Inhibition de H gastrique, l'activité K-ATPase et cellules épithéliales gastriques IL-8 sécrétion par le pyrrolizine dérivé ML 3000

L'inhibition de la H gastrique, une activité K-ATPase gastrique et la cellule épithéliale de sécrétion d'IL-8 par le pyrrolizine dérivé ML 3000
Résumé de l'arrière-plan
ML 3000 ([2,2-diméthyl-6- (4-chlorophényl ) -7-phényl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizine-5-yl] -acétique) est un inhibiteur de cyclooxygénase, et à la fois la 5-lipoxygénase in vitro et est prometteur en tant que médicament anti-inflammatoire non stéroïdien nouveaux (AINS). Contrairement à AINS classiques qui sont associés à des effets ulcérogènes gastriques, ML 3000 provoque peu ou pas de dommages à la muqueuse gastrique, même si elle abaisse significativement la synthèse des prostaglandines gastriques.
Méthodes
Dans le cadre d'un effort pour clarifier les mécanismes sous-jacents gastriques épargnant propriétés de ML 3000, nous avons étudié les effets de la ML 3000 sur H, l'activité K-ATPase in vitro, sur l'accumulation d'acide dans les cellules pariétales gastriques isolées, et iL-8 la sécrétion par les cellules épithéliales gastriques dans la culture.: Résultats
SCH28080 sensible H, l'activité K-ATPase dans porc hautement purifiée microsomes gastriques a été dose-dépendante inhibée par ML 3000 (IC 50 = 16,4 uM). L'inhibition est réversible, et insensible à ML 3000 acidification dans la gamme de pH de 2,0 à 8,0. Dans les cellules pariétales gastriques de lapin,
ML 3000 accumulation d'acide stimulée par l'histamine dose-dépendante inhibée (IC 50 = 40 uM) et l'accumulation d'acide stimulée par la forskoline (IC 50 = 45 uM). Enfin, l'adénocarcinome gastrique humain (AGS) des cellules, ML 3000 dépendante de la dose a inhibé à la fois de référence et de l'IL-1β stimulée (20 ng /ml) d'IL-8 sécrétion avec IC 50 de 0,46 uM et 1,1 uM, respectivement.
Conclusion
Les données indiquent que ML 3000 affecte les mécanismes sécrétrices d'acide en aval de la mobilisation de l'AMPc induite par l'histamine activation H 2 récepteur, qu'il inhibe directement H, activité spécifique K-ATPase, et que la ligne de base cellulaire de l'épithélium gastrique IL-8 sécrétoire inhibition peut être médiée par ML 3000 inhibition de l'activité 5-lipoxygénase. Nous concluons que ces données inhibitrices de la fonction gastrique peuvent sous-tendre les propriétés épargneurs gastriques de ML 3000.
Contexte
Les propriétés pharmacologiques des médicaments anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) résultent de leur suppression de la synthèse des prostaglandines de l'acide arachidonique [1] . L'inhibition de la synthèse des prostaglandines gastriques est accompagnée par une diminution de l'estomac mais le flux sanguin de la muqueuse, avec une sensibilité concomitante de la muqueuse à une lésion topique par une variété de produits irritants [2]. Une stratégie pharmacologique prometteuse pour éviter les complications gastriques de l'administration des AINS se concentre sur l'inhibition de la cyclooxygénase et simultanée de 5-lipoxygénase, dans le but de supprimer la synthèse des leucotriènes. 5-lipoxygénase convertit l'acide arachidonique en leucotriènes, parmi lesquelles des leucotriènes B4 est chimiotactique pour les leucocytes et contribue à des mécanismes inflammatoires conduisant à des ulcères gastro-intestinaux [3] ainsi. Dérivé de la pyrrolizine ML 3000 ([2,2-diméthyl-6- (4-Chlorophen-yl) -7-phényl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizine-5-yl] -acétique) est un inhibiteur à la fois cyclo-oxygénase et 5-lipoxygénase in vitro [4, 5], et spectacles promettent comme un roman AINS. ML 3000 réduit la prostaglandine gastrique synthèse E2 dans l'estomac de rat et de sang, mais une inhibition significative de la synthèse de B4 gastrique ou leucotriènes de sang n'a pas été détecté [6]. Plus important encore, ML 3000 n'a aucun effet sur l'adhérence leucocytaire en veinules mésentériques, et ne provoque aucune lésion de la muqueuse gastrique [6].
