Inhibering af gastrisk H, K-ATPase-aktivitet og gastrisk epitelcelle IL-8 sekretion af pyrrolizin derivat ML 3000

Inhibering af gastrisk H, K-ATPase-aktivitet og gastrisk epitelcelle IL-8 sekretion af pyrrolizin derivat ML 3000
Abstract
Baggrund
ML 3000 ([2,2-dimethyl-6- (4-chlorphenyl ) -7-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] -eddikesyre) er en inhibitor af både cyclooxygenase og 5-lipoxygenase in vitro, og viser lovende som en ny ikke-steroidt anti-inflammatorisk lægemiddel (NSAID). I modsætning til konventionelle NSAID der er forbundet med gastriske ulcerogene virkninger, ML 3000 forårsager lidt eller ingen skader på maveslimhinden, selvom det betydeligt trykker gastrisk prostaglandinsyntese.
Metoder
Som led i et forsøg på at klarlægge mekanismerne bag den gastriske besparende egenskaber af ML 3000, studerede vi effekterne af ML 3000 på H, K-ATPase-aktivitet in vitro, på syre ophobning i isolerede gastriske parietalceller, og på IL-8 sekretion af gastriske epitelceller i kultur.
Resultater
SCH28080-følsomme H, K-ATPase-aktivitet i højt oprenset svin gastriske mikrosomer blev dosisafhængigt inhiberet af ML 3000 (IC 50 = 16,4 uM). Inhibering var reversibel, og ufølsom til ml 3000 forsuring i pH-området 2,0-8,0. I kanin gastriske parietalceller,
ML 3000 dosisafhængigt inhiberede histamin-stimuleret syre akkumulering (IC 50 = 40 uM) og forskolin-stimuleret syre akkumulering (IC 50 = 45 uM). Endelig i human gastrisk adenocarcinom (AGS) -celler, ML 3000 dosisafhængigt inhiberede både baseline og IL-1β-stimulerede (20 ng /ml) IL-8-sekretion med IC 50s på 0,46 uM og 1,1 uM hhv.
Konklusion
dataene indikerer, at ML 3000 påvirker syre-sekretoriske mekanismer nedstrøms for cAMP mobilisering induceret af histamin H 2 receptoraktivering, at det direkte inhiberer H, K-ATPase-specifik aktivitet, og at baseline gastrisk epitelcelle IL-8 sekretorisk inhibering kan være medieret af ML 3000 inhibering af 5-lipoxygenase-aktivitet. Vi konkluderer, at disse gastrisk funktion hæmmende data kan ligge til grund mavens besparende egenskaber ML 3000.
Baggrund
farmakologiske egenskaber steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID) skyldes deres undertrykkelse af prostaglandinsyntesen fra arachidonsyre [1] . Inhibering af gastrisk prostaglandin synteser ledsages imidlertid ved nedsat gastrisk mucosal blodstrøm, med ledsagende mucosal følsomhed over for topisk skade ved en række af irriterende stoffer [2]. En lovende farmakologisk strategi for at undgå gastrisk komplikationer af NSAID administration fokuserer på samtidige cyclooxygenase og 5-lipoxygenase hæmning, med det formål at undertrykke leukotrien syntese. 5-lipoxygenase omdanner arachidonsyre til leukotriener, blandt hvilke leukotrien B4 er kemotaktisk for leukocytter og bidrager dermed til inflammatoriske mekanismer, der fører til gastrointestinale ulcera [3]. Den pyrrolizin derivat ML 3000 ([2,2-dimethyl-6- (4-chlorophen-yl) -7-phenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] -eddikesyre) er en hæmmer af både cyclooxygenase og 5-lipoxygenase in vitro [4, 5], og shows lover som en ny NSAID. ML 3000 reducerer gastrisk prostaglandin E2-syntese i rotter maven og blod, selvom signifikant inhibering af gastrisk eller blod leukotrien B4-syntese ikke blev påvist [6]. Vigtigst, ML 3000 har ingen effekt på leukocyt vedhæftning i mesenteriske venuler, og forårsager ingen maveslimhinden skade [6].
