Inhibering av gastrisk H, K-ATPase-aktivitet og gastrisk epitelcelle-IL-8-sekresjon av pyrrolizin-derivatet ML 3000

inhibering av gastrisk H, K-ATPase-aktivitet og gastrisk epitelcelle-IL-8-sekresjon av pyrrolizin-derivatet ML 3000
Abstract
Bakgrunn
ML 3000 ([2,2-dimetyl-6- (4-klorfenyl) -7-fenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] -eddiksyre) er en inhibitor av både cyklooksygenase og 5-lipoksygenase in vitro, og viser løfte som en ny ikke-steroid anti-inflammatorisk medikament (NSAID). I motsetning til konvensjonelle NSAIDs som er forbundet med mage ulcerogene effekter, ML 3000 forårsaker liten eller ingen skade på mageslimhinnen, selv om det betydelig presser mage prostaglandinsyntesen.
Metoder
Som et ledd i et forsøk på å avklare mekanismer underliggende mage sparsom egenskaper av ML 3000, studerte vi effektene av ML 3000 med H, K-ATPase-aktivitet in vitro, på syre-akkumulering i isolerte gastriske parietalceller, og den IL-8-sekresjon av magesaft-epitel-celler i kultur.
resultatene
SCH28080 følsomme H, K-ATPase aktivitet i høyt renset gris mage mikrosomer ble doseavhengig hemmet av ML 3000 (IC 50 = 16,4 mm). Inhibering var reversibel, og ufølsom for ML 3000 surgjøring i pH-området 2,0-8,0. I kanin mage parietalceller, etter ML 3000 doseavhengig hemmet histamin-stimulert syreopphopning (IC 50 = 40 mikrometer) og forskolin-stimulert syreopphopning (IC 50 = 45 mikrometer). Til slutt, i human gastrisk adenokarsinom (AGS) celler, ML 3000 doseavhengig inhibert både grunnlinjen og IL-1β-stimulert (20 ng /ml) IL-8-sekresjon med IC 50-årene av 0,46 uM og 1,1 uM hhv.
Konklusjon
dataene indikerer at ML 3000 påvirker syre-sekretoriske mekanismer nedstrøms av cAMP mobilisering fremkalt av histamin H 2 reseptoraktivering, at det direkte hemmer H, K-ATPase-spesifikk aktivitet, og at utgangs gastrisk epitelcelle IL-8 sekretorisk inhibering kan være mediert av ML 3000 hemming av 5-lipoksygenase-aktivitet. Vi konkluderer med at disse magefunksjonshemmende data kan ligge til grunn mage sparsom egenskaper ML 3000.
Bakgrunn Bedrifter Den farmakologiske egenskapene til ikke-steroide antiinflammatoriske midler (NSAIDs) oppstår fra deres undertrykkelse av prostaglandinsyntesen fra arakidonsyre [1] . Inhibering av gastrisk prostaglandinsyntese ledsages imidlertid av redusert gastrisk mucosal blodstrømning, med samtidig mukosal følsomhet for topisk skade ved en rekke irritanter [2]. En lovende farmakologisk strategi for å unngå mage komplikasjoner av NSAIDs fokuserer på samtidig cyklooksygenase og 5-lipoxygenase hemming, med sikte på å undertrykke leukotriene syntese. 5-lipoksygenase omdanner arakidonsyre til leukotriener, hvorav leukotrien B4 er kjemotaktisk for leukocytter og derved bidrar til inflammatoriske mekanismer som fører til gastrointestinale sår [3]. Den pyrrolizin-derivatet ML 3000 ([2,2-dimetyl-6- (4-chlorophen-yl) -7-fenyl-2,3-dihydro-1H-pyrrolizin-5-yl] -eddiksyre) er en inhibitor av både cyklooksygenase og 5-lipoksygenase in vitro [4, 5], og viser løfte som en ny NSAID. ML 3000 reduserer gastrisk prostaglandin E2-syntese hos rotter mage og blod, selv om signifikant inhibering av gastrisk eller blod leukotrien B4 syntese ikke ble detektert [6]. Viktigst, ML 3000 har ingen effekt på leukocytt tilslutning i mesenteriale venyler, og forårsaker ingen gastrisk mucosal skade [6].
