Gátolja a gyomorsav H, K-ATP-áz aktivitás és gyomornyálkahártya sejt IL-8-szekréciót a pirrolizin származék ML 3000

Gátolja a gyomorsav H, K-ATP-áz aktivitás és gyomornyálkahártya sejt IL-8-szekréciót a pirrolizin származék ML 3000
Abstract
alapon
ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-klór-fenil ) -7-fenil-2,3-dihidro-1H-pirrolizin-5-il] -ecetsav) egy inhibitora mind a ciklooxigenáz és 5-lipoxigenáz in vitro, és azt mutatja, ígéretes új, nem-szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszer (NSAID). Eltérően a hagyományos NSAID-ok, amelyek kapcsolatban állnak a gyomor ulcerogén hatását, ML 3000 okoz alig vagy egyáltalán nem károsítja a gyomor nyálkahártya, annak ellenére, hogy jelentős mértékben lenyomja gyomor prosztaglandin szintézist.
Módszerek
részeként érdekében, hogy tisztázzák mechanizmusok mögöttes a gyomor megtakarító tulajdonságait ML 3000, vizsgáltuk a hatását ML 3000 H, K-ATP-áz aktivitást mutat in vitro, a sav felhalmozódása izolált gyomor parietális sejtek, valamint az IL-8 szekréció gyomor epiteliális sejtek a tenyészetben.
Eredmények
SCH28080-érzékeny H, K-ATP-áz aktivitás erősen tisztított sertés gyomor mikroszómák dózisfüggően gátolta ML 3000 (IC 50 = 16,4 uM). Gátlás reverzibilis volt, és érzéketlen ml 3000 savasodás a pH-tartományban 2,0-8,0. A nyúl gyomor parietális sejtek
ML 3000 dózisfüggően gátolta a hisztamin által stimulált sav felhalmozódása (IC 50 = 40 nM) és forskolinnal stimulált sav felhalmozódása (IC 50 = 45 um). Végül, a humán gyomor adenokarcinóma (AGS) sejtek, ML 3000 dózisfüggően gátolta mind a kiindulási és az IL-1β-stimulált (20 ng /ml) az IL-8 szekréciójának IC 50-es 0,46 uM és 1,1 jiM volt.
Következtetés
Az adatok azt jelzik, hogy az ML 3000 befolyásolja sav-szekréciós mechanizmusok downstream cAMP mozgósítás által indukált hisztamin H 2 receptor aktiválása, hogy közvetlenül gátolja a H, K-ATP-áz fajlagos aktivitása, és hogy a kiindulási gyomornyálkahártya sejt IL-8-szekréciós gátlás révén fejtheti ML 3000 gátlása az 5-lipoxigenáz-aktivitást. Arra a következtetésre jutottunk, hogy ezek a gyomor funkció gátló adatok hátterében a gyomor takarékos tulajdonságait ML 3000.
alapon
farmakológiai tulajdonságai nem-szteroid gyulladásgátló gyógyszerek (NSAID-ok) származhatnak a elnyomása a prosztaglandin szintézis arachidonsavból [1] . Gátolja a gyomorsav prosztaglandin szintézisét kíséri azonban a csökkent gyomornyálkahártya véráramlást, egyidejű nyálkahártya érzékenység topikális sérülés a különböző irritáló [2]. Egy ígéretes farmakológiai stratégia, hogy elkerüljék a gyomor komplikációk NSAID adagolás összpontosít egyidejű ciklooxigenáz és 5-lipoxigenáz gátlása, azzal a céllal, elnyomja leukotriénszintézist. 5-lipoxigenáz alakítja arachidonsav leukotriének, amelyek közül a leukotrién B4 kemotaktikus leukociták, és ezáltal hozzájárul a gyulladásos mechanizmusokat vezető gastrointestinalis fekélyek [3]. A pirrolizin származék ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-chlorophen-il) -7-fenil-2,3-dihidro-1H-pirrolizin-5-il] -ecetsav) egy inhibitor mindkét ciklo-oxigenáz és az 5-lipoxigenáz in vitro [4, 5], és ígéretes, mint új NSAID. ML 3000 csökkenti a gyomorsav a prosztaglandin E2 szintézisét patkány gyomor és a vér, bár jelentős gátlását gyomor- vagy vér a leukotrién B4 szintézis nem volt kimutatható [6]. A legfontosabb, hogy az ML 3000 nincs hatással a leukocita tapadás a mesenterialis venulákban, és nem okoz a gyomor nyálkahártya sérülés [6].