I dyremodeller, blev ML 3000 sig at være farmakologisk godartet. Således gjorde forbindelsen ikke påvirke rotte bevægelsesaktivitet eller hexobarbital-induceret søvn, havde ingen kardiovaskulære eller respiratoriske effekter på rotter og hunde, var uden indflydelse på neuromuskulær funktion hos katte, og forårsagede hverken gastrisk skader eller peristaltisk forstyrrelser [7]. ML 3000 fremkaldte en svag spasmogen respons i marsvine-ileum, og forårsagede en lille forbigående reduktion i urinproduktion i rotter [7]. Genotoksicitetsundersøgelser indikerer, at ML 3000 har nogen virkning på gen mutationsfrekvenser i bakterier eller pattedyrceller, på unscheduled DNA-syntese, eller om hyppigheden af ​​kromosomafvigelser i rotte knoglemarvsceller [8]. 14C-mærket ML 3000 distributions- og udskillelsesvej hos rotter indikerer enterohepatisk cirkulation og glucuronidkonjugation af ML 3000 [9].
Farmakologiske profil af ML 3000 som undersøgt i dyremodeller viser anti-inflammatorisk, analgetisk, antipyretisk, antiastmatiske, og antiaggregative aktivitet ved en dosis, som forårsager ingen gastrisk beskadigelse [4, 10]. Akutte og kroniske antiinflammatoriske egenskaber af ML 3000 undersøgt i adjuvansinduceret rottepoteødem model [11] viser, at selv indomethacin er noget mere potent som et anti-inflammatorisk middel, blev der ikke gastrisk beskadigelse noteret med ML 3000 op til 100 mg /kg /d po, ​​mens ulcerogene dosis (UD 50) til indomethacin var 7 mg /kg /d po
gastrisk ulceration fremkaldt af NSAID begrænser væsentligt anvendeligheden af ​​disse lægemidler. Det er klart, at kombinationen af ​​anti-inflammatoriske og gastriske besparende egenskaber udvises af ML 3000 gør denne forbindelse til en attraktiv kandidat til yderligere undersøgelse. To gastriske mucosale funktioner, som spiller vigtige roller i gastrisk ulceration er syresekretion og interleukin-8 sekretion. Acid sekretoriske inhibitorer er blandt de mest højt-ordineret medicin, hvilket afspejler den fysiologiske ordsprog "Ingen syre, uden ulceration". Farmakologisk eller patofysiologisk overtrædelser af de maveslimhinden barrierer til at bakke diffusion af HCI fører til hurtig erosion af mavens epitel monolag og deraf ulceration af slimhinden. Hæmning af syresekretion ved antagonisme på parietalcellen histamin H2-receptor (cimetidin), eller ved direkte kovalent derivatisering og inaktivering af gastrisk protonpumpe (omeprazol, lansoprazol, rabeprazol, esomeprazol, etc) er rutine for forbedring og fremme af heling af gastrisk sår. Således kan gastriske besparende effekter af ML 3000 være relateret til syre sekretorisk inhibering med forbindelsen.
En komplementær gastrisk skånende virkning ML 3000 kan involvere modulering af gastrisk sekretion af pro-inflammatoriske cytokin IL-8. Der er rapporteret aspirin-induceret gastrisk skade at være forbundet med forøget antral produktion af IL-8 [12]. Ulcerogene bakterien Helicobacter pylori
har vist sig at øge hastigheden og amplituden af ​​IL-8 sekretion både in vitro og in vivo [13-15], og at opregulere IL-8-genekspression [16]. Lignende IL-8 prosecretory virkninger ses som et resultat af IL-1β stimulering af gastriske epitelceller. Sammenligning af virkningerne af ML 3000 og af andre NSAID'er på disse gastriske sekretoriske aktiviteter kan belyse den mekanisme, ved hvilken ML 3000 forhindrer dannelsen af ​​gastriske slimhindelæsioner.