I dyremodeller, ML 3000 ble funnet å være farmakologisk godartet. Således har forbindelsen ikke påvirke rotte lokomotorisk aktivitet eller hexobarbital-indusert søvn, hadde ingen kardiovaskulære eller respiratoriske effekter hos rotte og hund, var uten effekt på neuromuskulær funksjon hos katter, og forårsaket ingen gastrisk skade eller peristaltiske forstyrrelser [7]. ML 3000 vakte en svak spasmogene respons i marsvin ileum, og forårsaket en liten forbigående reduksjon i urinproduksjonen hos rotter [7]. Gentoksisitetsstudier indikerer at ML 3000 har ingen effekt på genmutasjon frekvenser i bakterier eller pattedyrceller, på ukontrollert DNA syntese, eller på hyppigheten av kromosomavvik i rottebenmargceller [8]. 14C-merket ML 3000 distribusjon og ekskresjonssystemer studier i rotter indikerer enterohepatisk sirkulasjon og glukuronidkonjugering av ML 3000 [9].
Farmakologiske profilen til ML 3000 som undersøkt i dyremodeller viser anti-inflammatorisk, analgetisk, antipyretisk, antiastmatisk, og antiaggregative aktivitet ved en dose som forårsaker ingen gastrisk skade [4, 10]. Den akutte og kroniske betennelsesdempende egenskaper av ML 3000 studert i adjuvans-indusert rottepoteødemmodell [11] viser at selv om indomethacin er noe mer potent som et antiinflammatorisk middel, var ingen gastrisk skade bemerket med ML 3000 inntil 100 mg /kg /d po, ​​mens ulcerogent dose (UD 50) for indometacin var 7 mg /kg /d po
magesår indusert av NSAIDs begrenser betydelig nytten av disse stoffene. Åpenbart en kombinasjon av anti-inflammatorisk og mage sparsom egenskaper utstilt ved ML 3000 gjør denne forbindelsen en attraktiv kandidat for videre studier. To mage slimhinne funksjoner som spiller viktige roller i magesår er magesyre og interleukin-8 sekresjon. Syresekretoriske hemmere er blant de mest-foreskrevet medisiner, noe som reflekterer den fysiologiske ordtaket "No syre, ingen sår". Farmakologisk eller patofysiologiske brudd av de mucosale gastriske barrierer mot rygg diffusjon av HCl fører til hurtig erosjon av epiteliale gastrisk monolaget og følgelig sårdannelse på slimhinnen. Syresekresjonshemming av antagonisme på parietalcellen histamin H2-reseptor (cimetidin), eller ved direkte kovalent derivatisering og inaktivering av mage protonpumpe (omeprazol, lansoprazol, rabeprazol, esomeprazol, etc) er rutine for forbedring og fremme helbredelse av mage magesår. Således kan sparsom gastriske effekter av ML 3000 være relatert til syresekretoriske hemming av forbindelsen., En komplementær gastrisk sparende effekten av ML 3000 kan involvere modulering av gastrisk sekresjon av det pro-inflammatoriske cytokin IL-8. Aspirin-indusert gastrisk skade er blitt rapportert å være assosiert med økt antral produksjon av IL-8 [12]. Den ulcerogene bakterien Helicobacter pylori
har vist seg å øke frekvensen og amplituden for IL-8-sekresjon både in vitro og in vivo [13-15], og for å oppregulerer IL-8 genekspresjon [16]. Lignende IL-8 prosecretory effekter blir sett på som et resultat av IL-1β stimulering av mage-epitelceller. Sammenligning av effekten av ML 3000 og andre NSAIDs på disse mage sekretoriske aktivitetene kan belyse den mekanismen som ML 3000 hindrer dannelse av mage slimhinnelesjoner.
For å klargjøre mekanismene bak mage sparsom egenskaper av ML 3000, vi undersøkte effekten av ML 3000 ved to gastrisk mucosal sekretoriske funksjoner med roller i ulcerogenesis: sekresjon av saltsyre, og sekresjon av det inflammatoriske cytokin interleukin-8. Våre data viser at ML 3000 inhiberer gastrisk gris mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet, hemmer histamin-stimulert surgjøring i kanin gastriske parietalceller, og hemmer IL-1β-stimulert IL-8-sekresjon med humane mage-epitelceller.
