Remming van maag- H, K-ATPase-activiteit en de maag epitheelcel IL-8 secretie door de pyrrolizine derivaat ML 3000

Remming van maag- H, K-ATPase-activiteit en de maag epitheelcel IL-8 secretie door de pyrrolizine derivaat ML 3000
Abstract achtergrond
ML 3000 ([2,2-dimethyl-6- (4-chloorfenyl ) -7-fenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizine-5-yl] -azijnzuur) is een remmer van zowel cyclooxygenase en 5-lipoxygenase in vitro, en toont belofte als een nieuwe niet-steroïde anti-inflammatoir geneesmiddel (NSAID). In tegenstelling tot conventionele NSAID's die worden geassocieerd met maag- ulcerogene effecten ML 3000 veroorzaakt weinig of geen schade aan het maagslijmvlies, hoewel het significant onderdrukt maag prostaglandinesynthese.
Methods
Als deel van een inspanning om mechanismen te verklaren achter de maag sparende eigenschappen van ML 3000, bestudeerden wij de effecten van ML 3000 op H, K-ATPase-activiteit in vitro, op zuur accumulatie in geïsoleerde pariëtale cellen en IL-8 secretie door maagepitheelcellen in kweek.
Resultaten
SCH28080-gevoelige H, K-ATPase-activiteit in sterk gezuiverde varkens maag microsomen werd dosisafhankelijk geremd door ML 3000 (IC 50 = 16,4 uM). Remming was omkeerbaar en ongevoelig voor 3000 verzuring in het pH-traject 2,0-8,0 ml. In konijnen pariëtale cellen,
ML 3000 dosisafhankelijk remde histamine gestimuleerde ophoping acid (IC 50 = 40 uM) en forskoline gestimuleerde ophoping acid (IC 50 = 45 uM). Tenslotte menselijke adenocarcinoom (AGS) cellen, ML 3000 remt dosisafhankelijk zowel basislijn en IL--1β gestimuleerde (20 ng /ml) IL-8 secretie met IC respectievelijk 50s van 0,46 uM en 1,1 uM.
Conclusie Ondernemingen De gegevens geven aan dat ML 3000 beïnvloedt zuur-secretoire mechanismen achter cAMP mobilisatie geïnduceerd door histamine H 2 receptoractivering, dat het direct remt H, K-ATPase specifieke activiteit en dat uitgangswaarde maag epitheelcel IL-8 secretorische remming kan worden gemedieerd door ML 3000 remming van 5-lipoxygenase-activiteit. We concluderen dat deze de maag functie remmende gegevens van de maag-sparende eigenschappen van ML 3000.
Achtergrond kan ten grondslag liggen aan
De farmacologische eigenschappen van niet-steroïde anti-inflammatoire geneesmiddelen (NSAID's) komen voort uit hun onderdrukking van de prostaglandinesynthese uit arachidonzuur [1] . Remming van prostaglandine synthese maag wordt echter vergezeld door verminderde bloedtoevoer maagslijmvlies, met bijkomende mucosale gevoeligheid voor topische schade door een verscheidenheid van prikkelende [2]. Een veelbelovende farmacologische strategie maag complicaties van NSAID toegediend wordt gericht op gelijktijdige cyclooxygenase en 5-lipoxygenase remming, met als doel het onderdrukken van leukotrieen synthese. 5-lipoxygenase omgezet arachidonzuur leukotriënen, waaronder leukotrieen B4 chemotactisch voor leukocyten en wordt bijgedragen tot inflammatoire mechanismen die leiden tot maagdarmzweren [3]. De pyrrolizine derivaat ML 3000 ([2,2-dimethyl-6- (4-chlorophen-yl) -7-fenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizine-5-yl] -azijnzuur) is een remmer van beide cyclo-oxygenase en 5-lipoxygenase in vitro [4, 5], en toont belofte als nieuw NSAID. ML 3000 vermindert de maag prostaglandine E2 synthese in de maag en bloed rat, hoewel ook hier belangrijke remming van de maag of bloed leukotrieen B4 synthese niet werd gedetecteerd [6]. Belangrijker, ML 3000 heeft geen effect op de hechting van leukocyten in mesenteriale venulen en veroorzaakt geen maagslijmvlies [6].
