A inibição da H gástrica, actividade K-ATPase e células epiteliais gástricas secreção de IL-8 pela pirrolizina derivado de ML 3000

A inibição da H gástrica, actividade K-ATPase e gástrica célula epitelial secreção de IL-8 pela pirrolizina derivado de ML 3000
Resumo
fundo
ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-clorofenil) -7-fenil-2,3-di-hidro-1H-pirrolizina-5-il] -acético) é um inibidor de ambos ciclo-oxigenase e a 5-lipoxigenase in vitro, e mostra a promessa como um novo medicamento não-esteróides anti-inflamatórias (NSAID). Ao contrário dos AINEs convencionais, os quais estão associados com efeitos ulcerogénicos gástricas, ML 3000 faz com pouco ou nenhum dano para a mucosa gástrica, mesmo que deprime de maneira significativa a síntese das prostaglandinas gástricas.
Métodos
Como parte de um esforço para clarificar os mecanismos subjacentes a gástrico poupando propriedades de ML 3000, foram estudados os efeitos de ML 3000 na actividade de H, K-ATPase in vitro, sobre a acumulação de ácido em células parietais gástricas isoladas, e na secreção de IL-8 por células epiteliais gástricas em cultura.
resultados
H-SCH28080 sensível, a actividade de ATPase K-gástricas em microssomas de suínos purificada foi altamente dependente da dose por ML 3000 inibiu (IC 50 = 16,4 uM). A inibição era reversível, e insensível a ml 3000 acidificação na gama de pH 2,0-8,0. Em células parietais gástricas coelho,
ML 3000 acúmulo de ácido estimulada pela histamina dose-dependente inibida (IC 50 = 40 mM) e acúmulo de ácido estimulada por forscolina (IC 50 = 45 mM). Finalmente, em células de adenocarcinoma gástrico humano (AGS), o ML 3000 dependentemente da dose inibiu tanto a linha de base e IL-1β estimulada (20 ng /ml) de IL-8 a secreção com IC 50s de 0,46 uM e 1,1 uM, respectivamente.
Conclusão
Os dados indicam que o ML 3000 afecta os mecanismos de ácido-secretores a jusante da mobilização de cAMP induzido por histamina a activação 2 receptor de H, que inibe directamente actividade de H, K-ATPase específico, e que a célula epitelial gástrica basal IL-8, a inibição de secreção pode ser mediada por ML 3000 a inibição da actividade da 5-lipoxigenase. Conclui-se que estes dados inibitórios função gástrica pode ser a base das propriedades poupadores gástricos de ML 3000.
Fundo
As propriedades farmacológicas dos medicamentos anti-inflamatórios não-esteróides (NSAIDs) são provenientes de sua supressão da síntese de prostaglandinas a partir do ácido araquidônico [1] . A inibição da síntese das prostaglandinas gástricas é acompanhada contudo por diminuição do fluxo de sangue na mucosa gástrica, com sensibilidade mucosal concomitante à lesão tópica por uma variedade de irritantes [2]. Uma estratégia farmacológica promissora para evitar complicações gástricas de administração de NSAID incide sobre ciclooxigenase concorrente e inibição da 5-lipoxigenase, com o objetivo de suprimir a síntese de leucotrienos. 5-lipoxigenase converte o ácido araquidônico em leucotrienos, entre os quais leucotrieno B4 é quimiotático para leucócitos e, assim, contribui para mecanismos inflamatórios que levam a úlceras gastrointestinais [3]. O pirrolizina derivado de ML 3000 ([2,2-dimetil-6- (4-clorofen-il) -7-fenil-2,3-di-hidro-1H-pirrolizina-5-il] -acético) é um inibidor de ambos ciclo-oxigenase e a 5-lipoxigenase in vitro [4, 5], e mostra a promessa como novo AINE. ML 3000 reduz a síntese de prostaglandina E2 gástrico no estômago de rato e de sangue, embora a inibição significativa da síntese de leucotrieno B4 gástrica ou sangue não foi detectada [6]. Mais importante ainda, o ML 3000 não tem efeito sobre a adesão de leucócitos em vénulas mesentéricas, e não causa lesão da mucosa gástrica [6].
