Inhibíciu žalúdočné H, K-ATPázy a žalúdočných epiteliálnych buniek sekréciu IL-8, ktoré pyrrolizin derivát ML 3000

Inhibíciu žalúdočné H, K-ATPázy a žalúdočného epitelu sekréciu IL-8, ktoré pyrrolizin derivát ML 3000
abstraktné
pozadia
ML 3000 ([2,2-dimetyl-6- (4-chlórfenyl ) -7-fenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] octovej kyseliny), je inhibítor ako cyklooxygenázy a 5-lipoxygenázy in vitro, a ukazuje sľubné ako nové nesteroidného protizápalového liečiva (NSAID). Na rozdiel od bežných NSAID, ktoré sú spojené s žalúdočné ulcerogénne účinky, ML 3000 spôsobí, že málo alebo žiadne poškodenie žalúdočnej sliznice, aj keď sa výrazne potláča žalúdočnú syntézu prostaglandínu.
Metódy
V rámci snahe objasniť mechanizmy žalúdočné šetriace vlastnosti ML 3000, sme študovali účinky ML 3000 o H, k-ATPázy in vitro, na kyselinu akumuláciu v izolovaných žalúdočných parietálnych bunkách, a na sekréciu IL-8 žalúdočnými epitelovými bunkami v kultúre.
Výsledky
SCH28080 citlivé H, K-ATPázy vysoko purifikovaný ošípaných žalúdka mikrozómoch sa v závislosti od dávky inhibovaný ML 3000 (IC 50 = 16,4 uM). Inhibícia bola reverzibilná a necitlivé až ML 3000 okyslenie hodnotu pH v rozmedzí 2.0-8.0. V králičích žalúdočných parietálnych bunkách,
ML 3000 histamínom stimulovanej akumulácii kyseliny v závislosti na dávke inhibovaný (IC 50 = 40 uM) a akumulácie Forskolin stimulovanej kyseliny (IC 50 = 45 uM). A konečne, v ľudskej adenokarcinóme žalúdka (AGS) buniek, ML 3000 v závislosti od dávky inhibuje ako základné a IL-1β stimulovaných (20 ng /ml), IL-8 sekrécie s IC 50s 0,46 uM a 1,1 uM, v danom poradí.
Záver
Dáta ukazujú, že ML 3000 sa týka kyseliny sekrečnú mechanizmy, po prúde od cAMP uvoľnenie vyvolané aktiváciou H 2 receptora histamínu, ktoré priamo inhibuje H, špecifická aktivita K-ATPázy, a že základné žalúdočné epitelových IL-8 inhibícia sekrečnú môže byť sprostredkované ML 3000 inhibícia 5-lipoxygenázy. Sme došli k záveru, že tieto funkcie žalúdočné inhibičný dáta môžu byť základom žalúdočné šetriace vlastnosti ML 3000.
pozadí
farmakologických vlastností nesteroidných protizápalových liekov (NSAID), vznikajú ich potlačenie syntézy prostaglandínov z kyseliny arachidónovej [1] , Inhibícia žalúdočné syntézy prostaglandínov je sprevádzaný však zníženou žalúdočnej sliznice prietok krvi, za súčasného citlivosťou sliznice topické zranenia rôznymi dráždivých látok [2]. Sľubný farmakologické stratégie, aby sa zabránilo komplikáciám žalúdočné podávanie NSAID je zameraná na súbežné cyklooxygenázy a inhibíciu 5-lipoxygenázy, s cieľom potlačenia syntézy leukotriénov. 5-lipoxygenázy konvertuje kyselinu arachidonovú na leukotriény, medzi ktorými leukotriénu B4 je chemostatický pre leukocyty, a tým prispieva k zápalovým mechanizmov vedúcich k gastrointestinálne vredy [3]. Pyrrolizin derivát ML 3000 ([2,2-dimetyl-6- (4-chlórfenyl-yl) -7-fenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] octovej kyseliny), je inhibítor oboch cyklooxygenáza a 5-lipoxygenázy in vitro [4, 5], a vyzerá sľubne ako román NSAID. ML 3000 znižuje žalúdočnú syntézu prostaglandínu E2 v potkaním žalúdku a krvi, aj keď nebola zistená významná inhibícia žalúdočnej alebo krvi syntézy leukotriénu B4 [6]. A čo je najdôležitejšie, ML 3000 nemá žiadny vplyv na adherencie leukocytov v mezenterických žilky, a nespôsobuje žiadne zmeny žalúdočnej sliznice [6].