Methods
Reagenser
ML 3000 og ZD-2138 ble gitt av Forest Laboratories, Inc., New York, NY, omeprazol ble gitt av Astrazeneca R & D, Mölndal, Sverige, SCH 28080 var fra Schering-Plough Research Institute, Kenilworth, NJ, TEDBC kom fra Tocris Cookson, Inc., Ballwin, MO, og NS 398 kom fra Cayman Chemicals, Inc., Ann Arbor, MI. Arakidonsyre, indometacin, acetylsalisylsyre, naproxen, PGE 2, leukotriener B4 og D4, og IL-1β ble alle kjøpt fra Sigma-Aldrich Corp, St. Louis, MO. Dimetylsulfoksyd (Sigma-Aldrich) ble anvendt for å oppløse ML3000, SCH28080, ZD-2138, TEDBC, NS 398, og indometacin. Acetylsalisylsyre og naproxen ble oppløst i ATPase-analysebuffer (se nedenfor
). Arakidonsyre og PGE 2 ble oppløst i absolutt etanol, og omeprazol ble oppløst i metanol. Leukotrienene B4 og D4 ble levert oppløst i en 70:30 blanding av metanol og 17 mM ammoniumacetat. IL-1β ble oppløst i fosfat-bufret saltløsning (pH 7,4), 0,1% w /v bovint serumalbumin. Alle analyser ved anvendelse av disse forbindelsene er inkludert egnede løsningsmiddelkontrollprøver, og alle oppløsningsmidler var tilstede i konsentrasjoner på mindre enn 1% vekt /volum i sluttprøveblanding.
Fremstilling av H, K-ATPase
mikrosomal gastrisk H, K-ATPase ble fremstilt fra grise gastriske slimhinne homogenater ved differensial og sukrose /Ficoll trinn gradientsentrifugering som tidligere beskrevet [17]. Dette preparatet gir en forholdsvis tung (7% Ficoll /1,1 M sukrose grensesnitt) GII mikrosomal fraksjon, som viste ingen ventetid av K-ATPase-aktivitet, og som omfattet ~ 90% H, K-ATPase, basert på densitometri av et 94 kDa bånd ved hjelp av SDS-PAGE-analyse. Gii mikrosomer ble lagret ved -80 ° C i 20% glycerol.
H, ble K-ATPase-analysen
ATP-hydrolytiske aktivitet av gris gastriske mikrosomer kvantifisert som ortofosfat frigjøring fra underlaget ATP ved anvendelse av en kolorimetrisk malakittgrønt prosedyre [18] . ATPase-analyser ble utført i 96-brønners mikroplater. I korthet, 100 ul /brønn analysebuffer (60 mM Tris-HCl, pH 7,4, 2 mM MgCl 2, 1 mM EGTA, ± 7,5 mM KCl, ± 50 uM SCH28080), inneholdende 80 ng mikrosomal H, K-ATPase , ML 3000 (10 -9 M til 10 -4 M) eller andre forbindelser, og 1 mM ATP ble inkubert i 30 minutter ved 37 ° C. Enzymatisk aktivitet ble stoppet ved tilsetning (45 ul /brønn) av kolorimetrisk reagens (0,07% malakittgrønt, 3,7 NH 2SO 4, 2,27% ammoniummolybdat-tetrahydrat, 0,134% Tween-20). Etter 10 sekunder ble fargereaksjonen utvikles ved tilsetning (45 ul /brønn) av 15% natrium-citrat. Etter 45 minutter ved romtemperatur, ble absorbans av brønner ved 570 nm måles i en mikroplateleser.