For at afklare mekanismer bag den gastriske besparende egenskaber af ML 3000, vi undersøgte virkningen af ​​ML 3000 på to gastriske mucosale sekretoriske funktioner med roller i ulcerogenesis: sekretion af saltsyre, og sekretion af det inflammatoriske cytokin interleukin-8. Vore data viser, at ML 3000 inhiberer gris gastrisk mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet, inhiberer histamin-stimuleret forsuring i kanin gastriske parietalceller, og inhiberer IL-1β-stimulerede IL-8-sekretion fra humane gastriske epitelceller. Salg Methods
Reagenser
ML 3000 og ZD-2138 blev leveret af Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazol blev leveret af AstraZeneca R & D, Molndal, Sverige, SCH 28080 var fra Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC kom fra Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, og NS 398 kom fra Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arachidonsyre, indomethacin, acetylsalicylsyre, naproxen, PGE 2, leukotriener B4 og D4, og IL-1β blev alle erhvervet fra Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich) blev anvendt til at opløseliggøre ML3000, SCH28080, ZD-2138 TEDBC, NS 398, og indomethacin. Acetylsalicylsyre og naproxen opløst i ATPase assay buffer (se nedenfor
). Arachidonsyre og PGE 2 blev opløst i absolut ethanol, og omeprazol blev opløst i methanol. Leukotriener B4 og D4 blev leveret opløst i en 70:30 blanding af methanol og 17 mM ammoniumacetat. IL-1β blev opløst i phosphatbufret saltvand (pH 7,4), 0,1% vægt /volumen okseserumalbumin. Alle assays under anvendelse af disse forbindelser indgår passende kontrol opløsningsmiddel og alle opløsningsmidler var til stede ved koncentrationer under 1% vægt /volumen i det endelige assay-blanding.
Fremstilling af H, K-ATPase
mikrosomale gastrisk H, K-ATPase blev fremstillet ud fra svin gastriske mucosale homogenater ved differentiel og saccharose /Ficoll tringradient centrifugering som tidligere [17] beskrevne. Dette præparat giver en relativt tung (7% Ficoll /1,1 M saccharose interface) GII mikrosomal fraktion, der viste ingen latensen af ​​K-ATPase-aktivitet, og som omfattede ~ 90% H, K-ATPase, baseret på densitometri af en 94 kDa bånd ved SDS-PAGE-analyse. GII mikrosomer blev opbevaret ved -80 ° C i 20% glycerol.
H, blev K-ATPase-assay
ATP hydrolytisk aktivitet af svine gastrisk mikrosomer kvantificeret som orthophosphat frigivelse fra underlaget ATP under anvendelse af et kolorimetrisk malakitgrønt procedure [18] . ATPase-assays blev udført i 96-brønds mikroplader. Kort fortalt, 100 pl /brønd assaybuffer (60 mM Tris-HCI, pH 7,4, 2 mM MgC 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCI, ± 50 pM SCH28080), indeholdende 80 ng mikrosomal H, K-ATPase , ML 3000 (10 -9 M til 10 -4 M) eller andre forbindelser, og 1 mM ATP blev inkuberet i 30 min ved 37 ° C. Enzymatisk aktivitet blev standset ved tilsætning (45 pl /brønd) af kolorimetrisk reagens (0,07% malakitgrønt, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% ammoniummolybdat tetrahydrat, 0,134% Tween-20). Efter 10 sekunder blev farvereaktionen udviklet ved tilsætning (45 pl /brønd) på 15% natriumcitrat. Efter 45 minutter ved stuetemperatur blev absorbansen af ​​brøndene ved 570 nm målt i en mikropladelæser.
At måle effekterne af ML 3000 forsuringen på ATPase-inhibering, ML 3000 alikvoter (10 mM i 5 mM Tris-HCI) var titreret til pH-værdier i området fra 2.0 til 7,4 i 30 min. Gastric mikrosomer suspenderet i standard ATPase assay buffer ved pH 7,4 blev inkuberet i 30 minutter med syrnede portioner af ML 3000 (16,6 uM endelig ML 3000 koncentration) og derefter ATPase-aktivitet blev målt som beskrevet ovenfor. Til måling omeprazol inhibering af H, K-ATPase-aktivitet, blev gastriske mikrosomer suspenderet i ATPase assay buffer ved pH 6,1 inkuberet i 30 minutter med varierende koncentrationer af omeprazol. Omeprazol syrning til pH 6,1 var nødvendigt at tillade dannelse af den inhiberende thiol-reaktivt sulfoxidmellemproduktet [19]. Mavens mikrosomer blev derefter overført til standard ATPase assay puffer ved pH 7,4, og ATPase-aktivitet blev målt som beskrevet ovenfor. Specifik H, K-ATPase-aktivitet blev beregnet som forskellen i mikrosomale ATPase aktiviteter i nærvær og fravær af den specifikke reversible gastrisk H, K-ATPase-inhibitor SCH28080, og blev udtrykt som umol P i /mg protein /time. H, K-ATPase-aktiviteten af ​​frisk fremstillede svin gastriske mikrosomer varierede fra 140 til 170 umol P i /mg protein /time. Grafisk afbildning af dataene viser procent inhibering af H, K-ATPase-aktivitet som funktion af forbindelseskoncentrationer.