Na zvieracích modeloch, ML 3000 sa zistilo, že sú farmakologicky neškodné. To znamená, že zlúčenina nemá vplyv na potkany pohybovú aktivitu alebo hexabarbital spánku vyvolaná, nemal žiadne kardiovaskulárne alebo respiračné účinky u potkanov a psov, bez toho by bol vplyv na neuromuskulárnu funkcie u mačiek, a spôsobil ani poškodenie žalúdočné ani peristaltické poruchy [7]. ML 3000 vyvolalo slabú spasmogenic odozvu v ilea morčaťa, a spôsobil malú prechodné zníženie vylučovania moču u laboratórnych potkanov [7]. Štúdie genotoxicity ukazujú, že ML 3000 nemá žiadny vplyv na génovú mutáciu frekvencie v baktériách alebo cicavčích bunkách, na neplánovanú syntézou DNA, alebo na frekvencii chromozomálnych aberácií v bunkách kostnej drene potkanov [8]. 14C ML 3000 distribúcie a vylučovacie štúdie na potkanoch ukazujú enterohepatálny obeh a konjugácie glukuronidových ML 3000 [9].
Farmakologického profilu ML 3000, ako študoval u zvieracích modeloch ukazuje protizápalový, analgetický, antipyretický, antiastmatikum a antiaggregative činnosť v dávke, ktorá nespôsobuje žiadne poškodenie žalúdočnej [4, 10]. Akútne a chronické protizápalové vlastnosti ML 3000 študoval v potkaním opuch labky modelu indukovanej adjuvantnej [11], ukazujú, že hoci indometacín je trochu viac účinné ako protizápalová činidlá, žiadne poškodenie žalúdočnej bol zaznamenaný u ML 3000 až 100 mg /kg /d po, ​​vzhľadom k tomu, ulcerogénne dávka (UD 50) pre indometacín bol 7 mg /kg /d po
žalúdočné vredy vyvolané NSAID výrazne obmedzuje použiteľnosť týchto liekov. Je zrejmé, že kombinácia anti-zápalových a žalúdočných vlastnosti šetriace vykazovaných ML 3000 je táto zlúčenina atraktívnym kandidátom pre ďalšie štúdium. Dva žalúdočnej sliznice funkcie, ktoré hrajú dôležitú úlohu pri žalúdočných vredov sú sekréciu kyseliny a sekréciu interleukínu-8. sekrečnú inhibítory kyselín sú medzi najviac vysoko predpísané lieky, čo odráža fyziologickú príslovie "No kyselinu, žiadny vred". Farmakologické alebo patofyziologický Porušenie zo žalúdočnej sliznice prekážok späť difúzie kyseliny chlorovodíkovej vedie k rýchlemu erózie žalúdočnej epitelové monovrstvy a následné ulcerácia sliznice. Inhibícia sekrécie kyseliny antagonizmom na parietálnych buniek histamínových H2 receptorov (cimetidín), alebo priamou kovalentné derivatizácia a inaktiváciu žalúdočné protónovej pumpy (omeprazol, lanzoprazol, rabeprazol, ezomeprazol, etc) je rutina pre zlepšenie a podporu hojenia žalúdočných vredy. To znamená, že žalúdočné nešetriacimi účinky ML 3000 môže mať súvislosť s inhibíciou kyseliny sekrečného od tejto zlúčeniny.
Komplementárna žalúdočné šetriace účinok ML 3000 môže zahŕňať modulácia žalúdočnej sekrécie prezápalového cytokínu IL-8. Aspirín indukovanej žalúdočnej zranenie bolo hlásených byť spájaný so zvýšenou antrálnej produkciou IL-8 [12]. Ulcerogénne baktérie Helicobacter pylori
bolo preukázané, že zvyšuje rýchlosť a amplitúdu sekrécie IL-8, a to ako in vitro, tak in vivo [13-15], a až regulovať IL-8 génovú expresiu [16]. Podobné IL-8 prosecretory účinky sú považované za dôsledok IL-1 stimulácia žalúdočných epiteliálnych buniek. Porovnanie účinkov ML 3000 a iných NSAID na tieto vylučovanie žalúdočnej činnosti môžu objasniť mechanizmus, ktorým ML 3000 zabraňuje tvorbe žalúdočných slizničných lézií.
S cieľom objasniť základné mechanizmy žalúdočné šetriace vlastnosti ML 3000, my skúmala účinok ML 3000 na dvoch žalúdočnej sliznice sekrečnú funkcie s rolou v ulcerogenesis: sekréciu kyseliny chlorovodíkovej, a sekrécia cytokínu interleukín zápalových-8. Naše údaje ukazujú, že ML 3000 inhibuje prasacej žalúdočné mikrozomálne H, K-aktivitu ATPázy, inhibuje histamínom stimulovanej okysľovanie v králičích žalúdočných parietálnych buniek a inhibuje IL-1-stimulovanej IL-8 sekréciu žalúdočných ľudskými epitelovými bunkami.