For å måle effekten av ML 3000 surgjøring på ATPase-inhibering, ML 3000 aliquoter (10 mM i 5 mM Tris-HCl) var titreres til pH-verdier som varierer 2,0 til 7,4 i 30 minutter. Gastriske mikrosomer suspendert i standard ATPase analysebuffer ved pH 7,4 ble inkubert i 30 minutter med surgjort alikvoter av ML 3000 (16,6 pM sluttkonsentrasjon ML 3000) og deretter ATPase-aktiviteten ble målt som beskrevet ovenfor. For å måle omeprazol hemming av H, K-ATPase-aktivitet ble gastrisk mikrosomer suspendert i ATPase analysebuffer ved pH 6,1 inkubert i 30 minutter med varierende konsentrasjoner av omeprazol. Omeprazol surgjøring til pH 6,1 var nødvendig for å tillate dannelse av den hemmende tiol-reaktivt sulfoksyd mellomprodukt [19]. De gastriske mikrosomer ble så overført til standard ATPase analysebuffer ved pH 7,4, og ATPase-aktivitet ble målt som beskrevet ovenfor. Spesifikk H, K-ATPase-aktivitet ble beregnet som forskjellen i mikrosomale ATPase-aktivitet i nærvær og fravær av den spesifikke reversible gastrisk H, K-ATPase-inhibitor SCH28080, og ble uttrykt som umol p i /mg protein /time. H, K-ATPase aktivitet av fersk forberedt gris mage mikrosomer varierte fra 140 til 170 umol P i /mg protein /t. Grafisk fremstilling av dataene viser prosent inhibering av H, K-ATPase-aktivitet som en funksjon av forbindelseskonsentrasjon.
Primær cellepreparat
gastriske parietalceller ble isolert fra New Zealand hvite kaniner av pronase /kollagenase fordøyelse av mucosa fundus fulgt ved anrikning av celler på diskontinuerlige gradienter Nycodenz som tidligere beskrevet [20]. Parietalcellen preparater inneholdt omtrent 10 7 celler /mage, 80 ± 5% var parietalceller basert på immunocytochemistry med H, K-ATPase-spesifikt monoklonalt antistoff.
Acid Opphopning analysen
aminopyrin opphopning i isse som cellene ble undersøkt i 96-brønners filterplater med Durapore membraner, som tidligere beskrevet [21]. I korthet ble cellene preinkubert med [ 14C] -aminopyrine og deretter 100.000 celler /200 ul per brønn ble inkubert uten eller med testforbindelser i 15 minutter før inkuberingen for en ytterligere 30 min i fravær eller nærvær av 100 pM histamin eller 100 mikrometer forskolin. Alle bestemmelser ble utført i fire paralleller. Basal aminopyrin akkumulering ble bestemt som aminopyrin akkumulering inn i ubehandlede celler trekkes fra akkumulering i nærvær av KSCN (en gjenspeiling av ikke-spesifikk isotop overlapping). Grafisk fremstilling av dataene viser prosent inhibering av histamin-stimulert syre akkumulering av celler som en funksjon av forbindelseskonsentrasjon.
Gastric adenokarsinomceller
menneske med adenokarsinom i celler (AGS-celler, ATCC CRL 1739), ble opprettholdt i AGS medium (Hams F-12, 10% føtalt bovint serum, 100 enheter /ml penicillin G, 0,25 ug /ml amfotericin B, 100 ug /ml streptomycin) ved 37 ° C i en 5% CO 2/95% luft inkubator og brukes mellom passasjene 42 og 56. for studier av IL-8-sekresjon, ble AGS-celler sådd ut i 96-brønners plater (50,000 celler /100 ul /brønn) og fikk feste seg i 18 timer ved 37 ° C i 5% CO 2/95% luft. Cellene ble deretter inkubert med testforbindelser i nærvær og fravær av IL-1β i 24 timer, ved hvilken tid prøver av medium ble fjernet fra brønnene og lagret ved -70 ° C. IL-8-konsentrasjoner av prøvene ble bestemt ved hjelp av enzymbundet immunosorbent assay (human IL-8-Duo Set ELISA-systemet, R &D Systems Inc., Minneapolis, MN). Grafisk fremstilling av dataene viser prosent inhibering av ustimulert eller stimulert IL-8-sekresjon som en funksjon av forbindelseskonsentrasjon statistisk analyse