Dans les modèles animaux, ML 3000 a été jugée pharmacologiquement bénigne. Ainsi, le composé n'a pas d'incidence sur l'activité locomotrice du rat ou de sommeil induit par l'hexobarbital, n'a eu aucun effet cardiovasculaire ou respiratoire chez le rat et le chien, a été sans effet sur la fonction neuromusculaire chez les chats, et causé ni dommages gastriques ni perturbation péristaltique [7]. ML 3000 évoque une faible réponse spasmogénique en iléon Guinée-cochon, et a provoqué une petite réduction transitoire du débit urinaire chez le rat [7]. Les études de génotoxicité indiquent que ML 3000 n'a aucun effet sur la fréquence des mutations des gènes dans des bactéries ou des cellules de mammifères, sur la synthèse d'ADN non programmée, ou sur la fréquence des aberrations chromosomiques dans les cellules d'os de rat de moelle [8]. ML 3000 études de distribution et excréteurs marqués au 14C chez le rat indiquent la circulation entéro-hépatique et la conjugaison glucuronide de ML 3000 [9].
Le profil pharmacologique de ML 3000 comme étudié dans des modèles animaux montre anti-inflammatoire, analgésique, antipyrétique, activité antiasthmatique et antiaggregative à une dose qui ne provoque pas de lésions gastriques [4, 10]. Les propriétés aiguës et chroniques anti-inflammatoire de ML 3000 étudiés chez le rat modèle de patte de l'oedème induit par l'adjuvant [11] montrent que, bien que l'indométacine est un peu plus puissant en tant qu'agent anti-inflammatoire, aucune lésion gastrique a été noté avec ML 3000 jusqu'à 100 mg /kg /j po, alors que la dose ulcérogène (UD 50) pour l'indométhacine était de 7 mg /kg /j po
ulcération gastrique induite par les AINS limite considérablement l'utilité de ces médicaments. De toute évidence, la combinaison de propriétés anti-inflammatoires et gastriques sparing exposées par ML 3000 rend ce composé un candidat attractif pour une étude plus approfondie. Deux fonctions de la muqueuse gastrique qui jouent un rôle important dans l'ulcération gastrique sont la sécrétion d'acide et de l'interleukine-8 sécrétion. Les inhibiteurs de sécrétion acide sont parmi les médicaments les plus prescrits, ce qui reflète l'adage physiologique "Pas d'acide, aucun ulcère». une brèche pharmacologique ou physiopathologique des barrières muqueuses gastriques de rétrodiffusion d'HCl conduit à une érosion rapide de l'épithélium de la monocouche gastrique et l'ulcération de la muqueuse conséquente. Inhibition de la sécrétion d'acide par un antagonisme au niveau du récepteur d'histamine des cellules pariétales H2 (la cimétidine), ou par dérivatisation covalente directe et l'inactivation de la pompe gastrique de protons (oméprazole, le lansoprazole, le rabéprazole, ésoméprazole, etc.) est une routine pour l'amélioration et la promotion de la guérison des ulcères gastriques ulcères. Ainsi, les effets de sparing gastriques de ML 3000 peuvent être liés à l'inhibition de sécrétion acide par le composé.
A gastrique effet de ML 3000 parcimonieuse complémentaire peut impliquer une modulation de la sécrétion gastrique de la cytokine pro-inflammatoire IL-8. lésions gastriques induites par l'aspirine a été rapportée comme étant associée à une production accrue antrale de l'IL-8 [12]. La bactérie Helicobacter pylori ulcérogène
a été démontré que pour augmenter la vitesse et l'amplitude de la sécrétion d'IL-8 à la fois in vitro et in vivo [13-15] et à réguler à la hausse l'expression de l'IL-8 gène [16]. Des effets similaires d'IL-8 prosecretory sont considérés comme un résultat de la stimulation de l'IL-1β des cellules épithéliales gastriques. Comparaison des effets de ML 3000 et d'autres AINS sur ces activités sécrétoires gastriques peut élucider le mécanisme par lequel ML 3000 empêche la formation de lésions de la muqueuse gastrique.
Afin de clarifier les mécanismes sous-jacents gastriques épargnant propriétés de ML 3000, nous ont étudié l'effet de ML 3000 sur deux fonctions sécrétoires de la muqueuse gastrique avec des rôles dans ulcérogenèse: la sécrétion de l'acide chlorhydrique et la sécrétion de la cytokine inflammatoire interleukine-8. Nos données montrent que ML 3000 inhibe porc microsomes gastrique H, l'activité K-ATPase, inhibe l'acidification des stimulée par l'histamine dans les cellules pariétales gastriques de lapin, et inhibe l'IL-1β stimulée par l'IL-8 la sécrétion par les cellules épithéliales gastriques humaines.