Metódy
Chemikálie
ML 3000 a ZD-2138 boli poskytnuté Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazol bola poskytnutá spoločnosťou AstraZeneca R & D, Molndal, Švédsko, SCH 28080 bol od Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC prišiel z Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, a NS 398 pochádzalo z Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. arachidonová kyselina, indometacín, kyselina acetylsalicylová, naproxén, PGE 2, leukotriénov B4 a D4, a IL-1β boli všetky získané od Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimetylsulfoxid (Sigma-Aldrich), bola použitá na rozpustenie ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, a indometacín. Kyselina acetylsalicylová a naproxén sa rozpustí v ATPázy testovacom pufri (pozri nižšie
). Kyselina arachidonová a PGE 2 sa rozpustí v absolútnom etanole a omeprazolu sa rozpustí v metanole. Leukotriény B4 a D4 boli dodané rozpustí v 70:30 zmesi metanolu a 17 mM octanu amónneho. IL-1β sa rozpustí vo fyziologickom roztoku pufrovanom fosfátmi (pH 7,4), 0,1% hmotnosť /objem hovädzieho sérového albumínu. Všetky testy za použitia týchto zlúčenín príslušné kontroly rozpúšťadiel, a všetky rozpúšťadlá, boli prítomné v koncentráciách menších ako 1% hmotnosť /objem v konečnej testovanej zmesi.
Príprava H, K-ATPázy
mikrozómoch žalúdočnej H, K-ATPázy sa pripraví zo žalúdočnej sliznice ošípaných Homogenát diferenciálnymi a sacharózy /Ficoll krok gradientové centrifugácie, ako bolo opísané skôr [17]. Tento prípravok sa získa pomerne ťažký (7% Ficoll /1,1 M sacharóza rozhranie) GII mikrozomálne frakcie, ktoré nevykazovali žiadnu latenciu K-ATPázy, a ktorý zahŕňal ~ 90% H, K-ATPázy, na základe denzitometrie časti 94 kDa analýzou SDS-PAGE. GII mikrozómami boli skladované pri -80 ° C v 20% glycerolu.
H, K-ATPázy testu
ATP hydrolytickej aktivity ošípaných žalúdočných mikrozómov bol kvantifikovaný ako ortofosforečnan oslobodenie od substrátu ATP za použitia kolorimetrického malachitovej zelene postup [18] , ATPázové testy boli vykonávané v 96-jamkové mikrotitračné doštičky. Stručne, 100 ul /jamku testovacieho pufra (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCI, ± 50 uM SCH28080), obsahujúce 80 ng mikrozomálne H, K-ATPázy , ML 3000 (10 -9 M 10 -4 M) alebo iné zlúčeniny, a 1 mM ATP bola inkubovaná počas 30 minút pri 37 ° C. Enzymatická aktivita bola zastavená pridaním (45 ul /jamka) z kolorimetrického činidla (0,07% malachitovej zelene, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% molybdénan amónny tetrahydrát, 0,134% Tween-20). Po 10 sekundách sa farebná reakcia bola vyvinutá pridaním (45 ul /jamku), 15% citrátu sodného. Po 45 minútach pri teplote miestnosti, absorbancia každej jamky pri 570 nm bola meraná na čítačke mikrotitračných doštičiek.
Pre meranie účinkov ML 3000 acidifikácie na inhibícia ATPázy, ML 3000 alikvótne (10 mM v 5 mM Tris-HCl), boli titrovaná na pH v rozmedzí od 2,0 do 7,4 po dobu 30 minút. Žalúdočné mikrozómami suspendované v štandardnom ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4 boli inkubované po dobu 30 minút sa okyslí alikvótne ML 3000 (16,6 uM konečná koncentrácia ML 3000), a potom ATPázy aktivita bola meraná ako je popísané vyššie. Pre meranie inhibícia omeprazolom H, K-ATPázy, žalúdočnej mikrozómami suspendované v ATPázy testovacom pufri pri pH 6,1 boli inkubované po dobu 30 minút s rôznymi koncentráciami omeprazolu. Omeprazol okyslenie na hodnotu pH 6,1, nevyhnutná pre tvorbu inhibičný tiol-reaktívny medziprodukt sulfoxidu [19]. Žalúdočné mikrozómami boli potom prenesené do štandardného ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4, a ATPázy bola meraná ako je popísané vyššie. Špecifické H, K-ATPázy bola vypočítaná ako rozdiel v mikrozomálne ATPázových aktivity v prítomnosti alebo neprítomnosti špecifického reverzibilné žalúdočnej H, K-ATPázy inhibítor SCH28080, a bola vyjadrená ako umol P i /mg proteínu /hodinu. H, K-ATPázy čerstvo pripravený ošípaných žalúdočných mikrozómov v rozmedzí od 140 do 170 umol p i /mg proteínu /hodinu. Grafické znázornenie dát ukazuje percenta inhibícia H, K-ATPázy ako funkcia koncentrácie zlúčeniny.