In diermodellen, ML 3000 bleek farmacologisch goedaardig. Aldus heeft de verbinding geen invloed rat bewegingsactiviteit of hexobarbital-geïnduceerde slaap, had geen cardiovasculaire of respiratoire effecten bij ratten en honden werd geen effect op neuromusculaire functie bij katten en veroorzaakt geen maagschade of peristaltische verstoring [7]. ML 3000 opgeroepen een zwakke spasmogenic respons in cavia ileum, en veroorzaakte een kleine voorbijgaande vermindering van de urineproductie bij ratten [7]. Genotoxiciteit studies geven aan dat ML 3000 geen effect heeft op genmutatie frequenties in bacteriën of zoogdiercellen, op DNA-synthese, of op de frequentie van chromosomale afwijkingen bij ratten beenmergcellen [8]. 14C-gelabeld ML 3000 de distributie en de excretie in ratten laten enterohepatische circulatie en glucuronideconjugatie van ML 3000 [9]. Ondernemingen De farmacologisch profiel van de ML 3000 als bestudeerd in diermodellen toont anti-inflammatoire, pijnstillende, koortswerende, antiastmatische en antiaggregative activiteit bij een dosering die geen maagschade [4, 10] veroorzaakt. De acute en chronische anti-inflammatoire eigenschappen van ML 3000 bestudeerd in de adjuvant geïnduceerde rattenpoot oedeem model [11] blijkt dat, hoewel indomethacine enigszins potenter als een anti-inflammatoir middel, werd geen maagschade vastgesteld met ML 3000 tot 100 mg /kg /d po, ​​terwijl de ulcerogene dosis (UD 50) voor indomethacine was 7 mg /kg /d po
maagzweren veroorzaakt door NSAID beperkt aanzienlijk de bruikbaarheid van deze geneesmiddelen. Is duidelijk dat de combinatie van anti-inflammatoire en maag sparing eigenschappen vertoond door ML 3000 is deze verbinding een aantrekkelijke kandidaat voor verdere studie. Twee maagslijmvlies functies die een belangrijke rol in maagzweren spelen zijn zuursecretie en interleukine-8 secretie. Acid secretorische remmers behoren tot de meest voorgeschreven geneesmiddelen, die de fysiologische gezegde "Geen zuur, geen zweer". Farmacologische of pathofysiologische overschrijding van de gastrische mucosale barrières diffusie van HCl terug leidt tot een snelle erosie van de maag epitheliale monolaag en daaropvolgende ulceratie van de mucosa. Zuursecretieremming door antagonisme van de pariëtale cel histamine H2 receptor (cimetidine) of door directe covalente derivatisering en inactivatie van de protonpomp (omeprazol, lansoprazol, rabeprazol, esomeprazol, etc) is routine voor verbetering en bevordering van genezing van gastrische zweren. Aldus kan de maag sparing effect van ML 3000 gerelateerd aan zuur uitscheiding remming door de verbinding.
Een complementaire maag sparend effect van ML 3000 kan modulatie van maagzuurafscheiding van de pro-inflammatoire cytokine IL-8 omvatten. Aspirine geïnduceerde maag- schade is gemeld te worden geassocieerd met een verhoogde antral productie van IL-8 [12]. Ulcerogene de bacterie Helicobacter pylori
is aangetoond dat de snelheid en amplitude van IL-8 secretie zowel in vitro als in vivo [13-15], en up-regulering van IL-8 genexpressie [16]. Gelijkaardige IL-8 prosecretory effecten worden waargenomen als gevolg van IL-1β stimulatie van maagepitheelcellen. Vergelijking van de effecten van ML 3000 en andere NSAID volgende gastrische secretoire activiteiten kunnen het mechanisme waarmee ML 3000 voorkomt de vorming van gastrische mucosale laesies helderen.
Om mechanisms maag sparende eigenschappen van ML 3000 verduidelijken, we het effect van ML 3000 twee maagslijmvlies secretoire functies met rollen in ulcerogenesis: afscheiding van zoutzuur, en secretie van de inflammatoire cytokine interleukine-8. Onze gegevens tonen aan dat ML 3000 remt varken maag microsomale H, K-ATPase activiteit remt histamine gestimuleerde verzuring in konijnen pariëtale cellen en remt IL-1β-gestimuleerde IL-8 secretie door humane maagepitheelcellen.