Méthodes
Réactifs
ML 3000 et ZD-2138 ont été fournis par Forest Laboratories, Inc., New York, NY, oméprazole a été fourni par AstraZeneca R & D, Molndal, Suède, SCH 28080 a été de l'Institut de recherche Schering-Plough, Kenilworth, NJ, TEDBC est venu de Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, et NS 398 est venu de Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. L'acide arachidonique, l'indométacine, l'acide acétylsalicylique, naproxène, PGE 2, leucotriènes B4 et D4, et IL-1β ont tous été acquis auprès de Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Diméthylsulfoxide (Sigma-Aldrich) a été utilisé pour solubiliser ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398 et indométhacine. l'acide acétylsalicylique et le naproxène sont dissous dans un tampon d'essai d'ATPase (voir ci-dessous
). l'acide arachidonique et PGE 2 ont été dissous dans de l'éthanol absolu, et de l'oméprazole est dissous dans du methanol. Leucotriènes B4 et D4 ont été fournis en solution dans un mélange 70:30 de methanol et d'acétate d'ammonium 17 mM. IL-1β a été dissous dans une solution saline tamponnée au phosphate (pH 7,4), 0,1% p /v de sérum-albumine bovine. Tous les dosages utilisant ces composés comprenaient des contrôles de solvants appropriés, les solvants sont présents à des concentrations inférieures à 1% p /v dans le mélange d'essai final. Préparation de la H, K-ATPase de microsomale gastrique H, K-ATPase a été préparé à partir de muqueuse gastrique de porc homogénats par le saccharose différentiel et /gradient de Ficoll étape centrifugation comme décrit précédemment [17]. Cette préparation donne un relativement lourd (7% Ficoll /1.1 M interface sucrose) fraction microsomale GII, qui a montré aucune latence de l'activité K-ATPase, et qui comprend environ 90% H, K-ATPase, sur la base de densitométrie d'une bande de 94 kDa par analyse SDS-PAGE. GII microsomes ont été stockés à -80 ° C dans 20% de glycérol.
H, ATP activité hydrolytique de K-ATPase de dosage de porc microsomes gastrique a été quantifiée comme la libération orthophosphate à partir du substrat ATP en utilisant un procédé colorimétrique vert malachite [18] . des dosages d'ATPase ont été réalisées en microplaques de 96 puits. En bref, 100 pl /puits de tampon de dosage (60 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl 2, 1 mM d'EGTA, ± mM KCI 7,5, ± 50 pM SCH28080) contenant 80 ng microsomale H, K-ATPase ML 3000 (10 -9 M à 10 -4 M) ou d'autres composés, et 1 mM d'ATP a été incubée pendant 30 min à 37 ° C. L'activité enzymatique a été stoppée par l'addition (45 pl /puits) du réactif colorimétrique (0,07% de vert de malachite, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% de molybdate d'ammonium tétrahydraté, 0,134% de Tween-20). Au bout de 10 secondes, la réaction colorée a été développée par addition (45 pl /puits) de citrate de sodium à 15%. Après 45 minutes à température ambiante, l'absorbance des puits à 570 nm a été mesurée dans un lecteur de microplaque. Le plus Pour mesurer les effets de ML 3000 acidification sur l'inhibition de l'ATPase, ML 3000 aliquotes (10 mM dans 5 mM de Tris-HCl) étaient titrée à des valeurs de pH allant de 2,0 à 7,4 pendant 30 min. microsomes gastrique en suspension dans un tampon d'essai d'ATPase standard à pH 7,4 ont été incubées pendant 30 min avec des aliquotes acidifiées de ML 3000 (16,6 pM concentration finale ML 3000), puis l'activité d'ATPase a été mesurée comme décrit ci-dessus. Pour mesurer l'inhibition de l'activité de l'oméprazole H, K-ATPase, les microsomes gastriques en suspension dans du tampon de dosage à pH 6,1 ATPase ont été incubées pendant 30 minutes avec des concentrations variables de l'oméprazole. l'acidification à un pH de 6,1 omeprazole était nécessaire pour permettre la formation du sulfoxyde inhibiteur de thiol-réactif intermédiaire [19]. Les microsomes gastriques ont été ensuite transférés dans un tampon de dosage d'ATPase standard à pH 7,4, et l'activité ATPase a été mesurée comme décrit ci-dessus. activité de H, K-ATPase spécifique a été calculé comme étant la différence dans les activités microsomales ATPase en présence et en l'absence de H gastrique réversible spécifique, l'inhibiteur K-ATPase SCH28080 et a été exprimée en pmol P i /mg de protéine /h. H, l'activité K-ATPase de porc fraîchement préparé des microsomes gastriques variait de 140 à 170 micromoles P i /mg de protéine /h. Représentation graphique des données montre pour cent d'inhibition de l'activité H, K-ATPase en fonction des concentrations de composés. cellules pariétales gastriques
cellule primaire Préparation ont été isolés à partir de lapins blancs de Nouvelle Zélande par pronase /collagénase digestion de la muqueuse fundique suivie par enrichissement de cellules sur des gradients discontinus de Nycodenz comme décrit précédemment [20]. préparations de cellules pariétales contenaient environ 10 7 cellules /estomac, dont 80 ± 5% étaient des cellules pariétales à base de immunocytochimie avec H, un anticorps monoclonal K-ATPase spécifique Acide Accumulation Essai de.