Állati modellek, ML 3000-ben megállapították, hogy farmakológiai jóindulatú. Így a vegyület nem befolyásolta a patkány lokomotoros aktivitás vagy hexobarbitál-indukált alvás, nem volt kardiovaszkuláris vagy respirációs hatások patkány és kutya volt, anélkül, hogy befolyásolja a neuromuszkuláris funkció a macskák, és okozott sem gyomor kárt sem perisztaltikus zavar [7]. ML 3000 kiváltott gyenge spazmogén válasz tengerimalac ileum, és okozott egy kis átmeneti csökkenése vizeletmennyiség patkányokban [7]. Genotoxicitási vizsgálatok azt mutatják, hogy a ML 3000 nincs hatással a gén mutációs gyakoriság baktérium- vagy emlős sejtek, a nem tervezett DNS-szintézis, illetve gyakoriságát a kromoszomális patkány csontvelő sejteket [8]. 14C-jelzett ML 3000 eloszlás és kiválasztó Patkányokon végzett vizsgálatok azt mutatják, az enterohepatikus keringés és glükuronid konjugáció az ML 3000 [9].
A farmakológiai profilját ML 3000 mint vizsgáltuk állati modellek azt mutatja, gyulladásgátló, fájdalomcsillapító, lázcsillapító, asztmaellenes és antiaggregative aktivitás olyan dózisban, amely nem okoz gyomor károsodást [4, 10]. Az akut és krónikus gyulladásgátló tulajdonságai az ML 3000 tanulmányozták az adjuváns-indukált patkány láb ödéma modell [11] azt mutatják, hogy bár az indometacin valamivel hatásosabb, mint egy gyulladáscsökkentő szer, nem gyomor károsodás volt megfigyelhető ML 3000 akár 100 mg /kg /nap po, míg a ulcerogen dózis (UD 50), indometacint 7 mg /kg /nap po
gyomorfekély által indukált NSAID-k jelentős mértékben korlátozza a hasznosságát ezeket a gyógyszereket. Nyilvánvaló, hogy a kombináció a gyulladáscsökkentő és gyomor takarékos tulajdonságokkal által mutatott ML 3000 teszi ezt a vegyületet egy vonzó jelölt további vizsgálat céljából. Két gyomor nyálkahártya funkciókat, amelyek fontos szerepet játszanak a gyomor fekély vannak-szekréció és az interleukin-8 szekréció. Acid szekréciós inhibitorok között az egyik magasan felírt gyógyszereket, ami a fiziológiai példabeszéd "Nem savas, nem fekély". Farmakológiai vagy kórélettani megsértése, gyomornyálkahártya-akadályok vissza diffúziós HCI vezet a gyors eróziója a gyomornyálkahártya egyrétegű és ennek következtében fekély a nyálkahártya. Savszekréció gátlása által antagonizmus a parietális sejt H2-hisztamin-receptor (cimetidin), vagy közvetlen kovalens származékképzés és inaktiválása a gyomor protonpumpa (omeprazol, a lanzoprazol, a rabeprazol, az ezomeprazol, stb.) A rutin a fejlesztéssel és előmozdítására gyógyulás a gyomor- fekélyek. Így a gyomor takarékos hatásait ML 3000 kapcsolatban lehet a sav szekréciós gátlás által a vegyületet.
Egy kiegészítő gyomor megtakarító hatása az ML 3000 járhat moduláció a gyomorsav szekréció a pro-gyulladásos citokin az IL-8. Aszpirin-indukált gyomor sérülés leírták, hogy összefüggésbe hozható a megnövekedett antrális termelt IL-8 [12]. A ulcerogén Helicobacter pylori baktérium
kimutatták, hogy növeli a sebességét és amplitúdóját az IL-8 szekréciójának in vitro és in vivo körülmények között [13-15], és a fel-szabályozzák az IL-8-gén expresszióját [16]. Hasonló IL-8 prosecretory hatások tekintik következtében az IL-1β stimuláció gyomor hámsejtek. Hatásának összehasonlítása az ML 3000 és más NSAID-ok a következő gyomor szekréciós tevékenységek megvilágítani azt a mechanizmust, amely ML 3000 megakadályozza a gyomor nyálkahártya elváltozások.