Alle eksperimenter ble utført minst tre ganger.; datapunktene i hver analyse representerer måle midler fra tredoble prøver. Datapunkter som passer en tre parameter logistisk ligning ble tegnes som sigmoidal dose-responskurver som bruker Prism statistikkpakken (GraphPad Software, Inc., San Diego, California). Halv-maksimal hemmende konsentrasjoner (IC 50) og IC 50 95% konfidensintervall (KI) ble også beregnet ved hjelp av Prism. Datapunktene ikke passer en tre parameter logis ble trukket som enkle punkt-til-punkt-kurver. Standardfeil var det mål av variansen brukt for feilfelt i grafisk fremstilling av data
Resultater
Effekter av ML 3000 på H, K-ATPase aktivitet
Gastric H, K-ATPase aktivitet ble doseavhengig hemmet av ML 3000, med en halv-maksimal hemmende konsentrasjon (IC 50) på 16,4 um (CI = 6,84 til 39,3 uM) (figur 1A). Den hemmende aktivitet av ML 3000 ble sammenlignet med en klassisk protonpumpeinhibitor (PPI), det substituerte benzimidazol omeprazol. Figur 1B viser effekten av omeprazol med H, K-ATPase-aktivitet i henhold til analysebetingelser identiske med dem på figur 1A; den beregnede IC 50 for omeprazol var 1,7 mikrometer (CI = 0,26 til 11,3 mm). Disse data viser at ML 3000 er betydelig mindre potent enn omeprazol med hensyn til gastrisk H, K-ATPase-inhiberende aktivitet, i det minste i innstillingen av denne in vitro-analyse under de spesifiserte betingelser. For å avgjøre om ML 3000 vises sammenlignbare syre-aktiverings egenskaper, ble en halv-maksimal hemmende konsentrasjon av ML 3000 titrert til forskjellige pH-verdier og effekter på H, K-ATPase aktivitet ble målt. Som vist i figur 2A, surgjøring av ML 3000 hadde ingen signifikant effekt på H, K-ATPase inhibitorisk profil. Disse data indikerer at ML 3000, i motsetning til omeprazol, ikke krever surgjøring for induksjon av inhibitorisk aktivitet. Gitt at PPIs er irreversible hemmere av H, K-ATPase aktivitet, kovalent binding til den katalytiske α-subenheten, forsøkte vi å finne ut om ML 3000 hemming av H, K-ATPase var reversibel eller irreversibel. Gastrisk H, K-ATPase-anrikede mikrosomer ble behandlet med en maksimalt-inhiberende konsentrasjon av ML 3000 og deretter fortynnet med et stort overskudd av buffer for å redusere ML 3000-konsentrasjonen fra 100 uM til 3,3 uM. Resultatene, vist i figur 2B, indikerte at fortynning av ML 3000 gjengitte H, K-ATPase-aktivitet, og er i overensstemmelse med ML 3000 inhibering av H, K-ATPase-aktivitet på en reversibel måte, det vil si., ML 3000 ikke kovalent derivatisere enten subenheten av gastrisk H, K-ATPase, i det minste under betingelsene ifølge den foreliggende in vitro analyse av H, K-ATPase-aktivitet. I dette henseende, ML 3000 er kinetisk lik SCH28080, det spesifikke reversibel inhibitor av gastrisk H, K-ATPase. Figur 1 Dose-avhengig inhibering av H, K-ATPase-aktivitet av ML 3000 (A) og av omeprazol (B). (EN). Gastriske mikrosomer suspendert i ATPase analysebuffer ved pH 7,4 ble inkubert i 30 minutter med varierende konsentrasjoner av ML 3000 og ATPase-aktivitet ble deretter målt ved pH 7,4. Den halv-maksimal hemmende konsentrasjon (IC50) for ML 3000 var 16,4 pM (CI = 6,84 til 39,3 uM). (B). Gastriske mikrosomer suspendert i ATPase analysebuffer ved pH 6,1 ble inkubert i 30 minutter med varierende konsentrasjoner av omeprazol, og deretter overført til standard ATPase analysebuffer ved pH 7,4 for ATPase-aktivitetsmåling. IC50 for omeprazol var 1,1 mikrometer (CI = 0,26 til 11,3 mm). Data-poeng viser gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige analysene i hver av hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet ble målt in triplo.