accumulation aminopyrine dans pariétale les cellules ont été évaluées dans les 96 puits des plaques de filtration à membranes Durapore, comme décrit précédemment [21]. En bref, les cellules ont été pré-incubées avec [ 14C] -aminopyrine puis 100.000 cellules /200 pi par puits ont été incubées avec ou sans composés d'essai pendant 15 minutes avant l'incubation pendant encore 30 minutes en l'absence ou en présence de 100 uM d'histamine ou 100 uM de forskoline. Toutes les déterminations ont été effectuées en quatre. l'accumulation de l'aminopyrine basal a été déterminée comme étant l'accumulation de l'aminopyrine dans les cellules non traitées soustraits de l'accumulation en présence d'KSCN (une réflexion de l'isotope non spécifique piégeage). représentation graphique des données montre pour cent d'inhibition de l'accumulation d'acide stimulée par l'histamine par les cellules en fonction des concentrations du composé.
cellules d'adénocarcinome gastrique
cellules d'adénocarcinome gastrique humain (cellules AGS, ATCC CRL 1739) ont été maintenues dans AGS moyen (Ham F-12, 10% de sérum bovin fœtal, 100 unités /ml de pénicilline G, 0,25 pg /ml d'amphotéricine B, 100 pg /ml de streptomycine) à 37 ° C dans un CO à 5% 2/95% d'air incubateur et utilisés entre les passages 42 et 56. pour les études de la sécrétion de l'IL-8, les cellules AGS ont été étalées dans des plaques à 96 puits (50.000 cellules /100 pl /puits) et on les laisse se fixer pendant 18 heures à 37 ° C dans 5% de CO 2/95% d'air. Les cellules ont ensuite été incubées avec les composés d'essai en présence et en absence d'IL-1β, pendant 24 heures, au cours desquelles les échantillons de temps du milieu ont été prélevés des puits et stockés à -70 ° C. IL-8 concentrations des échantillons ont été déterminés par dosage immuno-enzymatique (Human IL-8 Duo-Set système de développement ELISA, R & D Systems Inc., Minneapolis, MN). représentation graphique des données montre l'inhibition pour cent de la sécrétion d'IL-8 non stimulées ou stimulées en fonction des concentrations de composé Analyse statistique
Toutes les expériences ont été effectuées au moins trois fois. points de données dans chaque essai représentent des moyens de mesure à partir d'échantillons en trois exemplaires. Les points de données ajustées une équation logistique à trois paramètres ont été représentées par des courbes dose-réponse sigmoïde en utilisant le progiciel statistique Prism (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). concentrations demi-maximale inhibitrices (IC 50) et IC 50 95 intervalles% de confiance (IC) ont également été calculées en utilisant Prism. Les points de données non ajustées à trois paramètres de logistique ont été dessinés sous forme de courbes simples point à point. Erreur type était la mesure de la variance utilisée pour les barres d'erreur dans la représentation graphique des effets de données: Résultats de ML 3000 sur H, l'activité K-ATPase gastrique H de l'activité K-ATPase a été dose-dépendante inhibée par ML 3000, avec une concentration inhibitrice demi-maximale (IC 50) de 16,4 uM (CI = 6,84 à 39,3 pM) (figure 1A). L'activité inhibitrice du ML 3000 a été comparée à celle d'un inhibiteur de la pompe à protons classique (PPI), le benzimidazole substitué oméprazole. La figure 1B montre l'effet sur l'activité de l'oméprazole H, K-ATPase, dans des conditions d'essai identiques à celles de la figure 1A; l'IC calculé 50 pour l'oméprazole était de 1,7 uM (CI = 0,26 à 11,3 uM). Ces données montrent que ML 3000 est considérablement moins puissant que l'oméprazole par rapport à H gastrique, une activité inhibitrice de K-ATPase, au moins dans le cadre de cet essai in vitro, notamment dans les conditions spécifiées. Pour déterminer si ML 3000 affiche des propriétés d'activation de l'acide comparables, une concentration inhibitrice demi-maximale de 3000 ml a été titrée à différents pH et les effets sur l'activité de H, K-ATPase ont été mesurés. Comme le montre la figure 2A, l'acidification du ML 3000 n'a eu aucun effet significatif sur son H, K-ATPase profil inhibitrice. Ces données indiquent que ML 3000, contrairement à l'oméprazole, ne nécessite pas l'acidification pour l'induction d'une activité d'inhibition. Étant donné que les IPP sont des inhibiteurs irréversibles de l'activité H, K-ATPase, la liaison covalente à la sous-unité catalytique α, nous avons cherché à déterminer si ML 3000 