Em modelos animais, o ML 3000 foi encontrado para ser farmacologicamente benigna. Assim, o composto não afectou a actividade locomotora de ratos ou de sono induzido por hexobarbital, não teve efeitos cardiovasculares ou respiratórias em ratos e cães, foi sem afectar a função neuromuscular em gatos, e causaram nem lesões gástricas nem perturbação peristáltica [7]. ML 3000 provocou uma resposta espasmogênica fraco em íleo de cobaia, e causou uma pequena redução transitória da produção de urina em ratos [7]. Os estudos de genotoxicidade indicam que ML 3000 não tem efeitos sobre as frequências de mutação genética em bactérias ou células de mamíferos, em síntese não programada de ADN, ou na freqüência de aberrações cromossômicas em células da medula óssea de ratos [8]. ML 3000 de distribuição e excretor estudos marcadas com 14C em ratos indicam circulação entero-hepática e conjugação do glucuronido de ML 3000 [9].
O perfil farmacológico do ML 3000 como estudado em modelos animais mostra anti-inflamatórios, analgésicos, antitérmicos, actividade anti-asmática, e antiaggregative numa dosagem que provoca nenhum dano gástrico [4, 10]. As propriedades agudas e crónicas anti-inflamatória de ML 3000 estudada no rato modelo de edema de pata induzido por adjuvante [11] mostram que, embora a indometacina é um tanto mais potente como um agente anti-inflamatório, nenhum dano gástrico foi observado com o ML 3000 até 100 mg /kg /d po, ​​ao passo que a dose ulcerogénica (UD 50) por indometacina foi de 7 mg /kg /d po
ulceração gástrica induzida por NSAIDs limita significativamente a utilidade destes fármacos. Claramente, a combinação de propriedades anti-inflamatórias e gástricas poupadores exibidas por ML 3000 torna este composto um candidato atraente para um estudo mais aprofundado. Duas funções da mucosa gástrica, que desempenham papéis importantes em ulceração gástrica são a secreção de ácido e a secreção de interleucina-8. Ácido inibidores de secreção estão entre os medicamentos mais altamente prescritos, refletindo o ditado fisiológico "Não ácido, sem úlcera". Rompimento farmacológica ou fisiopatológico das barreiras da mucosa gástrica para apoiar a difusão de HCl leva à rápida erosão da monocamada epitelial gástrica e consequente ulceração da mucosa. A inibição da secreção de ácido por antagonismo no receptor de histamina de células parietais H2 (cimetidina), ou por derivatização covalente directa e inactivação da bomba gástrica de protões (omeprazol, lansoprazol, rabeprazol, esomeprazol, etc) é de rotina para a melhoria e promoção de cicatrização das úlceras gástricas úlceras. Assim, os efeitos gástricos poupadores de ML 3000 pode ser relacionada com a inibição de secreção de ácido pelo composto.
Um efeito poupador gástrica complementar de ML 3000 pode envolver modulação da secreção gástrica da citocina pró-inflamatória IL-8. lesão gástrica induzida pela aspirina tem sido relatado para ser associada com um aumento da produção de IL-antral 8 [12]. A bactéria Helicobacter pylori ulcerogénico
foi mostrada para aumentar a taxa e a amplitude da secreção de IL-8 tanto in vitro como in vivo [13-15], e para sobre-regular a expressão de IL-8 de genes [16]. Efeitos similares de IL-8 prosecretory são vistos como um resultado da estimulação de IL-1β de células epiteliais gástricas. Comparação dos efeitos de ML 3000 e de outros AINEs sobre estas actividades de secreção gástrica pode elucidar o mecanismo pelo qual o ML 3000 impede a formação de lesões da mucosa gástrica.
A fim de clarificar os mecanismos subjacentes à gástrico poupando propriedades de ML 3000, nós investigou o efeito do ML 3000 em duas funções gástricas mucosas secretoras com papéis em ulcerogenesis: a secreção de ácido clorídrico, e a secreção da citoquina inflamatória interleucina-8. Os nossos dados mostram que o ML 3000 inibe gástrica de porco microssomal actividade de H, K-ATPase, inibe a acidificação estimulada pela histamina em células parietais gástricas de coelho, e inibe a secreção de IL-8, IL-estimulada-1β por células epiteliais gástricas humanas.