Figur 2 Effekt av ML 3000 surgjøring med H, K-ATPase-aktivitet (A), og ML 3000 hemming av H, K-ATPase-aktivitet er reversibel (B). (A) ML 3000 alikvoter (10 mM i 5 mM Tris-HCl) ble titrert til pH-verdier som varierer 2,0 til 7,4 i 30 minutter før tilsetning til standard ATPase-analysebuffer (pH 7,4) inneholdende gastrisk mikrosomer. (B) Gastriske mikrosomer ble behandlet med en maksimalt-inhiberende konsentrasjon (100 uM) av ML 3000. Den mikrosomale suspensjonen ble deretter fortynnet med et stort overskudd av buffer for å redusere ML 3000-konsentrasjonen fra 100 uM til 3,3 uM. Både i (A) og (B), datapunkter viser gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige analyser i hver av disse SCH28080-sensitive ATPase aktivitet ble målt i tre eksemplarer.
Arakidonsyre og prostaglandin E 2 (PGE 2) også doseavhengig hemmet H, K-ATPase aktivitet, med IC 50 på 16,7 mikrometer (KI = 8,9 til 31,5 mm) og 15 mikrometer (CI = 3,96 til 57,3 mm) henholdsvis (figur 3A og 3B). Siden ML 3000 viser også 5-lipoksygenase-inhibering, studerte vi effektene av to lipoksygenaseinhibitorer på mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet. Figur 4A viser at 2- (1-tienyl) etyl-3,4-dihydroxybenzylidenecyanoacetate (TEDBC), en kraftig inhibitor av 5-, 12- og 15-lipoxygenses, hemmet mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet med en IC 50 av 22,6 mikrometer (KI = 6,3 til 81,2 mm). I motsetning til 5-lipoksygenase-spesifikk hemmer 6 - ((3-fluor-5- (metoksy-3,4,5,6-tetrahydro-2H-pyran-4-yl) fenoksy) metyl) chinolin (ZD-2138 ) hadde en minimal effekt på H, K-ATPase-aktivitet (~ 20% inhibering ved 10 -5 M) (figur 4B). Disse dataene er konsistente med mage mikrosomale 12- og 15-lipoksygenaser spille en rolle i H, K-ATPase aktivering, eller med direkte interaksjon av TEDBC med H, K-ATPase subenheter endre enzym konformasjon og dermed aktivitet. Åpenbart begge tolkninger er provoserende og fortjener videre studier. Figur 3 Inhibering av H, K-ATPase-aktivitet av arakidonsyre (A) og prostaglandin E2 (B). Gastriske mikrosomer suspendert i ATPase analysebuffer ved pH 7,4 ble inkubert i 30 minutter med varierende konsentrasjoner av arakidonsyre eller PGE2 og ATPase-aktivitet ble deretter målt ved pH 7,4. IC50 for arakidonsyre var 16,7 mikrometer (KI = 8,9 til 31,5 mm), og IC50 for PGE2 var 15 mikrometer (CI = 3,96 til 57,3 mm). Data-poeng viser gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige analysene i hver av hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet ble målt in triplo.
Figur 4 Inhibering av H, K-ATPase-aktivitet ved 5-, 12-, og 15-lipoksygenase-inhibitor TEDBC (A), og 5-lipoksygenase-inhibitor ZD-2138 (B). Gastriske mikrosomer suspendert i ATPase analysebuffer ved pH 7,4 ble inkubert i 30 minutter med varierende konsentrasjoner av TEDBC eller ZD-2138 og ATPase-aktivitet ble deretter målt ved pH 7,4. In (A), datapunktene viser gjennomsnittlig SCH28080-sensitive ATPase aktivitet målt i tre eksemplarer i en av tre uavhengige analyser; typiske data vises. Data-poeng i (B) viser gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige analysene i hver av hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet ble målt in triplo.