Methods
Reagentia
ML 3000 en ZD-2138 werden geleverd door Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazol werd door AstraZeneca R &D, Molndal, Zweden, SCH 28080 was van Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC kwam uit Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, en NS 398 kwam uit Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arachidonzuur, indomethacine, acetylsalicylzuur, naproxen, PGE 2, leukotriënen B4 en D4 en IL-1β werden alle verkregen van Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO. Dimethylsulfoxide (Sigma-Aldrich) werd gebruikt voor het solubiliseren ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398 en indomethacine. Acetylsalicylzuur en naproxen werden opgelost in ATPase assay buffer (vide infra
). Arachidonzuur en PGE 2 werden opgelost in absolute ethanol en omeprazol werd opgelost in methanol. Leukotriënen B4 en D4 werden geleverd opgelost in een 70:30 mengsel van methanol en 17 mM ammoniumacetaat. IL-1β werd opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (pH 7,4), 0,1% w /v runderserumalbumine. Alle assays het gebruik van deze verbindingen onder passende controles oplosmiddel en alle oplosmiddelen aanwezig in concentraties van minder dan 1% w /v in het uiteindelijke testmengsel.
Bereiding van H, K-ATPase
microsomaal maag-H, K-ATPase werd bereid uit varkens maagslijmvlies homogenaten door differentiële en sucrose /Ficoll stapsgewijze gradiënt centrifugatie zoals eerder [17] beschreven. Dit preparaat levert een relatief zwaar (7% Ficoll /1,1 M sucrose interface) GII microsomale fractie, die geen latentie van K-ATPase activiteit vertoonden, uitgevoerd, dat ~ 90% H, K-ATPase, op basis van densitometrie van een 94 kDa-band door SDS-PAGE-analyse. GII microsomen werden bij -80 ° C in 20% glycerol bewaard.
H, K-ATPase werd Assay
ATP hydrolytische activiteit van varken maag microsomen gekwantificeerd als orthofosfaat die vrijkomt uit substraat ATP onder toepassing van een colorimetrische malachietgroen procedure [18] . ATPase testen werden uitgevoerd in 96-putjes. Kort samengevat, 100 ul /well assay buffer (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgClz 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCl, ± 50 uM SCH28080), bevattende 80 ng microsomale H, K-ATPase , ML 3000 (10 -9 M tot 10 -4 M) of andere verbindingen, en 1 mM ATP werd gedurende 30 minuten bij 37 ° C. Enzymatische activiteit werd gestopt door de toevoeging (45 ul /putje) van colorimetrische reagens (0,07% malachietgroen, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% ammoniummolybdaat tetrahydraat, 0,134% Tween-20). Na 10 seconden werd de kleurreactie ontwikkeld door het toevoegen (45 gl /putje) van 15% natriumcitraat. Na 45 min bij kamertemperatuur werd de absorptie van de putjes bij 570 nm gemeten in een microplaat reader.
Om de effecten van ML 3000 verzuring ATPase remming meten ML 3000 monsters (10 mM in 5 mM Tris-HCl) werden getitreerd tot pH variërend 2,0-7,4 gedurende 30 min. Gastric microsomen gesuspendeerd in standaard ATPase assay buffer bij pH 7,4 werden gedurende 30 min met aangezuurd aliquots ML 3000 (16,6 uM uiteindelijke concentratie ML 3000) en ATPase-activiteit werd gemeten zoals hierboven beschreven. Omeprazol remming van H, K-ATPase-activiteit te meten, werden maag microsomen gesuspendeerd in ATPase assay buffer bij pH 6,1 gedurende 30 min met variërende concentraties omeprazol. Omeprazol aanzuren tot pH 6,1 was noodzakelijk om de vorming van de remmende thiol-reactief tussenproduct sulfoxide [19] toe. De maag microsomen werden vervolgens overgebracht naar standaard ATPase assay buffer bij pH 7,4 en ATPase-activiteit werd gemeten zoals hierboven beschreven. Specifieke H, K-ATPase-activiteit werd berekend als het verschil in de microsomale ATPase werking in aanwezigheid en afwezigheid van de specifieke reversibele maag-H, K-ATPase inhibitor SCH28080, en is uitgedrukt als umol p i /mg proteïne /uur. H, K-ATPase activiteit van vers bereide varken maag microsomen varieerde 140-170 umol P i /mg proteïne /uur. Grafische weergave van de gegevens blijkt percentage remming van H, K-ATPase activiteit als functie van verbindingsconcentraties.