inhibition de H, K-ATPase était réversible ou irréversible. H gastrique, K-ATPase microsomes enrichis ont été traités avec une concentration inhibitrice maximum de 3000 ml, puis on dilue avec un large excès de tampon pour réduire la concentration de 3000 ml 100 pM à 3,3 pM. Les résultats, présentés sur la figure 2B, a indiqué que la dilution du ML 3000 rétablit l'activité H, K-ATPase, et sont compatibles avec ML 3000 inhibition de H, l'activité K-ATPase de manière réversible, à savoir., ML 3000 ne fonctionne pas de manière covalente dérivatisation soit de la sous-unité H gastrique, K-ATPase, au moins dans les conditions du présent essai in vitro de l'activité H, K-ATPase. A cet égard, ML 3000 est cinétiquement similaire à SCH28080, l'inhibiteur spécifique réversible gastrique H, K-ATPase. La figure 1 'inhibition dose-dépendante de l'activité H, K-ATPase ML 3000 (A) et par l'oméprazole (B). (UNE). microsomes gastrique en suspension dans du tampon de dosage à pH 7,4 ATPase ont été incubées pendant 30 min avec des concentrations de 3000 ml et une activité ATPase variant a ensuite été mesurée à pH 7,4. La concentration inhibitrice demi-maximale (IC50) pour ML 3000 était de 16,4 uM (CI = 6,84 à 39,3 uM). (B). microsomes gastrique en suspension dans un tampon d'essai d'ATPase à pH 6,1 ont été incubées pendant 30 minutes avec des concentrations variables de l'oméprazole, puis transférés dans du tampon de dosage d'ATPase standard à pH 7,4 pour la mesure de l'activité ATPase. La CI50 pour l'oméprazole était de 1,1 uM (CI = 0,26 à 11,3 uM). Les points de données montrent S.E. ± moyenne à partir de trois essais indépendants dans chacun desquels une activité ATPase sensible à SCH28080 a été mesurée en triple.
Figure 2: Effet de l'acidification ML 3000 sur l'activité de H, K-ATPase (A), et ML 3000 inhibition de la H, K-ATPase activité est réversible (B). (A) ML 3000 aliquotes (10 mM dans 5 mM de Tris-HCl) ont été titrés à pH allant de 2,0 à 7,4 pendant 30 min avant l'addition au tampon d'essai d'ATPase standard (pH 7,4) contenant des microsomes gastriques. (B) des microsomes gastriques ont été traitées avec une concentration au maximum inhibitrice (100 uM) de ML 3000. La suspension microsomale est ensuite diluée avec un grand excès de tampon pour réduire la concentration de 3000 ml 100 pM à 3,3 pM. Dans les deux cas (A) et (B), les points de données indiquent la moyenne ± S.E. à partir de trois essais indépendants dans chacun desquels une activité ATPase sensible à SCH28080 a été mesurée en triple exemplaire.
acide arachidonique et la prostaglandine E 2 (PGE 2) ont également dose-dépendante inhibée H, K-ATPase activité, avec IC 50 16,7 uM (CI = 8,9 à 31,5 pm) et 15 um (IC = 3,96 à 57,3 pM), respectivement (figure 3A et 3B). Etant donné que ML 3000 montre également l'inhibition de la 5-lipoxygénase, nous avons étudié les effets de deux inhibiteurs de lipoxygenase sur microsomes H, K-ATPase activité. La figure 4A montre que le 2- (1-thiényl) éthyle 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), un inhibiteur puissant de la 5-, 12- et 15-lipoxygenses, microsomique inhibe H, K-ATPase activité avec une CI 50 de 22,6 uM (CI = 6,3 à 81,2 uM). En revanche, la 5-lipoxygénase inhibiteur spécifique de 6 - ((3-Fluor-5- (méthoxy-3,4,5,6-tétrahydro-2H-pyranne-4-yl) phénoxy) méthyl) quinoléine (ZD-2138 ) a eu un effet minime sur H, l'activité K-ATPase (~ 20% d'inhibition à 10 -5 M) (figure 4B). Ces données sont cohérentes avec microsomes gastrique 12- et 15-lipoxygénases jouant un rôle dans H, l'activation K-ATPase, ou avec interaction directe de TEDBC avec H, sous-unités K-ATPase modifient la conformation de l'enzyme et donc l'activité. De toute évidence, les deux interprétations sont provocatrices et méritent une étude plus approfondie. Figure 3: Inhibition de H, K-ATPase activité par l'acide arachidonique (A) et de la prostaglandine E 2 (B). microsomes gastrique en suspension dans du tampon de dosage à pH 7,4 ATPase ont été incubées pendant 30 min avec des concentrations de l'acide arachidonique ou l'activité ATPase variant PGE2 et a ensuite été mesurée à pH 7,4. IC50 pour l'acide arachidonique était de 16,7 uM (CI = 8,9 à 31,5 um) et la CI50 pour la PGE2 était de 15 pM (CI = 3,96 à 57,3 um). Les points de données montrent S.E. ± moyenne à partir de trois essais indépendants dans chacun desquels une activité ATPase sensible à SCH28080 a été mesurée en triple.