Primárne bunkové Príprava
parietálnej bunky boli izolované z novozélandského bieleho králika štiepením prednáša /kolagenázy z fundusu sliznice s následným obohatením buniek na nespojitých Nycodenz gradientov, ako bolo opísané skôr [20]. Parietálnej bunky prípravky obsahovali približne 10 7 buniek /žalúdka, z toho 80 ± 5% boli parietálnej bunky na báze imunocytochémia s H, K-ATPázy-špecifickou monoklonálnou protilátkou Akumulácia Obsah Kyselina
akumulácie aminopyrínu do parietálnej.
buniek bola hodnotená na 96jamkových filtračných dosiek s Durapore membrány, ako bolo opísané skôr [21]. V stručnosti, bunky boli vopred inkubované s [ 14C] -aminopyrine a 100.000 buniek /200 ul na jamku boli inkubované s alebo bez testovaných zlúčenín počas 15 minút pred inkubáciou po dobu ďalších 30 minút v neprítomnosti alebo v prítomnosti 100 uM histamínu alebo 100 uM Forskolin. Všetky stanovenia bola vykonávaná v štyroch. Bazálna akumulácie aminopyrínu bola stanovená ako akumulácia aminopyrínu do neošetrených buniek odpočítaná od akumulácie za prítomnosti KSCN (odraz nešpecifické izotopu zachytávanie). Grafické znázornenie dát ukazuje percentá inhibície akumulácie kyseliny histamínom stimulovanej bunkami ako funkcia koncentrácie zlúčeniny.
Adenokarcinóme žalúdka Bunky
ľudské bunky adenokarcinóme žalúdka (AGS bunky, ATCC CRL 1739), boli udržiavané v AGS stredná (Ham F-12, 10% fetálne hovädzie sérum, 100 jednotiek /ml penicilínu G, 0,25 ug /ml amfotericínu B, 100 ug /ml streptomycínu), pri teplote 37 ° C v 5% CO 2/95% vzduchu v inkubátora a použitý medzi priechody 42 a 56. v prípade štúdií sekrécie IL-8, AGS bunky boli umiestnené do 96-jamkových doštičiek (50,000 buniek /100 ul /jamka) a ponechané prichytiť sa po dobu 18 hodín pri teplote 37 ° C v 5% CO 2/95% vzduchu. Bunky potom boli inkubované s testovanými zlúčeninami v prítomnosti a v neprítomnosti IL-1 po dobu 24 h a po tomto čase vzorky média boli odobraté z jamiek a skladované pri -70 ° C. IL-8 koncentrácia vzoriek bola stanovená enzymatického imunitného testu (IL-8 vývojový ELISA systém Human Duo-Set, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Grafické znázornenie dát ukazuje percentá inhibície nestimulované alebo stimulované IL-8, sekrécia ako funkcia koncentrácie zlúčeniny
Štatistická analýza
Všetky experimenty boli vykonané najmenej trikrát .; dátových bodov v každom teste predstavujú meranie prostriedky zo vzoriek v triplikátech. Dátové body inštaláciou troch parametrov logistickej rovnice bola vynesená do grafu ako sigmoidální krivky dávka-odpoveď za použitia štatistického balíčka Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Polovičná maximálna inhibičná koncentrácia (IC 50) a IC 50 95 intervaly% spoľahlivosti (CI) boli vypočítané s použitím Prism. Dátové body sa nehodí troch parametrov logistickej boli vypracované ako jednoduché point-to-point kriviek. Štandardná chyba bola miera rozptylu používajú pre chybové bary v grafickom zobrazení údajov o
Výsledky
Účinky ML 3000 o H, K-ATPázy
žalúdočné H, K-ATPázy bol v závislosti od dávky inhibuje ML 3000, s koncentráciu polovičnou maximálnou inhibičné (IC 50), 16,4 uM (CI = 6,84 až 39,3 uM) (obrázok 1A). Inhibičný aktivita ML 3000 sa v porovnaní s klasickým inhibítora protónovej pumpy (PPI) sa substituovaný benzimidazol omeprazolu. Obrázok 1B ukazuje účinok omeprazolu na H, K-ATPázy za testovacích podmienok rovnakých ako v obrázku 1A; vypočítaná IC 50 pre omeprazol bola 1,7 uM (CI = 0,26 až 11,3 um). Tieto dáta ukazujú, že ML 3000 je značne menej účinný ako omeprazol, pokiaľ ide o žalúdočnú H, K-ATPázy inhibičnú aktivitu, aspoň v nastavení tohto konkrétneho testu in vitro za stanovených podmienok. Na určenie, či ML 3000 zobrazená porovnateľné kyseliny aktivačný vlastnosti, je inhibičná koncentrácia polovicu maximálnej ML 3000 bol titrovaný s rôznym pH a boli merané účinky na H, K-ATPázy. Ako je ukázané na obrázku 2A, acidifikácia ML 3000 nemal žiadny významný účinok na jeho H, K-ATPázy inhibičný profil. Tieto dáta ukazujú, že ML 3000, na rozdiel od omeprazol, nevyžaduje okysľovaniu pre indukciu inhibičnej