibile è stata misurata in triplicato.
L'acido arachidonico e prostaglandine E 2 (PGE 2) anche dose-dipendente inibito H, K-ATPasi attività, con IC 50 di 16,7 micron (CI = 8,9-31,5 micron) e 15 micron (CI = 3,96-57,3 micron), rispettivamente (Figura 3A e 3B). Dal ML 3000 mostra anche l'inibizione 5-lipossigenasi, abbiamo studiato gli effetti di due inibitori della lipossigenasi su microsomiale H, K-ATPasi attività. La figura 4A mostra che 2- (1-tienil) etil 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), un potente inibitore di 5-, 12-, e 15-lipoxygenses, inibita microsomiale H, K-ATPasi attività con un IC 50 di 22,6 micron (CI = 6,3-81,2 micron). Al contrario, la 5-lipossigenasi-inibitore specifico 6 - ((3-fluoro-5- (metossi-3,4,5,6-tetraidro-2H-piran-4-il) fenossi) metil) chinolin (ZD-2138 ) ha avuto un effetto minimo sulla H, K-ATPasi attività (~ 20% di inibizione a 10 -5 M) (Figura 4B). Questi dati sono coerenti con microsomiali gastrico a 12 e 15-lipossigenasi che giocano un ruolo in H, l'attivazione K-ATPasi, o con l'interazione diretta di TEDBC con H, K-ATPasi subunità alterando la conformazione dell'enzima e, quindi, l'attività. Chiaramente, entrambe le interpretazioni sono provocatorie e meritano ulteriori studi. Figura 3 Inibizione di H, K-ATPasi attività da acido arachidonico (A) e prostaglandina E 2 (B). microsomi gastrico sospese in tampone ATPasi a pH 7,4 sono stati incubati per 30 minuti con concentrazioni variabili di acido arachidonico o attività PGE2 e ATPasi stata poi misurata a pH 7,4. IC50 per l'acido arachidonico era 16,7 micron (CI = 8,9-31,5 micron), e la IC50 per PGE2 è stato di 15 micron (CI = 3,96-57,3 micron). I punti dati mostrano S.E. media ± da tre saggi indipendenti in ciascuno dei quali ATPasi attività SCH28080-sensitive è stata misurata in triplicato.
Figura 4 inibizione dell'attività H, K-ATPasi dal inibitore TEDBC 5-, 12-, e 15-lipossigenasi (A), e la 5-lipossigenasi inibitore ZD-2138 (B). microsomi gastrico sospese in tampone ATPasi a pH 7,4 sono stati incubati per 30 minuti con concentrazioni variabili di TEDBC o ZD-2138 e ATPasi stata poi misurata a pH 7,4. In (A), i punti dati mostrano media attività ATPasi SCH28080 sensibili misurata in triplice copia in uno dei tre saggi indipendenti; Dati tipici sono mostrati. I punti di dati in (B) mostrano media ± S.E. da tre saggi indipendenti in ciascuno dei quali l'attività ATPasi SCH28080 sensibile è stata misurata in triplicato.
Al fine di confrontare l'effetto inibitorio H, K-ATPasi di ML 3000 con altri FANS, abbiamo misurato gli effetti dell'acido acetil salicilico, NS 398, naproxene e indometacina sull'attività pompa protonica. Tutti e quattro i FANS sono stati senza effetti inibitori sulla microsomiale H, K-ATPasi attività a concentrazioni fino a 10 -4 M (10 -3 M di acido acetilsalicilico) (Figura 5A, 5B, 5C e 5D). Indometacina è stato precedentemente segnalato per inibire H gastrica, K-ATPasi a un po 'più alta concentrazione (K i = 0.67 × 10 -3 M) [22]. I nostri dati differenziano chiaramente ML 3000 da altri FANS, in termini di effetto inibitorio sulla gastrica H, K-ATPasi attività; la base meccanicistica questa differenza, e il potenziale correlazione con la proprietà gastrico risparmiatore osservato ML 3000, rimangono da investigare. Figura 5 Effetti di acido acetil salicilico, NS 398, naprossene, e indometacina sull'attività H, K-ATPasi. microsomi gastrico sospese in tampone ATPasi a pH 7,4 sono stati incubati per 30 minuti con concentrazioni variabili di acido acetil salicilico, NS 398, naproxene e indometacina e ATPasi stata poi misurata a pH 7,4. I punti dati mostrano media attività ATPasi SCH28080 sensibili misurata in triplice copia in uno dei tre saggi indipendenti; Dati tipici sono mostrati in ogni caso.