Figure 4: Inhibition de l'activité H, K-ATPase par l'inhibiteur TEDBC 5-, 12- et 15-lipoxygénase (A), et la 5-lipoxygénase inhibiteur ZD-2138 (B). microsomes gastrique en suspension dans du tampon de dosage à pH 7,4 ATPase ont été incubées pendant 30 minutes avec des concentrations variables de TEDBC ou ZD-2138 et l'activité ATPase a ensuite été mesurée à pH 7,4. (A), les points de données présentent une activité ATPase sensible à SCH28080 moyenne mesurée en triple exemplaire dans l'une des trois dosages indépendants; les données typiques sont présentés. Les points de données dans (B) montrent moyenne ± S.E. à partir de trois essais indépendants dans chacun desquels l'activité ATPase SCH28080 sensible a été mesurée en triple exemplaire.
Afin de comparer l'effet inhibiteur H, K-ATPase de ML 3000 avec d'autres AINS, nous avons mesuré les effets de l'acide acétylsalicylique, NS 398, le naproxène, l'indométhacine et l'activité de la pompe à protons. Tous les quatre étaient sans NSAIDS effets inhibiteurs sur microsomes H, l'activité K-ATPase à des concentrations allant jusqu'à 10 -4 M (10 -3 M pour l'acide acétylsalicylique) (figure 5A, 5B, 5C et 5D). L'indométacine a été précédemment rapporté pour inhiber H gastrique, K-ATPase à une concentration un peu plus élevée (K i = 0,67 × 10 -3 M) [22]. Nos données se différencient clairement ML 3000 d'autres AINS en termes d'effet inhibiteur sur H gastrique, l'activité K-ATPase; la base mécanistique de cette différence, et la corrélation potentielle avec la propriété de ML 3000 gastrique épargne observée, restent à étudier. La Figure 5 Effets de l'acide acétylsalicylique, NS 398, le naproxène, l'indométhacine et sur l'activité de H, K-ATPase. microsomes gastrique en suspension dans du tampon de dosage à pH 7,4 ATPase ont été incubées pendant 30 min avec des concentrations d'acide acétylsalicylique, NS 398, le naproxène, l'indométhacine ou l'activité d'ATPase et variant a ensuite été mesurée à pH 7,4. Les points de données présentent une activité ATPase sensible à SCH28080 moyenne mesurée en triple exemplaire dans l'une des trois dosages indépendants; les données typiques sont présentés dans chaque cas.
Enfin, afin d'établir si le ML 3000 inhibition de H gastrique, K-ATPase reflète les effets du composé sur putatifs voies métaboliques leucotriènes fonctionnels présents dans porc microsomes gastriques, nous avons étudié les effets de la leucotriènes B4 et D4 sur l'activité H, K-ATPase. problèmes de solubilité ont empêché l'étude des concentrations LTB4 ou LTD4 supérieures à 1 uM. Comme on le voit sur la figure 6A et 6B, ni leucotriènes a montré une activité inhibitrice contre la H, K-ATPase à des concentrations physiologiques (10 -9-10 -8 M); seulement à des concentrations non physiologiques supérieures à 10 -7 M était-il une atténuation significative de l'activité H, K-ATPase. Figure 6 Effets des leucotriènes B4 et D4 sur SCH28080 sensible H, activité spécifique K-ATPase. microsomes gastrique en suspension dans du tampon de dosage à pH 7,4 ATPase ont été incubées pendant 30 minutes avec des concentrations variables de leucotriène B4 ou leucotriène D4 et ATPase a ensuite été mesurée à pH 7,4. Les points de données montrent S.E. ± moyenne à partir de trois essais indépendants dans chacun desquels une activité ATPase SCH28080 sensible a été mesurée en triple exemplaire.