Primær cellepræparat
Gastriske parietale celler blev isoleret fra New Zealand White kaniner ved pronase /collagenase fordøjelse af fundiske slimhinde efterfulgt ved berigelse af celler på diskontinuerte Nycodenz gradienter som tidligere [20] beskrevne. Parietalcellen præparater indeholdt ca. 10 7 celler /mave, hvoraf 80 ± 5% var parietalcellerne baseret på immuncytokemi med H, K-ATPase-specifikt monoklonalt antistof.
Acid Ophobning Assay
aminopyrin ophobning i parietal celler blev vurderet i 96 brønds filterplader med Durapore-membraner, som tidligere [21] beskrevne. Kort beskrevet blev celler præinkuberet med [ 14C] -aminopyrine og derefter 100.000 celler /200 pi per brønd blev inkuberet med eller uden testforbindelser i 15 minutter før inkubering i yderligere 30 min i fravær eller nærvær af 100 uM histamin eller 100 uM forskolin. Alle bestemmelser blev udført i fire eksemplarer. Basal aminopyrin akkumulering blev bestemt som aminopyrin akkumulering i ubehandlede celler trækkes fra akkumulering i nærvær af KSCN (en afspejling af ikke-specifik isotop trapping). Grafisk afbildning af dataene viser procent inhibering af histamin-stimuleret syre ophobning af cellerne som funktion af forbindelseskoncentrationer.
Gastrisk adenocarcinom Celler
Humane gastrisk adenocarcinom-celler (AGS celler, ATCC CRL 1739), blev holdt i AGS medium (Ham F-12, 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin G, 0,25 ug /ml amphotericin B, 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en CO 5% 2/95% luft inkubator og anvendt mellem passage 42 og 56. til undersøgelser af IL-8 sekretion, blev AGS celler udpladet i 96-brønds plader (50.000 celler /100 pl /brønd) og fik lov til at binde i 18 timer ved 37 ° C i 5% CO 2/95% luft. Celler blev derefter inkuberet med testforbindelserne i nærvær og fravær af IL-1β i 24 timer, på hvilket tidspunkt prøver af medium blev fjernet fra brøndene og opbevaret ved -70 ° C. IL-8-koncentrationer af prøverne blev bestemt ved enzymkoblet immunosorbent assay (Human IL-8 Duo-Set ELISA udvikling system, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Grafisk afbildning af dataene viser procent inhibering af ustimuleret eller stimuleret IL-8 sekretion som funktion af forbindelseskoncentrationer
Statistiske analyser
Alle eksperimenter blev udført mindst tre gange.; datapunkter i hvert assay repræsenterer målemidler fra tredobbelte prøver. Datapunkter montering af en tre-parameter logistisk ligning blev afbildet grafisk som sigmoidale dosisresponskurver ved anvendelse af Prism statistiske pakke (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Halv-maksimal hæmmende koncentrationer (IC 50) og IC 50 95% konfidensintervaller (CI) blev også beregnet ved anvendelse af Prism. Datapunkter ikke passer en tre-parameter logistisk blev trukket som simple punkt-til-punkt-kurver. Standard fejl var et mål for variansen bruges til fejllinjer i grafisk afbildning af data
Resultater
Effekter af ML 3000 på H, K-ATPase-aktivitet
Gastrisk H, K-ATPase aktivitet blev dosisafhængig hæmmet af ML 3000, med en halvmaksimal inhiberende koncentration (IC 50) på 16,4 uM (CI = 6,84 - 39,3 uM) (figur 1A). Den inhiberende aktivitet af ML 3000 blev sammenlignet med den af ​​en klassisk protonpumpeinhibitor (PPI), den substituerede benzimidazol omeprazol. Figur 1B viser virkningen af ​​omeprazol på H, K-ATPase-aktivitet under assaybetingelser er identiske med dem i figur 1A; den beregnede IC 50 for omeprazol var 1,7 uM (CI = 0,26 til 11,3 uM). Disse data viser, at ML 3000 er betydeligt mindre potent end omeprazol med hensyn til gastrisk H, K-ATPase-inhiberende aktivitet, i det mindste i fastsættelsen af ​​denne særlige in vitro-analyse under de specificerede betingelser. For at bestemme om ML 3000 viste sammenlignelige syre-aktiveringsegenskaber blev en halvmaksimal inhiberende koncentration af ML 3000 titreret til forskellige pH-værdier og virkningerne på H, K-ATPase-aktivitet blev målt. Som vist i figur 2A, forsuring af ML 3000 havde ingen signifikant virkning på dens H, K-ATPase-inhiberende profil. Disse data viser, at ML 3000 i modsætning til omeprazol, ikke kræver forsuring for induktion af inhiberende aktivitet. Eftersom PPI er irreversible inhibitorer af