aktivity. Vzhľadom na to, že PPI sú nevratné inhibítory H, K-ATPázy, kovalentnou väzbou na katalytickú podjednotky, sme sa snažili zistiť, či ML 3000 inhibícia H, K-ATPázy bol vratný alebo nevratný. Žalúdočné H, K-ATPázy obohatené mikrozómami boli ošetrené s koncentráciou maximálne inhibičný-ML 3000, a potom sa zriedi veľkým prebytkom vyrovnávacej pamäte pre zníženie ML 3000 koncentrácii od 100 uM do 3,3 uM. Výsledky, znázornené na obrázku 2B, je uvedené, že riedenie ML 3000 obnovená H, K-aktivitu ATPázy, a sú v súlade s ML 3000 inhibícia H, K-ATPázy v reverznom spôsobom, tzn., ML 3000 nie je kovalentne derivatizovat buď podjednotku žalúdočnej H, k-ATPázy, aspoň podľa podmienok tohto testu in vitro H, k-ATPázy. V tomto ohľade, ML 3000 je kineticky podobný SCH28080, špecifický reverzibilný inhibítor žalúdočnej H, K-ATPázy. Obrázok 1 závislá na dávke inhibíciu H, K-ATPázy ML 3000 (A) a omeprazolom (B). (A). Žalúdočné mikrozómami suspendované v ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4 boli inkubované po dobu 30 minút s rôznymi koncentráciami ML 3000 a ATPázy bola potom meraná pri pH 7,4. Polovičná maximálna inhibičná koncentrácia (IC50) pre ML 3000 bola 16,4 um (CI = 6,84 až 39,3 uM). (B). Žalúdočné mikrozómami suspendované v ATPázy testovacom pufri pri pH 6,1 boli inkubované po dobu 30 minút s rôznymi koncentráciami omeprazolu, a potom sa prenesie na štandardné ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4 pre meranie aktivity ATPázy. IC 50 pre omeprazol bola 1,1 uM (CI = 0,26 až 11,3 um). Dátové body ukazujú priemer ± štandardná odchýlka z troch nezávislých testov v každom z ktorých SCH28080 citlivej ATPázy bol meraný v troch vyhotoveniach.
Obrázok 2 Účinok ML 3000 acidifikácie na H, K-ATPázy (A), a ML 3000 inhibícia H, K-ATPázy je reverzibilná (B). (A), ML 3000 alikvótne (10 mM v 5 mM Tris-HCl) boli titrované na pH v rozmedzí od 2,0 do 7,4 po dobu 30 minút pred pridaním do štandardného ATPázy testovacom pufri (pH 7,4), ktorý obsahuje žalúdočné mikrozómami. (B) Žalúdočné mikrozómami boli ošetrené s koncentráciou maximálne-inhibičný (100 uM) ML 3000. Suspenzia mikrozomálne sa zriedi veľkým prebytkom vyrovnávacej pamäte pre zníženie ML 3000 koncentrácii od 100 uM do 3,3 uM. V oboch (A) a (B), pričom dáta-body ukazujú priemer ± štandardná odchýlka z troch nezávislých testov v každom z ktorých SCH28080 citlivej ATPázy bol meraný v troch vyhotoveniach.
arachidónovej kyseliny a prostaglandín E 2 (PGE 2), tiež v závislosti na dávke inhiboval H, K-aktivitu ATPázy, s IC 50 16,7 uM (CI = 8,9 až 31,5 um) a 15 uM (CI = 3,96 až 57,3 um) na ich povrchu (obr 3A a 3B). Vzhľadom k tomu, ML 3000 tiež ukazuje inhibíciu 5-lipoxygenázy, sme študovali účinky dvoch inhibítorov lipoxygenázy na mikrozomálny H, K-ATPázy. Obrázok 4A ukazuje, že 2- (1-thienyl) etyl 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), silný inhibítor 5-, 12- a 15-lipoxygenses, potlačený mikrozomálne H, K-ATPázy s IC 50 z 22,6 uM (CI = 6,3 až 81,2 um). Na rozdiel od 5-lipoxygenázy-špecifický inhibítor 6 - ((3-fluór-5- (metoxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyrán-4-yl) fenoxy) metyl) chinolín (ZD-2138 ) mala minimálny účinok na H, k-ATPázy (~ 20% inhibícia pri 10 5 M) (obrázok 4B). Tieto dáta sú v súlade s žalúdočnej mikrozomálne 12- a 15-lipoxygenázy hrajú úlohu v H, aktivácia K-ATPázy, alebo priamou interakciou s TEDBC H, K-ATPázy podjednotky meniť konformácii enzýmu a tým aj činnosť. Je zrejmé, že oba výklady sú provokatívne a zaslúži ďalšie štúdium. Obrázok 3 Inhibícia H, K-ATPázy arachidónovej kyseliny (A) a prostaglandínu E 2 (B). Žalúdočné mikrozómami suspendované v ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4 boli inkubované po dobu 30 minút s rôznymi koncentráciami kyseliny arachidónovej alebo PGE2 a ATPázy bola potom meraná pri pH 7,4. IC 50 pre kyselinu arachidonovú bol 16,7 um (CI = 8,9 až 31,5 um), a IC50 pre PGE2 bola 15 uM (CI = 3,96 až 57,3 um). Dátové body ukazujú priemer ± štandardná odchýlka z troch nezávislých testov v každom z ktorých SCH28080 citlivej ATPázy bol meraný v troch vyhotoveniach.