Effets de ML 3000 sur l'accumulation d'acide stimulée par l'histamine gastrique cellules pariétales
ML 3000 dose-dépendante inhibée stimulée par l'histamine (100 pM) l'accumulation de l'acide par les cellules pariétales gastriques de lapin, avec une concentration inhibitrice demi-maximale (IC 50) de 40 um (figure 7A). ML 3000 également dose-dépendante stimulée par la forskoline (100 uM) a inhibé l'accumulation de l'acide par les cellules pariétales gastriques de lapin, avec une CI 50 ~ 45 uM (figure 7b). Ces données indiquent que ML 3000 affecte les mécanismes d'acide sécrétoire cellules pariétales en aval de la mobilisation de l'AMPc induite par l'histamine H 2 d'activation du récepteur. Les données sont cohérentes avec 3000 ml d'inhibition de la sécrétion acide des cellules pariétales résultant de l'interaction directe du ML 3000 avec l'H gastrique, K-ATPase. Cependant, le discepancy entre ML 3000 IC 50 dans des vésicules de microsomes (15 pM) et dans les cellules pariétales isolées (40 à 45 pM) suggère que ML 3000 accès au H intracellulaire, le compartiment K-ATPase des cellules pariétales peut être ralentie par des contraintes de perméabilité à la membrane plasmique. Sinon, ML 3000 peut être soumis à des modifications métaboliques cytoplasmiques qui limitent la puissance inhibitrice du composé. Figure 7 ML 3000 inhibe l'accumulation d'acide dans les cellules pariétales gastriques de lapin. (A) l'inhibition dose-dépendante par ML 3000 (100 uM) d'accumulation d'acide stimulée par l'histamine par les cellules pariétales gastriques de lapin (IC50 = 40 pM). (B) une inhibition dépendante de la dose par ML 3000 (100 uM) d'accumulation d'acide stimulée par la forskoline par les cellules pariétales gastriques de lapin (IC50 = 45 uM). Les points de données montrent S.E. ± moyenne à partir de quatre essais indépendants dans chacune desquelles l'accumulation d'acide dans les cellules pariétales a été mesuré en double.
Enfin, comme on l'a trouvé microsomique H, K-ATPase, d'autres AINS tels que l'acide acétylsalicylique, naproxène et NS 398 (jusqu'à des concentrations de 10 -4 M) n'a eu aucun effet sur l'accumulation d'acide par les cellules pariétales de lapin isolés (données non présentées)
Effets de ML 3000 sur l'IL-1β induite par l'IL-8 dans la sécrétion adénocarcinome gastrique humaine (AGS) cellules
dans les conditions de référence, les cellules AGS (5 x 10 4 100 dans un milieu de culture ul) de l'IL-8 sécrétée sur une période de 24 h à une concentration d'environ 225 pg /ml de milieu. Lorsqu'elles sont stimulées par l'IL-1β (1 ng /ml) cellules AGS de l'IL-8 sécrétion pendant une période de 24 h ~ a été augmentée de 27 fois, à une concentration d'environ 6,000 pg /ml. ML 3000 inhibe à la fois la ligne de base et de l'IL-1β stimulée par l'IL-8 sécrétion, avec IC 50 de 0,46 uM (CI = 0,09 à 2,4 uM) et 1,1 uM (CI = 0,52 à 2,2 uM) respectivement (figure 8A et 8B ). Figure 8: Effets de ML 3000 sur l'IL-1β, IL-8 induite par la sécrétion dans les adénocarcinomes gastriques humaines (AGS) des cellules. ML 3000 a inhibé à la fois la ligne de base (A) et l'IL-1β stimulée (B) la sécrétion d'IL-8, avec des CI50 de 0,46 uM (CI = 0,09 à 2,4 um) -, respectivement, et 1,1 uM 2,2 uM (CI = 0,52). L'inhibiteur de 5-lipoxygénase spécifique ZD-2138 a montré une inhibition dépendant de la dose de cellules AGS de base d'IL-8 sécrétion (C), avec une CI50 de 58 nM (IC = 15,6 à 218 nm) et un effet minimal sur les cellules AGS de l'IL-1β stimulée par IL-8 sécrétion (D). Les points de données montrent S.E. ± moyenne à partir de trois essais indépendants dans chacun desquels l'IL-8 ont été mesurées en trois exemplaires.