Primaire Celbereiding
pariëtale cellen uit Nieuw Zeelandse witte konijnen geïsoleerd door pronase /collagenase digestie van fundic mucosa gevolgd door verrijking van cellen op discontinue gradiënten Nycodenz zoals eerder [20] beschreven. Pariëtale cel preparaten bevatten ongeveer 10 7 cellen /maag, waarvan 80 ± 5% was pariëtale cellen op basis van immunocytochemie met H, K-ATPase-specifiek monoklonaal antilichaam.
Acid Accumulation Assay
aminopyrine accumulatie in pariëtale cellen werd beoordeeld in 96 puts filterplaten met Durapore membranen, zoals eerder [21] beschreven. In het kort werden cellen geïncubeerd met [ 14C] -aminopyrine en 100.000 cellen /200 gl per putje werden geïncubeerd met of zonder testverbindingen gedurende 15 minuten voorafgaand aan incubatie gedurende een verdere 30 min bij afwezigheid of aanwezigheid van 100 uM histamine of 100 uM forskoline. Alle bepalingen werden uitgevoerd in viervoud. Basale aminopyrine accumulatie werd bepaald zoals aminopyrine accumulatie in onbehandelde cellen afgetrokken van accumulatie in de aanwezigheid van KSCN (een reflectie van aspecifieke isotoop trapping). Grafische weergave van de gegevens blijkt percentage remming van door histamine gestimuleerde accumulatie zuur door de cellen als functie van verbindingsconcentraties.
Adenocarcinoom cellen
menselijke adenocarcinoom cellen (AGS cellen, ATCC CRL 1739) werden in AGS gehandhaafd medium (Ham's F-12, 10% foetaal runderserum, 100 eenheden /ml penicilline G, 0,25 ug /ml amfotericine B, 100 ug /ml streptomycine) bij 37 ° C in een CO 5% 2/95% lucht incubator gebruikt tussen passages 42 en 56. voor studies van IL-8 secretie werden AGS cellen uitgeplaat in 96-well platen (50.000 cellen /100 gl /putje) en toegestaan ​​te hechten gedurende 18 uur bij 37 ° C in 5% CO 2/95% lucht. Cellen werden vervolgens geïncubeerd met testverbindingen in aanwezigheid en afwezigheid van IL-1β voor 24 uur, waarna monsters van medium uit de putjes verwijderd en bewaard bij -70 ° C. IL-8 concentraties van de monsters werden bepaald door enzymgekoppelde immunosorbent assay (menselijk IL-8-Duo Set ELISA ontwikkelingssysteem, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Grafische weergave van de gegevens blijkt percentage remming van gestimuleerde of IL-8 gestimuleerde secretie als functie van verbindingsconcentraties

Statistische analyse Alle experimenten werden ten minste driemaal uitgevoerd.; datapunten in elke assay vertegenwoordigen meetmiddelen van monsters in drievoud. Gegevenspunten aanbrengen van een drie-parameter logistieke vergelijking werden geplot als sigmoïdale dosis-respons curven met de Prism statistisch pakket (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA). Half-maximale remmende concentratie (IC 50) en IC 50 95% betrouwbaarheidsinterval (BI) werden berekend met Prism. Datapunten niet aanbrengen van een drie parameter logistieke werden getrokken als eenvoudige point-to-point curves. Standaardfout de mate van variantie voor foutbalken in grafische weergave van gegevens
Resultaten
Effecten van ML 3000 op H, K-ATPase activiteit
Gastric H is, K-ATPase-activiteit werd dosisafhankelijk geremd door ML 3000, met een half-maximale remmende concentratie (IC 50) of 16,4 uM (CI = 6,84-39,3 pM) (Figuur 1A). De remmende activiteit van ML 3000 werd vergeleken met die van een klassieke protonpompremmer (PPI), de gesubstitueerde benzimidazool omeprazol. Figuur 1B toont het effect van omeprazol op H, K-ATPase activiteit onder testcondities identiek zijn aan die in figuur 1A; de berekende IC 50 voor omeprazol was 1,7 micrometer (CI = ,26-11,3 pm). Deze gegevens tonen dat ML 3000 is aanzienlijk minder krachtig dan omeprazol ten opzichte maag H, K-ATPase remmende activiteit, althans in de omgeving van dit in vitro onderzoek onder de aangegeven omstandigheden. Vaststellen of ML 3000 getoond vergelijkbaar zuur-activatie eigenschappen, een half-maximale remmende concentratie van 3000 ml werd getitreerd met verschillende pH en de effecten op H, K-ATPase-activiteit werd gemeten. Zoals getoond in Figuur 2A, verzuring van ML 3000 had geen significant effect op de H, K-ATPase remmende profiel. Deze gegevens geven aan dat ML 3000, in