A helyzet tisztázása érdekében mechanizmusa a gyomor megtakarító tulajdonságait ML 3000, mi hatását vizsgálták ML 3000 két gyomor nyálkahártya szekréciós funkciókat szerepeket ulcerogenesis: szekrécióját sósav, és a szekréció, a gyulladásos citokin az interleukin-8. Adataink azt mutatják, hogy az ML 3000 gátolja sertés gyomor mikroszomális H, K-ATP-áz aktivitást, gátolja a hisztamin által stimulált savasodás nyúl gyomor parietális sejtekben, és gátolja az IL-1β-stimulált IL-8 szekréciójának emberi gyomor epiteliális sejtek.
Módszerek
Reagensek
ML 3000 és ZD-2138 biztosította a Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazol adta AstraZeneca R & D, Molndal, Svédország, SCH 28080 volt a Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC jött Tocris Cookson Inc., Ballwin, MO, és az NS-398 jött Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arachidonsav, indometacin, acetil-szalicilsav, a naproxen, a PGE 2, leukotriének B4 és a D4 és IL-1β mind szerzett a Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimetil-szulfoxidban (Sigma-Aldrich) használtunk szolubilizálására ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, és az indometacin. Acetil-szalicilsav és a naproxen oldunk ATPáz vizsgálati pufferben (vide infra katalógusa). Az arachidonsav és a PGE 2 feloldunk abszolút etanolban, és az omeprazol metanolban feloldjuk. A leukotriének a B4 és a D4 bocsátották feloldunk 70:30 keveréke metanol és 17 mM ammónium-acetát. Az IL-1β feloldjuk foszfáttal pufferolt sóoldatban (pH = 7,4), 0,1 tömeg /térfogat% szarvasmarha-szérumalbumin. Minden vizsgálatot ezen vegyületek alkalmazásával tartalmazza megfelelő oldószerben kontrollok és az összes oldószert jelen voltak kisebb koncentrációban, mint 1 tömeg /térfogat%, a végső vizsgálati keverékben.
Előállítása H, K-ATP-áz
mikroszomális gyomor H, K-ATP-áz állítottuk elő sertés gyomor nyálkahártya homogenizátumokat differenciális és szacharóz- /Ficoll lépcsős gradiens centrifugálással korábban leírtak szerint [17]. Ezt a készítményt eredményez viszonylag nehéz (7% Ficoll /1,1 M szacharóz-interfész) GII mikroszomális frakció, amely azt mutatta, hogy nincs várakozási K-ATP-áz aktivitás, és amelyek tartalmazták ~ 90%, H: K-ATP-áz, amely a denzitometriás egy 94 kDa-os sáv SDS-PAGE elemzéssel. GII mikroszómákat -80 ° C-on 20% -os glicerinben.
H, K-ATP-áz assay
ATP hidrolitikus aktivitását sertés gyomor mikroszómák mennyiségileg mint ortofoszfát felszabadulását szubsztrát ATP segítségével kolorimetriás malachitzöld eljárás [18] . ATPáz vizsgálatokat végeztünk 96 lyukú mikrotiter. Röviden, 100 ul /üreg vizsgálati pufferrel (60 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 2 mM MgCI 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCI, ± 50 uM SCH28080), amely 80 ng mikroszomális H, K-ATP-áz , ML 3000 (10 -9 M 10 -4 M), vagy más vegyületek, és 1 mM ATP-on inkubáljuk 30 percig 37 ° C-on. Az enzimatikus aktivitást hozzáadásával leállítottuk (45 ul /üreg) kolorimetriás reagenst (0,07% malachitzöld, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% -os ammónium-molibdát-tetrahidrátot, 0,134% Tween-20). 10 másodperc után a színreakciót hozzáadásával (45 ul /lyuk) 15% -os nátrium-citrát. Az elegyet 45 percig szobahőmérsékleten, az abszorbancia a kutak 570 nm-en mértük mikrolemez leolvasóval.