H, K-ATPase-aktivitet, kovalent binding til den katalytiske α subunit, søgte vi at bestemme, om ML 3000 hæmning af H, K-ATPase var reversibel eller irreversibel. Gastrisk H, blev K-ATPase-berigede mikrosomer behandlet med en maksimalt-inhiberende koncentration af ML 3000 og derefter fortyndet med et stort overskud af buffer til at reducere ML 3000-koncentration fra 100 uM til 3,3 uM. Resultaterne vist i figur 2B, indikerede, at fortynding af ML 3000 restaureret H, K-ATPase-aktivitet, og er konsistent med ML 3000 inhibering H, K-ATPase-aktivitet på en reversibel måde, dvs.., ML 3000 ikke covalent derivatisere enten underenhed af gastrisk H, K-ATPase, i det mindste under betingelserne for den foreliggende in vitro-assay af H, K-ATPase-aktivitet. I denne henseende ML 3000 er kinetisk ligner SCH28080, den specifikke reversibel inhibitor af gastrisk H, K-ATPase. Figur 1 dosisafhængig inhibering af H, K-ATPase-aktivitet ved ML 3000 (A) og ved omeprazol (B). (EN). Gastric mikrosomer suspenderet i ATPase assay buffer ved pH 7,4 blev inkuberet i 30 minutter med forskellige koncentrationer af ML 3000 og ATPase-aktivitet blev derefter målt ved pH 7,4. Den halve maksimale hæmmende koncentration (IC50) for ML 3000 var 16,4 uM (CI = 6,84 til 39,3 uM). (B). Gastric mikrosomer suspenderet i ATPase assay buffer ved pH 6,1 blev inkuberet i 30 minutter med varierende koncentrationer af omeprazol, og derefter overført til standard ATPase assay buffer ved pH 7,4 for ATPase-aktivitet måling. IC50 for omeprazol var 1,1 uM (CI = 0,26 til 11,3 uM). De data-punkter viser middelværdi ± s.e. fra tre uafhængige assays i hver af hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet blev målt i tre eksemplarer.
Figur 2 Virkning af ML 3000 syring H, K-ATPase-aktivitet (A), og ML 3000 hæmning af H, K-ATPase-aktivitet er reversibel (B). (A) ML 3000 alikvoter (10 mM i 5 mM Tris-HCI) blev titreret til pH-værdier i området fra 2.0 til 7,4 i 30 minutter før tilsætning til standard ATPase assay buffer (pH 7,4) indeholdende gastriske mikrosomer. (B) Gastriske mikrosomer blev behandlet med en maksimal-inhiberende koncentration (100 uM) af ML 3000. mikrosomale Suspensionen blev derefter fortyndet med et stort overskud af buffer til at reducere ML 3000-koncentration fra 100 uM til 3,3 uM. I både (A) og (B), de data-punkter viser middelværdi ± s.e. fra tre uafhængige assays i hver af hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet blev målt i tre eksemplarer.
arachidonsyre og prostaglandin E 2 (PGE 2) også dosisafhængigt inhiberede H, K-ATPase-aktivitet, med IC 50 af 16,7 uM (CI = 8,9-31,5 uM) og 15 uM (CI = 3,96 til 57,3 uM) henholdsvis (figur 3A og 3B). Da ML 3000 viser også 5-lipoxygenase inhibition, studerede vi effekterne af to lipoxygenaseinhibitorer på mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet. Figur 4A viser, at 2- (1-thienyl) ethyl-3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), en kraftig inhibitor af 5-, 12-, og 15-lipoxygenses, inhiberede mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet med en IC 50 af 22,6 pM (CI = 6,3-81,2 pM). I modsætning hertil 5-lipoxygenase-specifik inhibitor 6 - ((3-fluor-5- (methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-4-yl) phenoxy) methyl) chinolin (ZD-2138 ) havde en minimal virkning på H, K-ATPase-aktivitet (~ 20% hæmning ved 10 -5 M) (figur 4B). Disse data er i overensstemmelse med gastrisk mikrosomale 12- og 15-lipoxygenaser spiller en rolle i H, K-ATPase-aktivering, eller med direkte interaktion af TEDBC med H, K-ATPase-underenheder ændring enzym konformation og dermed aktivitet. Det er klart, begge fortolkninger er provokerende og fortjener yderligere undersøgelse. Figur 3 Inhibering af H, K-ATPase-aktivitet ved arachidonsyre (A) og prostaglandin E2 (B). Gastric mikrosomer suspenderet i ATPase assay buffer ved pH 7,4 blev inkuberet i 30 minutter med varierende koncentrationer af arachidonsyre eller PGE2 og ATPase-aktivitet blev derefter målt ved pH 7,4. IC50 for arachidonsyre var 16,7 uM (CI = 8,9-31,5 uM), og IC50 for PGE2 var 15 uM (CI = 3,96 til 57,3 uM). De data-punkter viser middelværdi ± s.e. fra tre uafhængige assays i hver af hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet blev målt i tre eksemplarer.