Obrázok 4 Inhibícia H, K-ATPázy aktivity inhibítora TEDBC 5-, 12- a 15-lipoxygenázy (A), a 5-lipoxygenázy inhibítor ZD-2138 (B). Žalúdočné mikrozómami suspendované v ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4 boli inkubované po dobu 30 minút s rôznymi koncentráciami TEDBC alebo ZD-2138 a ATPázy bola potom meraná pri pH 7,4. V (A), pričom dáta-body ukazujú strednej SCH28080-citlivé aktivitu ATPázy meranú v troch vyhotoveniach v jednom z troch nezávislých testov; sú uvedené typické údaje. Data-body (b) znázorňujú priemer ± štandardná odchýlka z troch nezávislých testov v každom z ktorých SCH28080 citlivej ATPázy bol meraný v troch vyhotoveniach.
Aby bolo možné porovnať inhibičného účinku H, K-ATPázy ML 3000 s inými NSAID, sme merali účinky kyselinu acetylsalicylovú, NS 398, naproxén, indometacín a na aktivitu protónovej pumpy. Všetky štyri NSAID bolo bez inhibičné účinky na mikrozomálny H, K-ATPázy v koncentráciách až do 10 -4 M (10 -3 M pre kyselinu acetylsalicylovú) (obrázok 5A, 5B, 5C a 5D). Indometacín bol už bolo skôr oznámené, že inhibuje žalúdočné H, K-ATPázy v trochu vyššiu koncentráciu (K i = 0,67 × 10 -3 M) [22]. Naše údaje jasne odlíšiť ML 3000 od iných NSA, pokiaľ ide o inhibičný účinok na žalúdočnú H, K-ATPázy; mechanický základ pre tento rozdiel, a potenciálny korelácia s pozorovanou žalúdka šetriacim vlastnosti ML 3000, naďalej treba preskúmať. Obrázok 5 Účinky kyselinu acetylsalicylovú, NS 398, naproxén, indometacín a na H, K-ATPázy. Žalúdočné mikrozómami suspendované v ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4 boli inkubované po dobu 30 minút s rôznymi koncentráciami kyselinu acetylsalicylovú, NS 398, naproxén alebo indometacín a ATPázy bola potom meraná pri pH 7,4. Dátové body ukazujú strednej SCH28080-citlivé aktivitu ATPázy meraná v troch vyhotoveniach v jednom z troch nezávislých testov; Typické hodnoty sú uvedené v každom prípade.
Napokon, s cieľom stanoviť, či je ML 3000 inhibíciu žalúdočnej H, K-ATPázy odráža účinok je zlúčenina o predpokladanej funkčné leukotriénov metabolických dráh prítomný v surovom žalúdočných mikrozómoch, sme študovali účinky leukotriénu B4 a D4 z H, k-ATPázy. Problémy rozpustnosti vylúčené štúdiom koncentrácie LTB4 alebo LTD4 väčšia ako 1 uM. Ako je znázornené na obrázku 6A a 6B, ani leukotriénov neprejavili žiadne inhibičnú aktivitu proti H, K-ATPázy pri fyziologických koncentráciách (10 -9-10 -8 M); iba na non-fyziologických koncentráciách vyšších ako 10 -7 M bol tam nejaký významný útlm H, K-ATPázy. Obrázok 6 Účinky leukotriénov B4 a D4 na SCH28080 citlivé H, K-ATPázy špecifickú aktivitou. Žalúdočné mikrozómami suspendované v ATPázy testovacom pufri pri pH 7,4 boli inkubované po dobu 30 minút s rôznymi koncentráciami leukotriénu B4 alebo leukotriénu D4 a ATPázy bola potom meraná pri pH 7,4. Dátové body ukazujú priemer ± štandardná odchýlka z troch nezávislých testov v každom z ktorých SCH28080 citlivej ATPázy bol meraný v troch vyhotoveniach.