For å sammenligne H, K-ATPase inhibitorisk virkning av ML 3000 med andre NSAIDS, målte vi effektene av acetylsalisylsyre, NS 398, naproxen, og indometacin på protonpumpeaktivitet. Alle fire NSAIDS var uten inhiberende virkninger på mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet ved konsentrasjoner opp til 10 -4 M (10 -3 M for acetylsalisylsyre) (Figur 5A, 5B, 5C og 5D). Indometacin ble tidligere rapportert å hemme gastrisk H, K-ATPase ved noe høyere konsentrasjon (K i = 0,67 x 10 -3 M) [22]. Våre data klart skille ML 3000 fra andre NSAIDS i form av hemmende effekt på mage H, K-ATPase aktivitet; det mekanistiske grunnlaget for denne forskjellen, og potensialet sammenheng med den observerte mage-sparing eiendom ML 3000, gjenstår å bli undersøkt. Figur 5 Effekter av acetylsalisylsyre, NS 398, naproxen, indometacin og på H, K-ATPase-aktivitet. Gastriske mikrosomer suspendert i ATPase analysebuffer ved pH 7,4 ble inkubert i 30 minutter med varierende konsentrasjoner av acetylsalisylsyre, NS 398, naproksen eller indometacin og ATPase-aktivitet ble deretter målt ved pH 7,4. Data-poeng viser gjennomsnittlig SCH28080-sensitive ATPase aktivitet målt i tre eksemplarer i en av tre uavhengige analyser; typiske data er vist i hvert tilfelle.
Til slutt, for å fastslå om ML 3000 inhibering av gastrisk H, K-ATPase reflekterte sammensatte virkninger på antatte funksjonelle leukotrien-metabolske baner som er tilstede i grise gastriske mikrosomer, studerte vi effektene av leukotriene B4 og D4 på H, K-ATPase aktivitet. Løselighetsproblemer utelukket å studere LTB4 eller LTD4 konsentrasjoner større enn 1 um. Som vist i figur 6A og 6B, heller ikke leukotrien viste noen hemmende aktivitet mot H, K-ATPase ved fysiologiske konsentrasjoner (10 "^ sup> -9-10 -8 M); bare på ikke-fysiologiske konsentrasjoner større enn 10 -7 M var det noen betydelig demping av H, K-ATPase aktivitet. Figur 6 Effekter av leukotriener B4 og D4 på SCH28080 sensitive H, K-ATPase spesifikk aktivitet. Gastriske mikrosomer suspendert i ATPase analysebuffer ved pH 7,4 ble inkubert i 30 minutter med varierende konsentrasjoner av leukotrien B4 eller leukotrien D4 og ATPase-aktivitet ble deretter målt ved pH 7,4. Data-poeng viser gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige analysene i hver av hvilke SCH28080-sensitive ATPase-aktivitet ble målt in triplo.
Effekter av ML 3000 på gastrisk parietalcelle histamin-stimulert syre opphopning
ML 3000 doseavhengig inhibert histamin-stimulert (100 pM) syre opphopning av kanin gastriske parietalceller, med en halv-maksimal hemmende konsentrasjon (IC 50) på 40 pM (figur 7A). ML 3000 har også en doseavhengig inhibert forskolin-stimulert (100 uM) syre opphopning av kanin gastriske parietalceller, med en IC 50 på ~ 45 pM (figur 7B). Disse data indikerer at ML 3000 påvirker parietal celle syre-sekretorisk mekanismer nedstrøms av cAMP mobilisering fremkalt av histamin H 2 reseptoraktivering. Dataene er i samsvar med ML 3000 hemming av parietal celle syresekresjon som følge av direkte interaksjon av ML 3000 med gastrisk H, K-ATPase. Men discepancy mellom ML 3000 IC 50 i mikrosomale vesikler (15 mm) og i isolerte parietalceller (40-45 mm) tyder på at ML 3000 tilgang til den intracellulære H, kan K-ATPase rommet i parietalceller bli bremset av permeabilitet begrensninger på plasmamembranen. Alternativt kan ML 3000 være gjenstand for cytoplasmiske metabolske endringer som begrenser hemmende potensen av forbindelsen. Figur 7 ML 3000 hemmer syre opphopning i kanin mage parietalceller. (A) Doseavhengig inhibering av ML 3000 av histamin-stimulert (100 uM) syre opphopning av kaninmave parietal-celler (IC50 = 40 uM). (B) en doseavhengig inhibering av ML 3000 av forskolin-stimulert (100 uM) syre opphopning av kanin gastriske parietalceller (IC50 = 45 pM). Data-poeng viser gjennomsnitt ± S.E. fra fire uavhengige analyser på hver av hvilke syre opphopning inn i parietal-celler ble målt i duplikat.