tegenstelling tot omeprazol, geen verzuring inductie van remmende activiteit vereisen. Aangezien PPI irreversibele remmers van H, K-ATPase activiteit covalent binden aan de katalytische subeenheid α wilden we bepalen of ML 3000 remming van H, K-ATPase was reversibel of irreversibel. Maag- H, K-ATPase werden verrijkt microsomen behandeld met een maximaal-remmende concentratie van 3000 ml en vervolgens verdund met een grote overmaat buffer om de ML 3000 concentratie van 100 uM verlagen tot 3,3 uM. De resultaten, getoond in figuur 2B aangegeven verdunning van ML 3000 herstelde H, K-ATPase activiteit, en zijn consistent met ML 3000 remmen van H, K-ATPase activiteit in een omkeerbare wijze, dwz., ML 3000 niet covalent te derivatiseren ofwel subeenheid van het maag-H, K-ATPase, althans onder de voorwaarden van deze in vitro assay van H, K-ATPase activiteit. Hierbij ML 3000 kinetisch vergelijkbaar met SCH28080, de specifieke reversibele remmer van maag-H, K-ATPase. Figuur 1 Dosisafhankelijke remming van H, K-ATPase activiteit ML 3000 (A) en omeprazol (B). (EEN). Gastric microsomen gesuspendeerd in ATPase assay buffer bij pH 7,4 werden gedurende 30 min met variërende concentraties ML 3000 en ATPase activiteit werd daarna gemeten bij pH 7,4. De half-maximale remmende concentratie (IC50) voor ML 3000 was 16,4 pM (CI = 6,84-39,3 uM). (B). Gastric microsomen gesuspendeerd in ATPase assay buffer bij pH 6,1 werden gedurende 30 min met variërende concentraties van omeprazol, en vervolgens overgebracht naar standaard ATPase assay buffer bij pH 7,4 voor ATPase-activiteit meting. De IC50 voor omeprazol 1,1 pM (CI = 0,26-11,3 uM). De data-punten tonen gemiddelde ± S.E. drie onafhankelijke assays elk SCH28080-gevoelige ATPase-activiteit werd gemeten in drievoud.
Figuur 2 Effect van ML 3000 verzuring H, K-ATPase activiteit (A) en ML 3000 remming van H, K-ATPase activiteit omkeerbaar (B). (A) 3000 ml aliquots (10 mM in 5 mM Tris-HCl) werden getitreerd tot pH variërend 2,0-7,4 gedurende 30 minuten voor toevoeging aan standaard ATPase assay buffer (pH 7,4) bevattende maag microsomen. (B) Gastric microsomen werden behandeld met een maximaal-remmende concentratie (100 uM) of ML 3000. De microsomale suspensie daarna met een grote overmaat buffer werd verdund tot de ML 3000 concentratie van 100 uM verlagen tot 3,3 uM. In zowel (A) en (B), de data-punten vertonen gemiddelde ± S.E. drie onafhankelijke assays elk SCH28080-gevoelige ATPase-activiteit werd gemeten in drievoud.
Arachidonzuur en prostaglandine E 2 (PGE 2) ook dosisafhankelijk remde H, K-ATPase activiteit, met IC 50 of 16,7 uM (Cl = 8,9-31,5 pM) en 15 pM (CI = 3,96-57,3 uM) respectievelijk (Figuur 3A en 3B). Aangezien ML 3000 toont ook 5-lipoxygenase remming, bestudeerden wij de effecten van twee lipoxygenase remmers op microsomaal H, K-ATPase activiteit. Figuur 4A toont dat 2- (1-thienyl) ethyl 3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), een krachtige remmer van 5-, 12- en 15-lipoxygenses, geremd microsomale H, K-ATPase activiteit met een IC 50 van 22,6 uM (Cl = 6,3-81,2 pM). In tegenstelling, de 5-lipoxygenase-specifieke remmer 6 - ((3-fluor-5- (methoxy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-4-yl) fenoxy) methyl) chinolin (ZD-2138 ) had een minimaal effect op de H, K-ATPase activiteit (~ 20% remming bij 10 -5 M) (Figuur 4B). Deze gegevens zijn consistent met maag microsomale 12- en 15-lipoxygenasen een rol spelen bij H, K-ATPase activatie of directe interactie van TEDBC met H, K-ATPase subunits veranderend enzym conformatie en aldus op de activiteiten. Het is duidelijk dat beide interpretaties zijn provocerend en verdienen verdere studie. Figuur 3 Remming van H, K-ATPase activiteit met arachidonzuur (A) en prostaglandine E 2 (B). Gastric microsomen gesuspendeerd in ATPase assay buffer bij pH 7,4 werden gedurende 30 min met variërende concentraties van arachidonzuur of PGE2 en ATPase activiteit werd daarna gemeten bij pH 7,4. IC50 voor arachidonzuur was 16,7 uM (Cl = 8,9-31,5 pM) en de IC50 voor PGE2 was 15 pM (CI = 3,96-57,3 uM). De data-punten tonen gemiddelde ± S.E. drie onafhankelijke assays elk SCH28080-gevoelige ATPase-activiteit werd gemeten in drievoud.