Účinky ML 3000 na parietálnej bunky akumulácie histamínom stimulovanej kyseliny
ML 3000 inhiboval v závislosti na dávke histamínu stimulovaných (100 uM) akumulácie kyseliny podľa králičích žalúdočných parietálnych bunkách, s koncentráciou polovičnou maximálnou inhibičné (IC 50), 40 uM (obr 7a). ML 3000 tiež v závislosti na dávke inhiboval Forskolin stimulovanej (100 uM) kyseliny akumulácie králičích parietálnych buniek žalúdka, s IC 50 ~ 45 uM (obrázok 7b). Tieto dáta ukazujú, že ML 3000 sa týka parietálnych buniek mechanizmy sekrečnými po prúde od cAMP indukované uvoľnenie histamínu H aktivácia receptoru 2. Tieto údaje sú v súlade s ML 3000 inhibícia sekrécie kyseliny parietálnych buniek v dôsledku priamej interakcie ML 3000 s žalúdočnej H, K-ATPázy. Avšak, discepancy medzi ML 3000 IC 50 v mikrozomálnych vačkov (15 uM) a v izolovaných parietálnych bunkách (40-45 um) naznačuje, že ML 3000 prístup k intracelulárnej H, K-ATPázy priestor v parietálnych bunkách, môže byť spomalený o priepustnosti obmedzenia na plazmatické membráne. Alternatívne, ML 3000 môže byť predmetom cytoplazmatickej metabolické zmeny, ktoré obmedzujú inhibičná účinnosť zlúčeniny. Obrázok 7 ML 3000 zamedzuje hromadeniu kyseliny v králičích parietálnych buniek žalúdka. (A) závislá na dávke inhibíciu ML 3000 (100 uM) kyseliny hromadenie histamínom stimulovanej králičie parietálnej bunky (IC 50 = 40 um). (B) závislá na dávke inhibíciu ML 3000 (100 uM) kyseliny akumulácie Forskolin stimulovanej králičích žalúdočných parietálnych bunkách (IC 50 = 45 uM). Dátové body ukazujú priemer ± štandardná odchýlka zo štyroch nezávislých testoch, z ktorých každý kyseliny akumulácie v parietálnych buniek bola meraná dvojmo.
A konečne, ako sa zistilo u mikrozomálne H, K-ATPázy, ďalšie NSAID, ako kyselinu acetylsalicylovú, naproxén, a NS 398 (až do koncentrácia 10 -4 M) nemala žiadny vplyv na akumuláciu kyseliny izolované králičie parietálnych bunkách (dáta nie sú ukázaná)
Účinky ML 3000 na IL-1β-indukovanú IL-8 vylučovanie do ľudského adenokarcinóme žalúdka (AGS) bunky
východiskových podmienkach, AGS bunky (5 x 10 4 v 100 ul kultivačného média) vylučovaný IL-8 po dobu 24 hodín na koncentráciu ~ 225 pg /ml média. Ak sú stimulované IL-1 (1 ng /ml), bunky sekréciu AGS IL-8 a po dobu 24 hodín sa zvýšil ~ 27-krát, na koncentráciu ~ 6000 pg /ml. ML 3000 inhibovala základné línie a-1β stimulovaných IL IL-8 sekréciu, s IC 50. rokov 0,46 uM (CI = 0,09 až 2,4 um) a 1,1 uM (CI = 0,52 - 2,2 uM), v danom poradí (obrázok 8A a 8B ). Obrázok 8 Účinky ML 3000 na IL-1β-indukovanú IL-8 sekrécie ľudského adenokarcinóme žalúdka (AGS) buniek. ML 3000 inhibovala základnú líniu (A) a IL-1β stimulovaných (B) IL-8 sekrécie, sa hodnoty IC50 0,46 uM (CI = 0,09 až 2,4 um) a 1,1 uM (CI = 0,52 až 2,2 um), resp. 5-lipoxygenázy-špecifický inhibítor ZD-2138 ukázala, závislú na dávke inhibíciu základné AGS bunky IL-8 sekrécia (C), s IC50 58 nM (CI = 15,6 - 218 nM) a minimálny vplyv na AGS buniek IL-1 stimulovanej sekrécie IL-8 (D). Dátové body ukazujú priemer ± štandardná odchýlka z troch nezávislých testov v každom z ktorých boli merané koncentrácie IL-8 v troch vyhotoveniach.
5-lipoxygenázy-špecifický inhibítor (ZD-2138), ktorý bol bez vplyvu na mikrozomálne H, K-ATPázy, ukázala na dávke reagujúci inhibícia základné AGS bunky IL-8 sekrécie (obr 8C), s IC 50 58 nM (CI = 15,6 - 218 nM). ZD-2138 vykazovali minimálny účinok na IL-1β-stimulovaných IL-8 a sekrécie AGS bunkách (Obrázok 8D). H, K-ATPázy inhibícia ML 3000, ktoré sme preukázali v tejto štúdii, nepodlieha IL-8 inhibíciu sekrécie v tomto modeli, pretože imunocytochémia s H, K-ATPázy-špecifické monoklonálna protilátka nevykazuje žiadnu H, K-ATPázy expresie v AGS bunkách (dáta nie sú uvedené).