Métodos
Reagentes
ML 3000 e ZD-2138 foram fornecidos por Forest Laboratories, Inc., Nova Iorque, Nova Iorque, omeprazol foi fornecida pela AstraZeneca R & D, Molndal, Suécia, SCH 28080 foi do Instituto de Pesquisa Schering-Plough, Kenilworth, NJ, TEDBC veio Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, e NS 398 vieram de Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. O ácido araquidónico, indometacina, ácido acetilsalicílico, naproxeno, PGE 2, leucotrienos B4 e D4, e IL-1β foram todos adquiridos a partir de Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimetil sulfóxido (Sigma-Aldrich) foi usado para solubilizar ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, e indometacina. O ácido acetilsalicílico e naproxeno foram dissolvidos em tampão de ensaio de ATPase (vide infra
). O ácido araquidónico e PGE 2 foram dissolvidos em etanol absoluto, e o omeprazol foi dissolvido em metanol. Os leucotrienos B4 e D4 foram fornecidos dissolvido numa mistura 70:30 de metanol e acetato de amónio 17 mM. IL-1β foi dissolvido em solução salina tamponada com fosfato (pH 7,4), 0,1% w /v de albumina de soro bovino. Todos os ensaios utilizando estes compostos incluídos controlos de solvente apropriado, e todos os solventes se presentes em concentrações inferiores a 1% w /v na mistura de ensaio final.
Preparação de H, K-ATPase microssomal
gástrica H, K-ATPase foi preparado a partir de homogenatos de mucosa gástrica de suíno por diferencial de sacarose e /Ficoll a centrifugação em gradiente de passo tal como descrito anteriormente [17]. Esta preparação proporciona um relativamente pesado (7% de Ficoll /interface de 1.1 M de sacarose) fracção microssomal GII, que não mostrou qualquer latência de actividade K-ATPase, e que composto por ~ 90% de H, K-ATPase, com base na densitometria de uma banda de 94 kDa por análise de SDS-PAGE. GII microssomas foram armazenados a -80 ° C em glicerol a 20%.
H, K-ATPase Ensaio
actividade hidrolitica de ATP de microssomas foi quantificada gástrica de suíno, como ortofosfato de libertação a partir de ATP substrato usando um procedimento de verde de malaquite colorimétrico [18] . Os ensaios ATPase foram realizados em microplacas de 96 poços. Resumidamente, 100 ul /poço de tampão de ensaio (60 mM de Tris-HCl, pH 7,4, MgCl 2 mM de 2, 1 mM de EGTA, ± KCl 7,5 mM, ± 50 pM SCH28080), contendo 80 ng microssomal H, K-ATPase , ML 3000 (10 -9 M a 10 -4 M) ou outros compostos, e 1 mM ATP foi incubado durante 30 min a 37 ° C. A actividade enzimática foi parada por adição (45 uL /​​poço) de reagente colorimétrico (0,07% de verde de malaquite, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% de molibdato de amónio tetrahidratado, 0,134% de Tween-20). Após 10 segundos, a reacção de cor foi desenvolvida por adição (45 uL /​​poço) de citrato de sódio a 15%. Após 45 min à temperatura ambiente, a absorvância dos poços a 570 nm foi medida num leitor de microplacas.
Para medir os efeitos de ML 3000 acidificação sobre a inibição da ATPase, o ML 3000 alíquotas (10 mM em Tris-HCl 5) eram titulada para pH variando de 2,0 a 7,4, durante 30 min. microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase padrão a pH 7,4 foram incubadas durante 30 minutos com alíquotas acidificadas de ML 3000 (16,6 uM concentração final de ML 3000) e, em seguida, a actividade de ATPase foi medida como descrito acima. Para medir a inibição da actividade de omeprazol H, K-ATPase, microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase a pH 6,1 foram incubadas durante 30 minutos com concentrações variadas de omeprazol. O omeprazol acidificação para um pH de 6,1 foi necessário para permitir a formação do intermediário sulfóxido de tiol-reactivo inibidora [19]. Os microssomas gástricas foram então transferidas para tampão de ensaio de ATPase padrão a pH 7,4, e a actividade de ATPase foi medida como descrito acima. Actividade especifica H, K-ATPase foi calculada como a diferença de actividades microssomal ATPase na presença e ausência do H gástrica reversível específico, K-ATPase SCH28080 inibidor, e foi expressa como umoles P i /mg de proteína /h. Actividade de H, K-ATPase de microssomas gástrica de porco recém-preparado variou de 140 a 170 umoles P i /mg de proteína /h. representação gráfica dos dados mostra a percentagem de inibição da actividade de H, K-ATPase como uma função de concentrações de composto.
célula primária Preparação
células parietais gástricas foram isoladas a partir de coelhos brancos da Nova Zelândia por digestão com pronase /colagenase da mucosa fúndica seguido por enriquecimento de células em gradientes de Nycodenz descontínuos como descrito anteriormente [20]. preparações de células parietais continha aproximadamente 10 7 células /estômago, dos quais 80 ± 5% eram células parietais com base em imunocitoquímica com H, o anticorpo monoclonal K-ATPase específica do.