Gyakorolt ​​hatások méréséhez az ML 3000 savasodás ATPáz gátlására, ML 3000 aliquot (10 mM, 5 mM Tris-HCI) adtunk titrált PHS kezdve 2,0-7,4 30 percig. Gyomor mikroszómák szuszpendálunk szabványos ATPáz vizsgálati pufferben, pH = 7,4-on inkubáljuk 30 percig savas aliquot ML 3000 (16,6 jiM végső ML 3000 koncentráció), majd ATP-áz-aktivitást mértünk a fent leírtak szerint. Méréséhez omeprazol gátlása H, K-ATP-áz aktivitást, gyomor mikroszómákban szuszpendáljuk ATPáz vizsgálati pufferben, pH = 6,1-on inkubáljuk 30 percig változó koncentrációjú omeprazol. Az omeprazol savasodás, hogy pH = 6,1 volt szükséges ahhoz, hogy képződését gátló tiol-reaktív-szulfoxid közbenső termék [19]. A gyomor mikroszómákat ezután átvisszük szabványos ATPáz vizsgálati puffer, pH = 7,4, és ATP-áz-aktivitást mértünk a fent leírtak szerint. Specifikus H, K-ATP-áz aktivitást számoltuk a különbség a mikroszomális ATPáz tevékenységek jelenlétében és hiányában a konkrét reverzibilis gyomor H, K-ATP-áz inhibitor SCH28080, és fejeztük mikromól P i /mg protein /óra sebességgel. H, K-ATP-áz aktivitást, frissen készített sertés gyomor mikroszómák mozgott 140-170 jimol P i /mg protein /óra sebességgel. Grafikus ábrája, az adatok azt mutatják százalékos gátlását H, K-ATP-áz aktivitás függvényében vegyület koncentrációját.
Primer cella előkészítése
gyomor parietális sejteket izoláltunk új-zélandi fehér nyulak által pronáz /kollagenáz emésztést a fundus nyálkahártyából követte által dúsítása sejtek szakaszos Nycodenz gradiensek a korábban leírtak szerint [20]. Parietális sejt készítmények tartalmazott körülbelül 10 7 sejt /gyomor, amelynek 80 ± 5% volt, parietalis sejtek alapuló immuncitokémia H, K-ATP-áz-specifikus monoklonális antitest.
Acid akkumulációs vizsgálatban
Aminopirin felhalmozódását parietális sejtek értékelték 96 lyukú szűrő lemezeken Durapore membránok, a korábban leírtak szerint [21]. Röviden, a sejteket előinkubáltuk [ 14C] -pira majd 100.000 sejt /200 d lyukanként inkubáltuk nélkül, vagy a tesztvegyületeket 15 percig inkubálás előtt további 30 percig a távollétében vagy jelenlétében 100 jiM hisztamin vagy 100 jiM forskolint. Minden meghatározást végeztünk négy példányban. Basal aminopirin felhalmozódás határoztuk aminopirin felhalmozódását kezeletlen sejtek kivonjuk felhalmozódása jelenlétében KSCN (a visszaverődés nem-specifikus izotóp csapdázó). Grafikus ábrája, az adatok azt mutatják százalékban gátolja a hisztamin által stimulált sav felhalmozódása a sejtek által függvényében vegyület koncentrációkat.
Gyomor adenokarcinóma sejteket
Emberi gyomor adenokarcinóma sejteket (AGS-sejtek, ATCC CRL 1739), tartottunk fenn AGS táptalajt (Ham-féle F-12, 10% magzati borjú szérumot, 100 egység /ml penicillin G, 0,25 ng /ml amfotericin B-vel, 100 ng /ml sztreptomicin), 37 ° C-on, 5% CO 2/95% levegő inkubátor és használt átoltás között a 42. és 56. vizsgálatok az IL-8 szekréciójának, AGS sejteket szélesztettünk 96 mérőhelyes lemezeken (50000 sejt /100 ul /üreg), és hagyjuk megtapadni 18 órán át 37 ° C-on, 5% CO 2/95% levegő. A sejteket ezután a vizsgálandó vegyületek jelenlétében és távollétében az IL-1β 24 óra, amely időpontban mintát tápközeget eltávolítottuk a lyukakból, és -70 ° C-on. IL-8 koncentrációját meghatároztuk a minták enzim-kapcsolt immunszorbens assay (humán IL-8 Duo Set ELISA fejlesztési rendszer, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Grafikus ábrája, az adatok azt mutatják százalékos gátlását a nem stimulált vagy stimulált IL-8 szekréció függvényében vegyület koncentrációját.