Figur 4 Inhibering af H, K-ATPase-aktivitet ved 5-, 12- og 15-lipoxygenase inhibitor TEDBC (A), og 5-lipoxygenase-inhibitor ZD-2138 (B). Gastric mikrosomer suspenderet i ATPase assay buffer ved pH 7,4 blev inkuberet i 30 minutter med forskellige koncentrationer af TEDBC eller ZD-2138 og ATPase-aktivitet blev derefter målt ved pH 7,4. I (A), de data-punkter viser middelværdi SCH28080-følsom ATPase aktivitet målt i tre eksemplarer på et af tre uafhængige analyser; er vist typiske data. De data-punkter i (B) viser gennemsnit ± s.e. fra tre uafhængige assays i hver af hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet blev målt i tre eksemplarer.
For at sammenligne H, K-ATPase-inhiberende virkning af ML 3000 med andre NSAID'er, målte vi effekten af ​​acetylsalicylsyre, NS 398, naproxen og indomethacin på protonpumpe aktivitet. Alle fire NSAID'er var uden inhiberende virkninger på mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet ved koncentrationer op til 10 -4 M (10 -3 M for acetylsalicylsyre) (figur 5A, 5B, 5C og 5D). Indomethacin er tidligere rapporteret at inhibere gastrisk H, K-ATPase ved noget højere koncentration (K i = 0,67 × 10 -3 M) [22]. Vores data klart skelnes ML 3000 fra andre NSAID i form af hæmmende effekt på gastriske H, K-ATPase-aktivitet; det mekanistiske grundlag for denne forskel, og den potentielle sammenhæng med den observerede gastrisk-besparende egenskab af ML 3000, mangler at blive undersøgt. Figur 5 Virkninger af acetylsalicylsyre, NS 398, naproxen og indomethacin på H, K-ATPase-aktivitet. Gastric mikrosomer suspenderet i ATPase assay buffer ved pH 7,4 blev inkuberet i 30 minutter med varierende koncentrationer af acetylsalicylsyre, NS 398, naproxen eller indomethacin og ATPase-aktivitet blev derefter målt ved pH 7,4. De data-punkter viser middelværdi SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet målt i tre eksemplarer i en af ​​tre uafhængige assays; typiske data er vist i hvert enkelt tilfælde.
Endelig, for at fastslå, om ML 3000 hæmning af gastrisk H, K-ATPase afspejlede stoffets effekter på formodede funktionelle leukotrien metaboliske veje til stede i svin gastrisk mikrosomer, vi studerede virkningerne af leukotrien B4 og D4 på H, K-ATPase-aktivitet. Opløselighed spørgsmål udelukket studere LTB4 eller LTD4 koncentrationer over 1 uM. Som vist i figur 6A og 6B viste hverken leukotrien enhver inhiberende aktivitet over H, K-ATPase ved fysiologiske koncentrationer (10 -9-10 -8 M); kun på ikke-fysiologiske koncentrationer på mere end 10 -7 M var der nogen signifikant svækkelse af H, K-ATPase-aktivitet. Figur 6 Virkninger af leukotriener B4 og D4 på SCH28080-følsomme H, K-ATPase-specifik aktivitet. Gastric mikrosomer suspenderet i ATPase assay buffer ved pH 7,4 blev inkuberet i 30 minutter med forskellige koncentrationer af leukotrien B4 eller leukotrien D4 og ATPase-aktivitet blev derefter målt ved pH 7,4. De data-punkter viser middelværdi ± s.e. fra tre uafhængige assays i hver af hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet blev målt i tre eksemplarer.