Ácido Acumulação Ensaio
acumulação Aminopyrine em parietal células foi avaliada em placas de filtro de 96 cavidades com membranas de Durapore, como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, as células foram pré-incubadas com [ 14C] -aminopyrine e depois 100.000 células /200 pi por cavidade foram incubadas sem ou com os compostos de teste durante 15 minutos antes da incubação durante mais 30 min, na ausência ou presença de 100 pM de histamina ou 100 | iM de forscolina. Todas as determinações foram realizadas em quadruplicado. acumulação de aminopirina basal foi determinada como a acumulação de aminopirina em culas n tratadas subtraídos da acumulação na presença de KSCN (uma reflexão de isótopo não-específica trapping). representação gráfica dos dados mostra a percentagem de inibição da acumulação de ácido estimulada por histamina pelas células como uma função de concentrações de composto.
células gástricas Adenocarcinoma
células de adenocarcinoma gástrico humano (células AGS, ATCC CRL 1739), foram mantidas em AGS forma (F-12 de Ham, 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina G, 0,25 ug /mL de anfotericina B, 100 ug /ml de estreptomicina) a 37 ° C num CO 5% 2/95% de ar incubadora e usado entre as passagens 42 e 56. para os estudos da secreção de IL-8, AGS células foram plaqueadas em placas de 96 poços (50000 células /100 uL /​​poço) e deixadas a aderir durante 18 horas a 37 ° C em 5% de CO 2/95% de ar. As células foram então incubadas com compostos de teste na presença e na ausência de IL-1β durante 24 h, tempo em que as amostras de meio foram removidos dos poços e guardadas a -70 ° C. IL-8 concentrações das amostras foram determinados por ensaio imunossorvente ligado a enzima (IL-8 humana-Duo Set sistema de desenvolvimento de ELISA, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN). representação gráfica dos dados mostra a percentagem de inibição de não estimulada ou estimulada por IL-8 de secreção como uma função de concentrações de composto

Análise Estatística Todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes.; Os pontos de dados em cada ensaio representam meios de medição de amostras em triplicado. Os pontos de dados montagem de uma equação logística de três parâmetros foram representadas graficamente como curvas de dose-resposta sigmoidal, utilizando o pacote de estatística GraphPad Prism (Software, Inc., San Diego, CA). concentrações inibitórias metade do máximo (IC 50) e IC 50 intervalos de 95% de confiança (IC) também foram calculados utilizando Prism. Os pontos de dados que não se enquadrem um logístico de três parâmetros foram desenhados como simples curvas de ponto-a-ponto. erro padrão era a medida de variância usado para barras de erro na representação gráfica de dados

Resultados Efeitos do ML 3000 na actividade de H, K-ATPase
gástrica actividade de H, K-ATPase foi dose-dependente inibida por ML 3000, com uma concentração inibitória de metade do máximo (IC 50) de 16,4 pM (IC = 6,84-39,3 ^ M) (Figura 1A). A actividade inibidora de ML 3000 foi comparada com a de um inibidor da bomba de protões clássica (PPI), o omeprazole substituo benzimidazole. A Figura 1B mostra o efeito do omeprazole na actividade de H, K-ATPase sob condições de ensaio idênticas às da Figura 1A; o IC calculado 50 para o omeprazol foi de 1,7 mM (IC = 0,26-11,3 m). Estes dados