Infine, al fine di stabilire se l'inibizione ML 3000 di H gastrica, K-ATPasi riflette gli effetti del composto su percorsi leucotrieni funzionali putative metabolici presenti nel maiale microsomi gastrici, abbiamo studiato gli effetti di leucotriene B4 e D4 sull'attività H, K-ATPasi. problemi di solubilità precluso lo studio delle concentrazioni di LTB4 o LTD4 superiori a 1 micron. Come mostrato nella Figura 6A e 6B, né leucotrieni mostrava alcuna attività inibitoria contro H, K-ATPasi a concentrazioni fisiologiche (10 -9-10 -8 M); solo a concentrazioni non fisiologiche superiori a 10 -7 M c'era alcuna attenuazione significativa dell'attività H, K-ATPasi. Figura 6 Effetti di leucotrieni B4 e D4 su SCH28080 sensibili, attività specifica K-ATPasi. microsomi gastrico sospese in tampone ATPasi a pH 7,4 sono stati incubati per 30 minuti con concentrazioni variabili di B4 leucotrieni o leucotriene D4 e ATPasi stata poi misurata a pH 7,4. I punti dati mostrano S.E. media ± da tre saggi indipendenti in ciascuno dei quali ATPasi attività SCH28080-sensitive è stata misurata in triplicato.
Effetti di ML 3000 sulla accumulo di acido istamina stimolata cellule parietali gastriche
ML 3000 dose-dipendente inibito istamina-stimolata (100 mM) accumulo di acido dalle cellule parietali gastriche coniglio, con una concentrazione inibitoria metà-massimale (IC 50) di 40 pM (Figura 7A). ML 3000 anche dose-dipendente inibito forskolina-stimolata (100 micron) l'accumulo di acido da parte delle cellule parietali gastriche di coniglio, con un IC 50 ~ 45 micron (Figura 7B). Questi dati indicano che ML 3000 colpisce meccanismi acido-secretoria delle cellule parietali a valle del cAMP mobilitazione indotta da istamina H 2 attivazione del recettore. I dati sono coerenti con ML 3000 inibizione della secrezione acida cellula parietale risultante dall'interazione diretta di ML 3000 con la H gastrica, K-ATPasi. Tuttavia, il discepancy tra ML 3000 IC 50 in vescicole microsomiali (15 micron) e nelle cellule parietali isolate (40-45 micron) suggerisce che ML 3000 l'accesso al H intracellulare, vano K-ATPasi delle cellule parietali può essere rallentata da vincoli permeabilità a livello della membrana plasmatica. In alternativa, ML 3000 può essere soggetto a modifiche metaboliche citoplasmatici che limitano la potenza inibitoria del composto. Figura 7 ML 3000 inibisce l'accumulo di acido nelle cellule parietali gastriche di coniglio. (A) inibizione dose-dipendente ML 3000 di (100 mM) di acido accumulo di istamina stimolata dalle cellule parietali coniglio gastrica (IC50 = 40 micron). (B) inibizione dose-dipendente dalla ML 3000 di (100 micron) l'accumulo di acido forskolin-stimolata da parte delle cellule parietali gastriche di coniglio (IC50 = 45 micron). I punti dati mostrano S.E. media ± da quattro saggi indipendenti in ciascuno dei quali l'accumulo di acido in cellule parietali è stata misurata in duplicato.
Infine, come si è trovata con microsomiale H, K-ATPasi, altri FANS come acido acetilsalicilico, naproxen, e NS 398 (fino a Le concentrazioni di 10 -4 M) ha avuto alcun effetto sulla accumulo di acido da parte delle cellule parietali coniglio isolate (dati non riportati)
Effetti della ML 3000 su iL-1β-indotta iL-8 la secrezione di adenocarcinoma gastrico umano (AGS) cellule
in condizioni basali, cellule AGS (5 × 10 4 in 100 microlitri di coltura) secreto IL-8 in un periodo di 24 ore ad una concentrazione di ~ 225 pg /ml di mezzo. Quando stimolata da IL-1β (1 ng /ml), AGS cellule IL-8 secrezione in un periodo di 24 ore è aumentata ~ 27 volte, ad una concentrazione di ~ 6000 pg /ml. ML 3000 ha inibito sia basale e IL-1β-stimolata IL-8 secrezione, con IC 50 anni di 0,46 micron (CI = 0,09-2,4 micron) e 1,1 micron (CI = 0,52-2,2 micron), rispettivamente (Figura 8a e 8b ). Figura 8 Effetti della ML 3000 su IL-1β-indotta IL-8 secrezione nelle cellule di adenocarcinoma gastrico umano (AGS). ML 3000 inibita sia basale (A) e IL-1β-stimolata (B) IL-8 secrezione, con IC50s di 0.46 mM (CI = 0.09 - 2.4 mM) e 1,1 mM (CI = 0.52 - 2.2 mM) rispettivamente. L'inibitore 5-lipossigenasi-specifici ZD-2138 ha mostrato una inibizione dose-dipendente di basale cellule AGS IL-8 secrezione (C), con una IC50 di 58 nM (CI = 15.6 - 218 nM) e un effetto minimo sulla cella AGS IL-1β -stimulated IL-8 secrezione (D). I punti dati mostrano S.E. media ± da tre saggi indipendenti in ciascuno dei quali IL-8 concentrazioni sono state misurate in triplicato.