Effekter af ML 3000 på gastrisk parietalcellerne histamin-stimuleret syre ophobning
ML 3000 dosisafhængigt inhiberede histamin-stimuleret (100 uM) syre ophobning af kanin gastriske parietalceller, med en halvmaksimal inhiberende koncentration (IC 50) af 40 uM (figur 7A). ML 3000 også dosisafhængigt inhiberede forskolin-stimuleret (100 uM) syre ophobning af kanin gastriske parietalceller, med en IC 50 ~ 45 pM (figur 7B). Disse data indikerer, at ML 3000 påvirker parietalcellerne syre-sekretoriske mekanismer nedstrøms for cAMP mobilisering induceret af histamin H 2 receptoraktivering. Dataene er konsistente med ML 3000 inhibering af parietalcellerne syresekretion følge af direkte interaktion mellem ML 3000 med det gastriske H, K-ATPase. den discepancy mellem ML 3000 IC 50 i mikrosomale vesikler (15 uM) og i isolerede parietalceller (40-45 uM) tyder dog på, at ML 3000 adgang til den intracellulære H, kan K-ATPase rum i parietalceller blive bremset ved permeabilitet begrænsninger på plasmamembranen. Alternativt kan ML 3000 være underlagt cytoplasmatiske metaboliske ændringer, som begrænser hæmmende effekt af forbindelsen. Figur 7 ML 3000 inhiberer syre akkumulering i kanin gastriske parietalceller. (A) Dosisafhængig inhibering med ML 3000 af histamin-stimuleret (100 uM) syre ophobning af kanin gastrisk parietalceller (IC50 = 40 uM). (B) Dosisafhængig inhibering med ML 3000 af forskolin-stimuleret (100 uM) syre ophobning af kanin gastriske parietalceller (IC50 = 45 uM). De data-punkter viser middelværdi ± s.e. fra fire uafhængige assays i hver af hvilke syre ophobning i parietalcellerne blev målt i to eksemplarer.
Endelig, som blev fundet med mikrosomal H, K-ATPase, andre NSAID'er, såsom acetylsalicylsyre, naproxen og NS 398 (op til koncentrationer på 10 -4 M) havde ingen virkning på syre akkumulering af isolerede kanin parietalceller (data ikke vist)
virkninger af ML 3000 på IL-1β-induceret IL-8-sekretion i humant gastrisk adenocarcinom (AGS) celler
Under baseline betingelser, AGS celler (5 x 10 4 i 100 pi dyrkningsmedium) udskilt IL-8 over en periode på 24 timer til en koncentration på ~ 225 pg /ml medium. Når de stimuleres med IL-1β (1 ng /ml), AGS celle IL-8 sekretion over en periode på 24 timer øgedes ~ 27-fold, til en koncentration på ~ 6000 pg /ml. ML 3000 hæmmede både baseline og IL-1β-stimuleret IL-8 sekretion, med IC 50'erne i 0,46 uM (CI = 0,09-2,4 uM) og 1,1 uM (CI = 0,52-2,2 uM) (figur 8A og 8B ). Figur 8 Virkninger af ML 3000 på IL-1β-induceret IL-8-sekretion i humant gastrisk adenocarcinom (AGS) celler. ML 3000 hæmmede både baseline (A) og IL-1β-stimulerede (B) IL-8 sekretion, med IC50'er på 0,46 uM (CI = 0,09-2,4 um) og 1,1 pM (CI = 0,52 - 2.2 uM) hhv. 5-lipoxygenase-specifik inhibitor ZD-2138 udviste dosisafhængig hæmning af baseline AGS celle IL-8 sekretion (C), med en IC50 på 58 nM (Cl = 15,6 - 218 nM) og minimal virkning på AGS celle IL-1β stimuleret IL-8-sekretion (D). De data-punkter viser middelværdi ± s.e. fra tre uafhængige assays i hver af hvilke IL-8-koncentrationer blev målt i tre eksemplarer.