mostram que o ML 3000 é consideravelmente menos potente do que o omeprazole com respeito a H gástrica, actividade inibitória K-ATPase, pelo menos na configuração deste ensaio in vitro particular, sob as condições especificadas. Para determinar se o ML 3000 exibiu as propriedades de activação de ácido-comparáveis, uma concentração inibitória de metade do máximo de ML 3000 foi titulada a pHs diferentes e foram medidos os efeitos sobre a actividade de H, K-ATPase. Como mostrado na Figura 2A, a acidificação de ML 3000 não teve efeito significativo na sua H, perfil inibitório K-ATPase. Estes dados indicam que o ML 3000, em contraste com o omeprazol, não requer acidificação para a indução de actividade inibidora. Dado que os IPP são inibidores irreversíveis da actividade de H, K-ATPase, a ligação covalente da subunidade catalítica α, procurou-se determinar se o ML 3000 inibição da H, K-ATPase foi reversível ou irreversível. Gastric H, K-ATPase microssomas enriquecidos foram tratados com uma concentração máxima de inibição de ML 3000 e depois diluiu-se com um grande excesso de tampão para reduzir a concentração de ML 3000 de 100 pM para 3,3 pM. Os resultados, mostrados na Figura 2B, indicou que a diluição de ML 3000 restaurou a actividade H, K-ATPase, e são consistentes com o ML 3000 inibir a actividade de H, K-ATPase de uma maneira reversível, isto é., O ML 3000 não covalentemente derivatizar tanto subunidade do H gástrica, K-ATPase, pelo menos sob as condições do presente ensaio in vitro de actividade de H, K-ATPase. A este respeito, o ML 3000 é cineticamente semelhantes a SCH28080, o inibidor reversível específica de gástrica H, K-ATPase. Figura 1 a inibição dependente da dose da actividade de H, K-ATPase de ML 3000 (A) e pelo omeprazol (B). (UMA). microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase a pH 7,4 foram incubadas durante 30 minutos com concentrações variáveis ​​de ML 3000 e actividade de ATPase Mediu-se então a um pH de 7,4. A concentração inibitória de metade do máximo (IC50) para ML 3000 foi de 16,4 uM (IC = 6,84-39,3 uM). (B). microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase a pH 6,1 foram incubadas durante 30 minutos com concentrações variáveis ​​de omeprazole, e em seguida, transferidos para tampão de ensaio de ATPase padrão a pH 7,4 para a medição de actividade de ATPase. O IC50 para o omeprazol foi de 1,1 mM (IC = 0,26-11,3 m). Os pontos de dados mostrar s.e. ± média a partir de três ensaios independentes em cada um dos quais a actividade de ATPase SCH28080-sensíveis foi medida em triplicado.
Figura 2 Efeito de ML 3000 na actividade de acidificação H, K-ATPase (A), e ML 3000 inibição da actividade de H, K-ATPase é reversível (B). (A) ML 3000 alíquotas (10 mM em Tris-HCl 5) foram titulados para valores de pH variando de 2,0 a 7,4, durante 30 min antes da adição ao tampão de ensaio de ATPase padrão (pH 7,4) contendo microssomas gástricas. (B) microssomas gástricas foram tratados com uma concentração máxima inibitória (100 ^ M) de ML 3000. A suspensão microssómica foi então diluída com um grande excesso de tampão para reduzir a concentração de ML 3000 de 100 pM para 3,3 pM. Em ambos (A) e (B), os pontos de dados mostram a média ± D.P. a partir de três ensaios independentes em cada um dos quais a actividade de ATPase SCH28080-sensíveis foi medida em triplicado.