L'inhibiteur de 5-lipoxygénase spécifique (ZD-2138), qui a été sans effet sur microsomes H, K-ATPase activité, a montré la dose sensible l'inhibition de cellules AGS de base d'IL-8 sécrétion (figure 8C), avec un circuit intégré 50 de 58 nM (IC = 15,6 à 218 nM). ZD-2138 a montré un effet minime sur l'IL-1β stimulée par l'IL-8 la sécrétion par les cellules AGS (Figure 8D). H, K-ATPase inhibition par ML 3000, que nous avons démontré dans la présente étude, ne sous-tendent pas IL-8 sécrétoire inhibition dans ce modèle parce immunocytochimie avec H, un anticorps monoclonal K-ATPase spécifique ne montre aucun H, K-ATPase expression dans les cellules AGS (données non présentées) Rapport
Cette étude. fournit des informations sur les effets de la ML 3000 sur les aspects de la physiologie gastrique liée à ulcérogenèse. Trois modèles expérimentaux de la fonction gastrique ont été étudiés; H fonctionnelle hautement purifiée, K-ATPase (pompe à protons) isolé à partir de la muqueuse gastrique des porcs d'abattage, les cellules pariétales gastriques de lapin isolé, et les cellules d'adénocarcinome gastrique humaines en culture. Dans le premier modèle, ML 3000 a inhibé la pompe à protons avec une CI 50 16,4 uM. L'inhibiteur de pompe à protons (IPP) oméprazole affiche un circuit intégré 50 de 1,1 pM dans le même dosage. Contrairement à PPIs, ML 3000 activité inhibitrice était indépendante du pH et était réversible. NSAID sélectifs et non sélectifs ne présentaient aucun H, une activité inhibitrice de K-ATPase dans le même dosage. Dans le second modèle, ML 3000 a inhibé à la fois l'histamine et l'accumulation d'acide stimulée par la forskoline (IC = 50 40 et 45 uM), en accord avec ML 3000 pompe à protons d'inhibition. Dans le troisième modèle, ML 3000 a inhibé à la fois la ligne de base et l'IL-1β stimulée par l'interleukine-8 sécrétion à partir de cellules AGS (IC 50 = 0,46 et 1,1 uM, respectivement), bien que ce dernier effet semble sans rapport avec l'activité d'inhibition de la 5-lipoxygénase de ML 3000 (Figure 8D).
Publié IC 50 pour l'oméprazole par rapport à l'estomac gamme d'activité de la pompe à protons de 470 nM à 36 uM en fonction des conditions de l'essai [23-25]. Pour les autres IPP, picoprazole IC 50 est de 2 uM [26], rabéprazole IC 50 est 72 nM [23], et lansoprazole IC 50 est de 2,1 uM [27]. La vaste gamme de publié PPI IC 50 valeurs pour microsomes H, K-ATPase reflète la nécessité mécaniste pour le composé acidification pour permettre la formation d'un sulfoxyde thiol intermédiaire réactif qui a ensuite derivatizes irréversiblement H, K-ATPase α sous-unité résidus cystéine conduisant à inhibition enzymatique.
Ces données ML 3000 contrastent également de façon spectaculaire avec l'inhibition de l'oméprazole de l'accumulation d'acide dans les cellules pariétales isolées. Acide capacité sécrétoire IC 50 (dans les cellules pariétales isolées) des inhibiteurs de la pompe à protons (IPP) tels que l'oméprazole, rabéprazole et lansoprazole sont dans la plage de 59 nM à 360 nM [27, 28]. La plus grande puissance d'IPP, dans le contexte de la capacité sécrétoire de l'acide par rapport à microsomale H, K-ATPase (EC 50 allant de 72 nM à 40 uM) reflète l'activation de l'acide plus complète des IPP dans le traitement isolé canalicules cellules pariétales que se produit dans au essais in vitro de microsomes à pH 6.1 ou supérieur.
Le PGE 2 données sont en contraste avec une étude précédente dans laquelle aucun effet inhibiteur de PGE 2 sur porc H gastrique, K-ATPase [29] a été signalé . Différences dans l'essai d'ATPase spécifique utilisée dans cette étude peut tenir compte de cet écart. Etant donné que ML3000 et l'acide arachidonique sont des amphiphiles anioniques, leurs effets inhibiteurs pourraient résulter d'interactions spécifiques avec H, K-ATPase des sites de liaison de sous-unités, ou d'interactions hydrophobes moins spécifiques avec les lipides de la membrane microsomale H, K-ATPase associés, ou d'une combinaison de les deux facteurs.
la réversibilité du ML 3000 inhibition de l'activité H, K-ATPase in vitro, représenté sur la figure 2B, contraste avec l'irréversibilité de l'inhibition H, K-ATPase par benzimidazoles substitués tels que l'oméprazole ou lansoprazole.

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