5-lipoxygenase-specifik inhibitor (ZD-2138), som var uden effekt på mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet, viste dosis-responsiv inhibering af baseline AGS celle IL-8 sekretion (figur 8C), med en IC 50 af 58 nM (Cl = 15,6 - 218 nM). ZD-2138 udviste minimal virkning på IL-1β-stimulerede IL-8-sekretion af AGS-celler (figur 8d). H, K-ATPase-inhibering med ML 3000, som vi har vist i den foreliggende undersøgelse, ikke ligge til grund IL-8 sekretorisk inhibering i denne model, fordi immuncytokemi med H, K-ATPase-specifikt monoklonalt antistof viser ingen H, K-ATPase-ekspression i AGS celler (data ikke vist).
diskussion
Denne undersøgelse giver oplysninger om virkningerne af ML 3000 om aspekter af gastrisk fysiologi relateret til ulcerogenesis. Tre eksperimentelle modeller for gastrisk funktion blev undersøgt; højt oprenset funktionel H, K-ATPase (proton pumpe) isoleret fra maveslimhinden af ​​slagteriets hogs, isoleret kanin gastriske parietalceller, og humane gastrisk adenocarcinom celler i kultur. I den første model, ML 3000 hæmmede proton pumpe med en IC 50 på 16,4 uM. Protonpumpeinhibitoren (PPI) omeprazol vises en IC 50 på 1,1 uM i det samme assay. I modsætning PPI, ML 3000 inhiberende aktivitet var uafhængig af pH og var reversibel. Selektive og ikke-selektive NSAID'er viste ingen H, K-ATPase-inhiberende aktivitet i den samme assay. I den anden model, ML 3000 hæmmede både histamin og forskolin-stimuleret syre ophobning (IC 50 = 40 og 45 uM), i overensstemmelse med ML 3000 protonpumpe hæmning. I den tredje model, ML 3000 hæmmede både baseline og IL-1β-stimulerede interleukin-8-sekretion fra AGS-celler (IC 50 = 0,46 og 1,1 uM), selv om den sidstnævnte virkning synes relateret til 5-lipoxygenase-inhiberende aktivitet af ML 3000 (figur 8D).
Udgivet IC 50 for omeprazol i forhold til gastrisk protonpumpe aktivitet området fra 470 nM til 36 uM afhængigt af betingelserne for assayet [23-25]. For andre PPI'er, picoprazole IC 50 er 2 uM [26], rabeprazol IC 50 er 72 nM [23], og lansoprazol IC 50 er 2,1 uM [27]. Den brede vifte af offentliggjorte PPI IC 50 værdier for mikrosomal H, K-ATPase afspejler den mekanistiske nødvendighed for forbindelse forsuring at tillade dannelse af en thiol-reaktiv sulfoxid-mellemprodukt, som derefter irreversibelt derivatizes H, K-ATPase-α subunit cysteinrester førende til enzym hæmning.
Disse ML 3000 data også kontrast dramatisk med omeprazol hæmning af syre ophobning i isolerede parietalcellerne. Acid sekretorisk kapacitet IC 50'erne (i isolerede parietalcellerne) af protonpumpehæmmere (PPI'er), såsom omeprazol, rabeprazol og lansoprazol er i området 59 nM til 360 nM [27, 28]. Den større styrke af PPI i forbindelse med syre sekretorisk kapacitet i forhold til mikrosomal H, K-ATPase (IC 50'erne spænder fra 72 nM til 40 uM) afspejler mere komplet syre aktivering af PPI i isolerede parietalcellens canaliculi end forekommer i i vitro mikrosomale assays ved pH 6,1 eller højere.
PGE 2 data er i modsætning til en tidligere undersøgelse, hvor ingen hæmmende effekt af PGE 2 på svin gastrisk H, K-ATPase [29] blev rapporteret . Forskelle i den specifikke ATPase assay anvendes i denne undersøgelse kan forklare denne uoverensstemmelse. Da ML3000 og arachidonsyre er anioniske amfifiler, kan deres inhibitoriske virkninger fremkommer ved specifikke interaktioner med H, K-ATPase subunit bindingssteder, eller fra mindre specifikke hydrofobe interaktioner med H, K-ATPase-associerede mikrosomale membranlipider, eller en kombination af begge faktorer.
reversibilitet af ML 3000 hæmning af H, K-ATPase-aktivitet in vitro, vist i figur 2B, i kontrast til irreversibilitet af H, K-ATPase-inhibering med substituerede benzimidazoler, såsom omeprazol eller lansoprazol.

• CD44 /CD24 ekspression i tilbagevendende gastrisk cancer: en retrospektiv analysis
• Forholdet mellem postprandiale ændringer i hjerte-venstre ventrikel funktion, glukose og insulin koncentrationer, ventrikeltømning og mæthed i raske forsøgspersoner