ácido araquidónico e prostaglandina E 2 (PGE 2) também dependentemente da dose inibiu a actividade de H, K-ATPase, com IC 50 de 16,7 um (IC = 8,9-31,5 pM) e 15 pM (IC = 3,96-57,3 ^ M), respectivamente (Figura 3A e 3B). Desde ML 3000 também mostra a inibição da 5-lipoxigenase, foram estudados os efeitos de dois inibidores de lipoxigenase na microssomal actividade de H, K-ATPase. A Figura 4A mostra que a 2- (1-tienil) acetato de 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), um inibidor poderoso de 5-, 12-, e 15-lipoxygenses, inibiu microssomal actividade de H, K-ATPase, com um IC 50 de 22,6 | iM (IC = 6,3-81,2 pM). Em contraste, o específico do inibidor de 5-lipoxigenase 6 - ((3-fluor-5- (metoxi-3,4,5,6-tetra-hidro-2H-piran-4-il) fenoxi) metil) quinolin (ZD-2138 ) teve um efeito mínimo na actividade de H, K-ATPase (-20% de inibição a 10 -5 M) (Figura 4B). Estes dados são consistentes com microssomal gástrica 12- e 15-lipoxigenases que jogam um papel na H, K-ATPase de activação, ou com a interacção directa de TEDBC com a H, K-ATPase subunidades alterando a conformação da enzima e, por conseguinte, a actividade. Claramente, ambas as interpretações são provocantes e merecem um estudo mais aprofundado. Figura 3 Inibição de actividade de H, K-ATPase por ácido araquidónico (A) e prostaglandina E2 (B). microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase a pH 7,4 foram incubadas durante 30 minutos com concentrações variáveis ​​de ácido araquidónico ou a actividade de ATPase de PGE2 e, em seguida, foi medida a pH 7,4. IC50 para o ácido araquidónico foi de 16,7 uM (IC = 8,9-31,5 pM), e o IC50 para PGE2 foi de 15 uM (IC = 3,96-57,3 uM). Os pontos de dados mostrar s.e. ± média a partir de três ensaios independentes em cada um dos quais a actividade de ATPase SCH28080-sensíveis foi medida em triplicado. Figura 4
inibição da actividade da H, K-ATPase pela TEDBC inibidor da 5-, 12- e 15-lipoxigenase (A), e o inibidor da 5-lipoxigenase ZD-2138 (B). microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase a pH 7,4 foram incubadas durante 30 minutos com concentrações variadas de TEDBC ou ZD-2138 e actividade de ATPase Mediu-se então a um pH de 7,4. Em (A), os pontos de dados mostrar actividade da ATPase sensível à SCH28080 médio medido em triplicado em um de três ensaios independentes; Dados típicos são mostrados. Os dados de pontos em (B) mostram significa ± S.E. a partir de três ensaios independentes em cada um dos quais a actividade de ATPase SCH28080-sensíveis foi medida em triplicado.
A fim de comparar o efeito inibitório H, K-ATPase de ML 3000 com outros AINEs, medimos os efeitos do ácido acetil salicílico, NS 398, naproxeno e indometacina sobre a atividade da bomba de protões. Todos os quatro eram AINEs sem efeitos inibitórios sobre microssomal actividade de H, K-ATPase em concentrações de até 10 ~ 4 M (10 -3 M de ácido acetil salicílico) (Figura 5A, 5B, 5C e 5D). A indometacina foi anteriormente relatada para inibir H gástrica, K-ATPase em concentração um pouco mais elevada (K i = 0,67 x 10 -3 H) [22]. Nossos dados diferenciar claramente ML 3000 de outros AINEs, em termos de efeito inibitório sobre H gástrica, atividade K-ATPase; a base mecanicista para esta diferença, ea correlação potencial com a propriedade poupadores gástrico observado de ML 3000, continuam a ser investigado. Figura 5 Efeitos do ácido acetil salicílico, NS 398, naproxeno, indometacina e na actividade de H, K-ATPase. microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase a pH 7,4 foram incubadas durante 30 minutos com concentrações variáveis ​​de ácido acetil salicílico, NS 398, naproxeno, ou indometacina e actividade de ATPase Mediu-se então a um pH de 7,4. Os pontos de dados mostrar actividade da ATPase sensível à SCH28080 médio medido em triplicado em um de três ensaios independentes; dados típicos são mostrados em cada caso.
Por último, a fim de determinar se a inibição de ML 3000 de H gástrica, K-ATPase reflectida os efeitos do composto em vias metabólicas de leucotrieno funcional putativo presente nos microssomas gástrica de suíno, foram estudados os efeitos de leucotrieno B4 e D4 na actividade de H, K-ATPase. problemas de solubilidade impedida estudar as concentrações de LTB4 ou LTD4 maiores do que 1 pM. Como mostrado na Figura 6A e 6B, nem leucotrieno mostrou qualquer actividade inibidora contra a H, K-ATPase em concentrações fisiológicas (10 -9-10 -8 M); apenas em concentrações não fisiológicas superiores a 10 -7 M houve alguma atenuação significativa da actividade de H, K-ATPase. A FIGURA 6 Efeitos de leucotrienos B4 e D4 na SCH28080-sensível actividade de H, K-ATPase específica. microssomas gástricas em suspensão em tampão de ensaio de ATPase a pH 7,4 foram incubadas durante 30 minutos com concentrações variadas de leucotrieno B4 ou leucotrieno D4 e actividade de ATPase Mediu-se então a um pH de 7,4. Os pontos de dados mostrar s.e. ± média a partir de três ensaios independentes em cada um dos quais a actividade de ATPase SCH28080-sensíveis foi medida em triplicado.