Figuur 4 Remming van H, K-ATPase-activiteit van de 5-, 12- en 15-lipoxygenase inhibitor TEDBC (A), en de 5-lipoxygenase inhibitor ZD-2138 (B). Gastric microsomen gesuspendeerd in ATPase assay buffer bij pH 7,4 werden gedurende 30 min met variërende concentraties TEDBC of ZD-2138 en ATPase activiteit werd daarna gemeten bij pH 7,4. In (A), de data-punten tonen gemiddelde SCH28080-gevoelige ATPase-activiteit gemeten in drievoud in drie onafhankelijke testen; typische gegevens worden getoond. De data-punten in (B) tonen gemiddelde ± S.E. drie onafhankelijke assays elk SCH28080-gevoelige ATPase-activiteit werd gemeten in drievoud.
Om het H, K-ATPase remmende effect van ML 3000 met andere NSAIDs vergelijken, maten we de effecten van acetylsalicylzuur, NS 398, naproxen en indomethacine op proton pomp activiteit. Alle vier NSAID's hadden geen remmend effect op microsomale H, K-ATPase activiteit bij concentraties tot 10 -4 M (10 -3 M acetylsalicylzuur) (Afbeelding 5A, 5B, 5C en 5D). Indomethacine werd eerder gemeld maag- H, K-ATPase remt bij iets hogere concentratie (K i = 0,67 x 10 -3 M) [22]. Onze gegevens duidelijk onderscheid ML 3000 uit andere NSAID's in termen van remmend effect op de maag-H, K-ATPase-activiteit; de mechanistische basis voor dit verschil en de mogelijke correlatie met de waargenomen maag-sparende eigenschap van ML 3000, nog worden onderzocht. Figuur 5 Effecten van acetylsalicylzuur, NS 398, naproxen, indomethacine en op H, K-ATPase activiteit. Gastric microsomen gesuspendeerd in ATPase assay buffer bij pH 7,4 werden gedurende 30 min met variërende concentraties van acetylsalicylzuur, NS 398, naproxen, of indomethacine en ATPase activiteit werd daarna gemeten bij pH 7,4. De data-punten tonen gemiddelde SCH28080 gevoelige ATPase-activiteit gemeten in drievoud in drie onafhankelijke testen; kenmerkende gegevens worden getoond deelneemt.
ten slotte om te bepalen of de ML 3000 remming van maag- H, K-ATPase gereflecteerde effecten van de verbinding op vermoedelijke functionele leukotriene metabole routes aanwezig in varkens maag microsomen, bestudeerden wij de effecten van leukotriene B4 en D4 op H, K-ATPase activiteit. Oplosbaarheid kwesties uitgesloten studeren LTB4 of LTD4 concentraties hoger dan 1 uM. Zoals getoond in figuur 6A en 6B, noch leukotriene vertoonde geen remmende activiteit tegen H, K-ATPase bij fysiologische concentraties (10 -9-10 -8 M); Pas bij niet-fysiologische concentraties hoger dan 10 -7 M was er een significante vermindering van H, K-ATPase activiteit. Figuur 6 Effecten van leukotriënen B4 en D4 op SCH28080-gevoelige H, K-ATPase specifieke activiteit. Gastric microsomen gesuspendeerd in ATPase assay buffer bij pH 7,4 werden gedurende 30 min met variërende concentraties leukotrieen B4 of leukotrieen D4 en ATPase activiteit werd daarna gemeten bij pH 7,4. De data-punten tonen gemiddelde ± S.E. drie onafhankelijke assays elk SCH28080-gevoelige ATPase-activiteit werd gemeten in drievoud.