Diskusia
Táto štúdia poskytuje informácie o účinkoch ML 3000 o aspektoch žalúdočné fyziológia vzťahujúce sa k ulcerogenesis. Tri experimentálne modely žalúdočné funkcie boli skúmané; vysoko čistené funkčné H, K-ATPázy (protónovej pumpy) izolovaný z žalúdočnej sliznice bitúnkov ošípaných, izolovaných králičích žalúdočných parietálnych buniek a ľudských buniek adenokarcinóme žalúdka v kultúre. V prvom modeli, ML 3000 inhibuje protónovej pumpy s IC 50 16,4 uM. Inhibítor protónovej pumpy (PPI), omeprazol zobrazená IC 50 1,1 uM v rovnakom teste. Na rozdiel od PPI, ML 3000 aktivita Inhibičný bol nezávislý na hodnote pH a bolo reverzibilné. Selektívne a neselektívne NSAID nevykazovali H, inhibičnú aktivitu K-ATPázy v rovnakom teste. V druhom modeli, ML 3000 inhibovala histamín a hromadeniu kyseliny stimulovanú Forskolin (IC 50 = 40 a 45 uM), v súlade s ML 3000 inhibíciu protónovej pumpy. V treťom modeli, ML 3000 inhibovala základné línie a-1β stimulovaných IL interleukín-8 sekréciu z AGS buniek (IC 50 = 0,46 a 1,1 uM v tomto poradí), aj keď tento účinok sa zdá nesúvisí s 5-lipoxygenázy inhibičnú aktivitu na ML 3000 (obrázok 8D).
Publikované IC 50 pre omeprazol, pokiaľ ide o rozsah žalúdočnej aktivity protónovej pumpy od 470 nM do 36 pM v závislosti od podmienok testu [23-25]. Pre iné inhibítory protónovej pumpy, picoprazole IC 50 2 um [26], Rabeprazol IC 50 72 nM [23], a lansoprazol IC 50 je 2,1 um [27]. Široká škála publikovaného PPI IC 50 hodnoty pre mikrozomálne H, K-ATPázy odráža Mechanistický nutnosť zlúčeniny okyslením, aby tvorba tiol-reaktívny sulfoxidu medziprodukt, ktorý potom nenávratne derivatizes H, K-ATPázy α podjednotka cysteinové zvyšky vedúci enzýmu inhibíciu.
Tieto údaje 3000 ML tiež dramaticky kontrastujú s omeprazolom inhibícia kyslé akumulácie v izolovaných parietálnych bunkách. Kyseliny sekrečnú kapacita IC 50s (v izolovaných parietálnych buniek), inhibítorov protónovej pumpy (PPI), ako je omeprazol, lanzoprazol a rabeprazol, sú v rozmedzí 59 nM až 360 nM [27, 28]. Čím väčšia je účinnosť PPI v rámci sekrečnej kapacity kyseliny v porovnaní s mikrozomálne, H, K-ATPázy (IC 50s v rozmedzí od 72 nM do 40 uM) odráža aktiváciu kyseliny úplnejší PPI v izolovaných parietálnych buniek kanálikov, než sa vyskytuje v oblasti mikrozomálnych testy in vitro pri hodnote pH 6,1 alebo vyšší.
PGE 2 Dáta sú na rozdiel od predchádzajúcej štúdie, v ktorej 2 na prasaciu žalúdočnej H, k-ATPázy [29], bol hlásený žiadny inhibičný účinok PGE , Rozdiely v konkrétnom teste ATPázy použité v tejto štúdii môže zodpovedať za tento rozpor. Vzhľadom k tomu, ML3000 a kyselina arachidonová sú aniónové amphiphiles, ich inhibičné účinky môžu byť výsledkom špecifických interakcií s H, K-ATPázy väzobných miest podjednotiek, alebo z menej špecifické hydrofóbna interakcií s H, K-ATPázy-spojených mikrozomálnych membránových lipidov, alebo ich kombinácie oba tieto faktory.
reverzibilitu ML 3000 inhibícia H, k-ATPázy in vitro, je znázornené na obrázku 2B, v kontraste s nezvratnosť inhibícia H, k-ATPázy substituovanými benzimidazoly, ako je omeprazol alebo lansoprazol.

• CD44 /CD24 expresie v opakujúce sa rakoviny žalúdka: retrospektívnu analysis
• Vzťah medzi postprandiálnej zmeny v srdcovej funkcie ľavej komory, koncentrácie glukózy a inzulínu, vyprázdňovanie žalúdka a sýtosti u zdravých subjects