Efeitos de ML 3000 na acumulação de ácido gástrico célula parietal estimulada pela histamina
ML 3000 dependentemente da dose inibiu a estimulada pela histamina (100 uM) acumulação de ácido pelas células parietais gástricas de coelho, com uma concentração inibitória de metade do máximo (IC 50) de 40 pM (Figura 7A). ML 3000 dependentemente da dose também (100 uM) a acumulação de ácido estimulada por forscolina inibida pelas células parietais gástricas de coelho, com uma IC 50 ~ de 45 uM (Figura 7B). Estes dados indicam que o ML 3000 afecta os mecanismos de secreção de ácido das células parietais a jusante da mobilização de cAMP induzida pela histamina H 2 a activação do receptor. Os dados são consistentes com o ML 3000 de inibição da secreção de ácido célula parietal que resulta da interacção directa de ML 3000 com a H gástrica, K-ATPase. No entanto, o discepancy entre ML 3000 IC 50 em vesículas microssomais (15 pM) e em células parietais isoladas (40-45 pM) sugere que o ML 3000 de acesso para o H intracelular, K-ATPase em células parietais do compartimento pode ser retardado por restrições de permeabilidade na membrana de plasma. Alternativamente, o ML 3000 podem ser sujeitos a modificações metabólicas citoplasmáticos que limitam a potência inibidora do composto. Figura 7 ML 3000 inibe a acumulação de ácido em células parietais gástricas de coelho. (A) a inibição dependente da dose por ML 3000 da (100 uM) a acumulação de ácido estimulada por histamina pelas células parietais gástricas de coelho (CI50 = 40 uM). (B) inibição dependente da dose por ML 3000 da (100 uM) a acumulação de ácido estimulada por forscolina por células parietais gástricas de coelho (CI50 = 45 uM). Os pontos de dados mostrar s.e. ± média a partir de quatro ensaios independentes em cada um dos quais acúmulo de ácido em células parietais foi medida em duplicado.
Finalmente, como foi encontrado com microssomal H, K-ATPase, outros AINEs, tais como o ácido acetilsalicílico, naproxeno, e NS 398 (até concentrações de 10 ~ 4 M) não teve nenhum efeito sobre a acumulação de ácido pelas células parietais do coelho isolado (dados não mostrados)
efeitos de ML 3000 na induzida por IL-1β IL-8 a secreção no adenocarcinoma gástrico humano (AGS)
células em condições basais, AGS células (5 × 10 4 em 100 ul de meio de cultura) secretada de IL-8 ao longo de um período de 24 horas para uma concentração de ~ 225 pg /mL de meio. Quando estimulada por IL-1β (1 ng /ml), células AGS secreção de IL-8 ao longo de um período de 24 horas aumentou ~ 27 vezes, a uma concentração de ~ 6000 pg /ml. ML 3000 inibiu tanto a linha de base e a secreção estimulada-1β IL IL-8, com IC 50 de 0,46 jiM (IC = 0,09-2,4 ^ M) e 1,1 uM (IC = 0,52-2,2 ^ M), respectivamente (Figura 8A e 8B ). Figura 8 Efeitos do ML 3000 na induzida por IL-1β IL-8 a secreção em células de adenocarcinoma gástrico humano (AGS). ML 3000 inibiu tanto a base (A) e IL-1β estimulada (B) IL-8 secreção, com valores de IC50 de 0,46 uM (IC = 0,09-2,4 ^ M) e 1,1 uM (IC = 0,52-2,2 ^ M), respectivamente. O inibidor específico da 5-lipoxigenase ZD-2138 mostrou inibição dependente da dose de células AGS linha de base de IL-8 a secreção de (C), com uma IC50 de 58 nM (IC = 15,6-218 nM) e um efeito mínimo na célula AGS IL-1β estimulada por IL-8 a secreção de (D). Os pontos de dados mostrar s.e. ± média a partir de três ensaios independentes em cada um dos quais as concentrações de IL-8 foram medidos em triplicado.