L'inibitore 5-lipossigenasi-specifico (ZD-2138), che fu senza effetto sulla microsomiale H, K-ATPasi attività, mostrato dose reattivo inibizione della basale cellule AGS IL-8 secrezione (Figura 8C), con un IC 50 di 58 nM (CI = 15.6 - 218 nM). ZD-2138 ha mostrato un effetto minimo su IL-1β-stimolata la secrezione di IL-8 da parte delle cellule AGS (Figura 8D). H, l'inibizione K-ATPasi da ML 3000, che abbiamo dimostrato in questo studio, non sono alla base di IL-8 inibizione secretoria in questo modello, perché immunocitochimica con H, K-ATPasi-anticorpo monoclonale specifico non mostra alcun H, K-ATPasi espressione nelle cellule AGS (dati non riportati)
. Discussione
Questo studio fornisce informazioni sugli effetti della ML 3000 sugli aspetti della fisiologia gastrica relative al ulcerogenesis. Tre modelli sperimentali di funzionalità gastrica sono stati studiati; altamente purificato H funzionale, K-ATPasi (pompa protonica) isolato dalla mucosa gastrica di maiali macelli, cellule parietali gastriche isolato di coniglio, e cellule di adenocarcinoma gastrico umane in coltura. Nel primo modello, ML 3000 ha inibito la pompa protonica con un IC 50 di 16,4 micron. L'inibitore della pompa protonica (PPI) omeprazolo visualizzato un IC 50 di 1,1 micron nello stesso dosaggio. A differenza di inibitori della pompa protonica, ML 3000 attività inibitoria era indipendente di pH ed era reversibile. FANS selettivi e non selettivi non hanno mostrato H, K-ATPasi attività inibitoria nel medesimo dosaggio. Nel secondo modello, ML 3000 ha inibito sia l'istamina e l'accumulo di acido forskolina-stimolata (IC 50 = 40 e 45 micron), in linea con ML 3000 pompa protonica inibizione. Nel terzo modello, ML 3000 inibita sia basale e IL-1β-stimolata interleuchina-8 secrezione dalle cellule AGS (IC 50 = 0,46 e 1,1 micron, rispettivamente), anche se quest'ultimo effetto sembra estranei all'attività inibitoria 5-lipossigenasi di ML 3000 (figura 8D).
Pubblicato IC 50 per l'omeprazolo rispetto gastrica gamma attività della pompa protonica da 470 nM a 36 pM a seconda delle condizioni del saggio [23-25]. Per gli altri inibitori della pompa protonica, picoprazole IC 50 è di 2 micron [26], rabeprazolo IC 50 è 72 Nm [23], e lansoprazolo IC 50 è di 2,1 micron [27]. L'ampia gamma di pubblicato PPI IC 50 valori per microsomiale H, K-ATPasi riflette la necessità meccanicistico per acidificazione compound per permettere la formazione di un solfossido tiolo-reattiva intermedio che poi derivatizes irreversibilmente H, α K-ATPasi subunità residui di cisteina leader enzimatica inibizione.
Questi dati ML 3000 anche contrastano drammaticamente con l'inibizione omeprazolo di accumulo di acido nelle cellule parietali isolate. Acid capacità secretoria IC 50s (in cellule parietali isolati) di inibitori della pompa protonica (PPI) come omeprazolo, rabeprazolo, e lansoprazolo sono nell'intervallo 59 nM a 360 nM [27, 28]. La maggiore potenza di PPI nel contesto della capacità secretoria acido rispetto al microsomiale H, K-ATPasi (IC 50s vanno da 72 nM a 40 pM) riflette l'attivazione acido più completa degli IPP nei canalicoli cellula parietale isolato che si verifica nella vitro microsomiali a pH 6.1 o superiore. Aziende Il PGE 2 dati sono in contrasto con un precedente studio in cui 2 sul maiale H gastrica, K-ATPasi [29] è stato riportato alcun effetto inibitorio del PGE . Le differenze nel test ATPasi specifico utilizzato in questo studio possono spiegare questa discrepanza. Dal momento che ML3000 e acido arachidonico sono amphiphiles anionici, i loro effetti inibitori potrebbero derivare da specifiche interazioni con H, K-ATPasi subunità siti di legame, o di meno-specifiche interazioni idrofobiche con lipidi di membrana microsomiale H, K-ATPasi-associati, o una combinazione di entrambi i fattori.
la reversibilità di ML 3000 inibizione dell'attività H, K-ATPasi in vitro, mostrato nella Figura 2B, contrasta con l'irreversibilità di inibizione H, K-ATPasi by benzimidazoli sostituiti come omeprazolo o lansoprazolo.

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