Effecten van ML 3000 op pariëtale cel-histamine gestimuleerde zuur accumulatie
ML 3000 dosisafhankelijk remde histamine gestimuleerde (100 uM) zuur accumulatie van konijnen pariëtale cellen, met een half-maximale remmende concentratie (IC 50) van 40 uM (Figuur 7A). ML 3000 ook dosisafhankelijk remde door forskoline gestimuleerde (100 uM) zuur accumulatie van konijnen pariëtale cellen met een IC 50 ~ van 45 uM (Figuur 7B). Deze gegevens geven aan dat ML 3000 beïnvloedt pariëtale cel zuur-secretoire mechanismen achter cAMP mobilisatie geïnduceerd door histamine H 2 receptoractivering. De gegevens zijn consistent met ML 3000 remming van maagzuursecretie pariëtale cellen van de directe interactie van ML 3000 met de maag H, K-ATPase. De discepancy tussen ML 3000 IC 50 in microsomale blaasjes (15 uM) en in geïsoleerde pariëtale cellen (40-45 uM) suggereert dat ML 3000 toegang tot de intracellulaire H, K-ATPase compartiment pariëtale cellen worden vertraagd permeabiliteit door beperkingen op het plasmamembraan. Alternatief kan ML 3000 worden cytoplasmatische metabolische wijzigingen die remmend vermogen van de verbinding te beperken. Figuur 7 ML 3000 remt zuur accumulatie in konijnen maag pariëtale cellen. (A) Dosisafhankelijke remming door ML 3000 van histamine gestimuleerde (100 uM) zuur accumulatie van konijnen pariëtale cellen (IC50 = 40 uM). (B) Dosis-afhankelijke remming door ML 3000 van forskoline gestimuleerde (100 uM) zuur accumulatie door konijn maag pariëtale cellen (IC50 = 45 uM). De data-punten tonen gemiddelde ± S.E. van vier onafhankelijke assays elk zuur accumulatie in pariëtale cellen werd gemeten in duplo.
slotte, zoals werd gevonden met microsomale H, K-ATPase, andere NSAID's zoals acetylsalicylzuur, naproxen en NS 398 (tot concentraties van 10 -4 M) had geen effect op de accumulatie van zuur geïsoleerde konijn pariëtale cellen (gegevens niet getoond)
Effecten van ML 3000 op IL-1β geïnduceerde IL-8 secretie in menselijke adenocarcinoom (AGS) cellen
onder basislijnomstandigheden, AGS cellen (5 x 10 4 in 100 gl kweekmedium) uitgescheiden IL-8 gedurende 24 uur om een ​​concentratie van ~ 225 pg /ml medium. Wanneer gestimuleerd door IL-1β (1 ng /ml), AGS cell IL-8 secretie gedurende 24 uur werd verhoogd ~ 27-voudig tot een concentratie van ~ 6000 pg /ml. ML 3000 remde zowel baseline en IL--1β gestimuleerde IL-8 secretie, met IC 50s van 0,46 micrometer (CI = 0,09-2,4 uM) en 1,1 micrometer (CI = 0,52-2,2 uM) respectievelijk (Figuur 8A en 8B ). Figuur 8 Effecten van ML 3000 op IL-1β geïnduceerde IL-8 secretie in menselijke adenocarcinoom (AGS) cellen. ML 3000 remde zowel basislijn (A) en IL-1β-gestimuleerde (B) IL-8 secretie, met IC50 van 0,46 uM (CI = 0,09-2,4 uM) en 1,1 uM (CI = 0,52-2,2 uM) respectievelijk. De 5-lipoxygenase-specifieke remmer ZD-2138 toonde dosisafhankelijke remming van de basale AGS cel IL-8 secretie (C), met een IC50 van 58 nM (CI = 15,6-218 nM) en minimaal effect op AGS cell IL-1β gestimuleerde IL-8 secretie (D). De data-punten tonen gemiddelde ± S.E. drie onafhankelijke assays in elk waarvan IL-8 concentraties werden gemeten in drievoud. Ondernemingen De 5-lipoxygenase-specifieke remmer (ZD-2138), die geen effect op microsomale H, K-ATPase activiteit vertoonde dosis-responsieve remming van de baseline AGS cel IL-8 secretie (Figuur 8C), een IC 50 of 58 nM (CI = 15,6-218 nM). ZD-2138 bleek minimaal effect op IL-1β-gestimuleerde IL-8 secretie door AGS cellen (figuur 8D). H, K-ATPase remming door ML 3000, waarvan we hebben aangetoond in deze studie geen grondslag IL-8 secretoire remming in dit model omdat immunocytochemie met H, K-ATPase-specifiek monoklonaal antilichaam vertoont geen H, K-ATPase expressie in AGS-cellen (gegevens niet getoond).