Statisztikai elemzés
Összes kísérleteket végeztünk legalább háromszor; adatpontok minden vizsgálatban képviseli mérőeszköz a három párhuzamos mintát. Az adatpontok illeszkedő egy három paraméteres logisztikus egyenlet arra ábrázoljuk szigmoid dózis-válasz görbéket Prism statisztikai csomaggal (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Fél-maximális gátló koncentrációját (IC 50), és az IC 50 95% -os konfidencia intervallum (CI) is kiszámításra Prism. Az adatpontok nem illik a három paraméteres logisztikus állították egyszerű pont-pont görbék. Standard hiba volt az intézkedés variancia használt hibaantennák grafikus ábrázolása adatok katalógusa eredménye
hatásai ML 3000 H, K-ATP-áz aktivitás
gyomor H, K-ATP-áz aktivitás dózisfüggően gátolta ML 3000, egy fél-maximális gátló koncentráció (IC 50) 16,4 pM (CI = 6,84-39,3 uM) (1a ábra). A gátló aktivitását ML 3000-ben, összehasonlítva a klasszikus protonpumpa inhibitor (PPI), a szubsztituált benzimidazol omeprazol. Az 1B ábra a hatása az omeprazol H, K-ATP-áz aktivitás mellett vizsgálati körülmények azonosak a 1A ábra; A számított IC 50 omeprazol 1,7 nM (CI = 0,26-11,3 mm). Ezek az adatok azt mutatják, hogy az ML 3000 lényegesen kevésbé hatásos, mint az omeprazol tekintetében gyomor H, K-ATP-áz gátló aktivitással, legalábbis a beállítást az adott in vitro vizsgálat a meghatározott feltételek mellett. Annak meghatározására, hogy az ML 3000 megjelenített összehasonlítható sav-aktivációs tulajdonságokat, egy fél-maximális gátlási koncentrációja ML 3000 titráltuk különböző pH-ra, és a hatása H, K-ATP-áz aktivitás mértük. Amint azt a 2A ábra, a savasodás az ML 3000 nem volt jelentős hatása a H, K-ATP-áz gátló profil. Ezek az adatok azt jelzik, hogy az ML 3000, szemben a omeprazol, nem igényel savasodás indukálására gátló aktivitás. Tekintettel arra, hogy a PPI-k vannak irreverzíbilis inhibitorai H, K-ATP-áz aktivitást, kovalensen kötődni a katalitikus α alegység, igyekeztünk meghatározni, hogy az ML 3000 gátlása H, K-ATP-áz volt visszafordítható vagy visszafordíthatatlan. Gyomor H, K-ATP-áz-dúsított mikroszómákat kezeltük egy maximálisan-gátló koncentrációja ML 3000, majd meghígítottuk nagy feleslegben puffer, hogy csökkentse a ML 3000 koncentrációja 100 umol és 3,3 umol. Az eredmények, a 2B ábrán látható, azt jelezte, hogy hígítás az ML 3000 helyreállított H, K-ATP-áz aktivitást, és összhangban vannak az ML 3000 gátlására H, K-ATP-áz aktivitás reverzibilis módon, azaz a., ML 3000 nem kovalensen származékká sem alegység a gyomor H, K-ATP-áz, legalábbis feltételek mellett a jelen in vitro vizsgálatban a H, K-ATP-áz aktivitását. Ebben a tekintetben, az ML 3000 kinetikailag hasonló SCH28080, a konkrét reverzibilis inhibitora a gyomor H +, K-ATP-áz. 1. ábra dózis-függő gátlását H, K-ATP-áz aktivitás ML 3000 (A) és az omeprazol (B). (A). Gyomor mikroszómák szuszpendáljuk ATPáz vizsgálati pufferben, pH = 7,4-on inkubáljuk 30 percig változó koncentrációjú ML 3000 és ATP-áz aktivitást ezután mérjük pH = 7,4. A fél-maximális gátló koncentráció (IC50) az ML 3000 volt 16,4 uM (CI = 6,84-39,3 uM). (B). Gyomor mikroszómák szuszpendáljuk ATPáz vizsgálati pufferben, pH = 6,1-on inkubáljuk 30 percig változó koncentrációjú omeprazol, majd átvisszük szabványos ATPáz vizsgálati puffer, pH = 7,4 a ATPáz aktivitás mérésére. Az IC50 az omeprazol volt 1,1

• CD44 /CD24-expresszió visszatérő gyomorrák: Retrospektív analysis
• Közötti kapcsolat étkezés után bekövetkező balkamra funkció, glükóz és inzulin koncentráció, a gyomor kiürülését, és a jóllakottság egészséges egyénekben