O inibidor específico da 5-lipoxigenase (ZD-2138), que foi sem efeito na microssomal actividade de H, K-ATPase, mostrou dose responsivo inibição de células da linha de base AGS secreção de IL-8 (Figura 8C), com um IC 50 de 58 nM (IC = 15,6-218 nM). ZD-2138 mostrou um efeito mínimo sobre-estimulada por IL-1β IL-8 a secreção pelas células AGS (Figura 8D). O H, inibição K-ATPase de ML 3000, que têm demonstrado no presente estudo, não estão na base de IL-8, a inibição de secreção neste modelo porque imunocitoquímica com H, anticorpo monoclonal específico de K-ATPase não mostra H, expressão K-ATPase em células AGS (dados não mostrados).
Discussão
Este estudo fornece informações sobre os efeitos da ML 3000 sobre aspectos da fisiologia gástrica relacionadas com ulcerogenesis. Três modelos experimentais de função gástrica foram investigados; altamente purificado funcional H, K-ATPase (bomba de protões) isolado a partir da mucosa gástrica de porcos, matadouros células parietais gástricas isoladas de coelho e células de adenocarcinoma gástrico humano em cultura. No primeiro modelo, ML 3000 inibiu a bomba de protões com uma IC 50 de 16,4 mM. O omeprazol inibidor da bomba de protões (IBP) exibido um IC 50 de 1,1? M, no mesmo ensaio. Ao contrário de PPIs, atividade inibitória ML 3000 foi independente do pH e foi reversível. AINEs selectivos e não selectivos mostraram nenhuma actividade de H, K-ATPase inibidora no mesmo ensaio. No segundo modelo, o ML 3000 inibiu tanto a histamina e a acumulação de ácido estimulada por forscolina (IC 50 = 40 e 45? M), consistente com o ML 3000 de inibição da bomba de protões. No terceiro modelo, o ML 3000 inibiu tanto a linha de base e a secreção estimulada-1β IL interleucina-8 a partir de células AGS (IC 50 = 0,46 e 1,1 pM, respectivamente), embora este último efeito parece não estar relacionada com a actividade inibidora da 5-lipoxigenase de ML 3000 (Figura 8D).
Publicado IC 50 para o omeprazole com respeito à gama de actividade da bomba de protões gástrica a partir de 470 nM a 36 pM dependendo das condições do ensaio [23-25]. Para outros IBP, picoprazole IC 50 é de 2? M [26], rabeprazole IC 50 é de 72 nM [23], e lansoprazol IC 50 é de 2,1 mM [27]. A vasta gama de publicada PPI IC 50 valores para microssomal H, K-ATPase reflecte a necessidade mecanicista para o composto acidificação para permitir a formação de um sulfóxido de tiol-reactivo intermédio que, em seguida, derivatizes irreversivelmente H, K-ATPase α subunidade resíduos de cisteína que conduzem a inibição enzimática.
Estes dados 3000 ML também contrastam drasticamente com a inibição omeprazol de acúmulo de ácido em células parietais isoladas. Ácido capacidade secretória IC 50 (em células parietais isoladas) de inibidores da bomba de protões (IBP), tais como omeprazole, rabeprazole e lansoprazole estão na gama de 59 nM a 360 nM de [27, 28]. A maior potência de IPP no contexto da capacidade de secreção de ácido em comparação com microssomal H, K-ATPase (IC 50s que variam de 72 nM a 40 uM) reflecte a activação do ácido mais completa de IPP em isolado canalículos célula parietal que ocorre em em Os ensaios microssomais in vitro a pH 6,1 ou superior. a PGE
2 de dados estão em contraste com um estudo anterior no qual nenhum efeito inibidor de PGE 2 no porco H gástrica, K-ATPase [29] foi relatado . As diferenças no ensaio de ATPase específica utilizada nesse estudo podem ser responsáveis ​​por esta diferença. Desde ML3000 e ácido araquidónico são anfifílicos aniónicos, os seus efeitos inibidores poderiam resultar de interacções específicas com H, locais de ligação de subunidade K-ATPase, ou de interacções hidrofóbicas específicas-menos com lípidos de membrana microssomal H, K-ATPase-associados, ou uma combinação de ambos os factores.
a reversibilidade de ML 3000 inibição da actividade de H, K-ATPase in vitro, ilustrado na Figura 2B, contrasta com a irreversibilidade da inibição da H, K-ATPase de benzimidazoles substituídos tais como o omeprazole ou lansoprazole.

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