Discussie Inloggen Deze studie geeft informatie over de gevolgen van de ML 3000 over aspecten van maag fysiologie in verband met ulcerogenesis. Drie experimentele modellen van maag-functie werden onderzocht; sterk gezuiverde functionele H, K-ATPase (protonpomp) geïsoleerd uit het maagslijmvlies van slachthuis varkens, konijnen geïsoleerd pariëtale cellen en menselijke adenocarcinoom cellen in kweek. In het eerste model, ML 3000 remde de proton pomp met een IC 50 van 16,4 uM. De protonpompremmer (PPI) omeprazol weergegeven een IC 50 1,1 uM in dezelfde test. Unlike PPI, ML 3000 remmende activiteit was onafhankelijk van de pH en is omkeerbaar. Selectieve en niet-selectieve NSAID toonde geen H, K-ATPase remmende activiteit in dezelfde test. In het tweede model ML 3000 remde zowel histamine en forskoline gestimuleerde ophoping acid (IC 50 = 40 en 45 uM), consistent met ML 3000 remming protonpomp. In het derde model ML 3000 remde zowel basislijn en IL--1β gestimuleerde interleukine-8 secretie van AGS cellen (IC 50 = 0,46 en 1,1 uM, respectievelijk), hoewel de laatste effect geen verband lijkt het 5-lipoxygenase remmende werking ML 3000 (Figuur 8D).
Geplaatst IC 50 voor omeprazol met betrekking tot protonpomp activiteit bereik van 470 nM tot 36 uM, afhankelijk van de voorwaarden van de test [23-25]. Voor andere PPI's, picoprazole IC 50 is 2 pm [26], rabeprazol IC 50 is 72 nM [23], en lansoprazol IC 50 is 2,1 uM [27]. De vele gepubliceerde PPI IC 50 waarden voor microsomale H, K-ATPase weerspiegelt de mechanistische noodzaak verbinding verzuring om vorming van een thiol-reactief sulfoxide tussenproduct dat vervolgens irreversibel derivatizes H, K-ATPase α subeenheid cysteïneresiduen leiden de remming van enzymen.
Deze ML 3000 data ook dramatisch contrast met omeprazol remming van zuur accumulatie in geïsoleerde pariëtale cellen. Acid secretoire capaciteit IC 50s (in geïsoleerde pariëtale cellen) of protonpompremmers (PPI) zoals omeprazol, rabeprazol en lansoprazol liggen tussen 59 nM tot 360 nM [27, 28]. De grotere potentie van protonpompremmers in het kader van zure secretoire capaciteit vergeleken met microsomale H, K-ATPase (IC 50s variërend van 72 nM tot 40 uM) geeft vollediger zure activatie van protonpompremmers in geïsoleerde parietale cel canaliculi dan treedt in in vitro microsomale assays bij een pH van 6,1 of hoger. Ondernemingen De PGE 2 gegevens in tegenstelling tot een eerdere studie waarin geen remmende effect van PGE 2 op varken maag-H, K-ATPase [29] werd gemeld . Verschillen in de specifieke ATPase assay gebruikt in deze studie kan verklaren dit verschil. Aangezien ML3000 en arachidonzuur zijn anionische amfifielen, konden hun remmende effecten het gevolg zijn van specifieke interacties met H, K-ATPase subeenheid bindingsplaatsen, of minder specifieke hydrofobe interacties met H, K-ATPase-geassocieerde microsomale membraanlipiden, of een combinatie van beide factoren. Ondernemingen de reversibiliteit van ML 3000 remming van H, K-ATPase-activiteit in vitro, getoond in figuur 2B, in contrast met de onomkeerbaarheid van H, K-ATPase remming door gesubstitueerde benzimidazolen zoals omeprazol of lansoprazol.

• CD44 /CD24 Expressie in recidiverende maagkanker: een retrospectieve analyse
• Relatie tussen postprandiale veranderingen in de cardiale linker ventrikel functie, glucose en insuline concentraties, maaglediging en verzadiging bij gezonde subjects