slutt, som ble funnet med mikrosomal H, K-ATPase, andre NSAIDS for eksempel acetylsalisylsyre, naproxen, og NS 398 (opptil konsentrasjoner på 10 -4 M) hadde ingen effekt på syre opphopning av isolerte kanin parietal-celler (data ikke vist)
Effekter av ML 3000 på IL-1β-indusert IL-8-sekresjon i humant gastrisk adenokarsinom (AGS) cellene
Under grunnlinjebetingelser, AGS-celler (5 x 10 4 i 100 ul kulturmedium) utsondret IL-8 i en periode på 24 timer til en konsentrasjon på ~ 225 pg /ml medium. Når de ble stimulert med IL-1β (1 ng /ml), AGS celle IL-8-sekresjon over en periode på 24 timer ble økt ~ ​​27 ganger, til en konsentrasjon på ~ 6000 pg /ml. ML 3000 hemmet både baseline og IL-1β-stimulerte IL-8 sekresjon, med IC 50-årene av 0,46 um (CI = 0,09 til 2,4 mikrometer) og 1,1 mikrometer (CI = 0,52 til 2,2 mikrometer) henholdsvis (figur 8A og 8B ). Figur 8 Effekter av ML 3000 på IL-1β-indusert IL-8 sekresjon i menneskets mage adenokarsinom (AGS) celler. ML 3000 inhiberte både basislinje (A) og IL-1β-stimulert (B) IL-8-sekresjon, med IC50s på 0,46 pM (KI = 0,09 til 2,4 uM) og 1,1 um (CI = 0,52 til 2,2 um) henholdsvis. 5-lipoksygenase-spesifikk hemmer ZD-2138 viste doseavhengig inhibering av referanse AGS celle IL-8-sekresjon (C), med en IC50 på 58 nM (CI = 15,6 til 218 nM) og minimal effekt på AGS celle IL-1β stimulert IL-8-sekresjon (D). Data-poeng viser gjennomsnitt ± S.E. fra tre uavhengige analysene i hver av hvilke IL-8-konsentrasjoner ble målt in triplo.
5-lipoksygenase-spesifikk inhibitor (ZD-2138), som var uten effekt på mikrosomal H, K-ATPase-aktivitet, viste dose-responsive inhibering av referanse AGS celle IL-8-sekresjon (figur 8C), med en IC 50 av 58 nM (CI = 15,6 til 218 nM). ZD-2138 viste minimal effekt på IL-1β-stimulert IL-8-sekresjon med AGS celler (figur 8D). H, K-ATPase-inhibering ved hjelp av ML 3000, som vi har vist i denne studien, er ikke til grunn for IL-8 sekretorisk inhibering i denne modellen fordi immunocytokjemi med H, viser K-ATPase-spesifikt monoklonalt antistoff ikke H, K-ATPase-ekspresjon i AGS celler (data ikke vist).
diskusjon
Denne studien gir informasjon om effektene av ML 3000 om aspekter av mage fysiologi relatert til ulcerogenesis. Tre eksperimentelle modeller av gastrisk funksjon ble undersøkt; svært renset funksjonelle H, K-ATPase (proton pump) isolert fra mageslimhinnen av slakteri griser, isolert kanin mage parietalceller og menneskelige adenokarsinom celler i kultur. I den første modell, ML 3000 hemmet proton pumpe med en IC 50 på 16,4 uM. Den protonpumpeinhibitor (PPI) omeprazol viste en IC 50 1,1 uM i den samme assay. I motsetning til PPIer, ML 3000 inhibitorisk aktivitet var uavhengig av pH og var reversibel. Selektive og ikke-selektive NSAIDS viste ingen H, K-ATPase inhibitorisk aktivitet i den samme assay. I den andre modellen, ML 3000 hemmet både histamin og forskolin-stimulert akkumulering syre (IC 50 = 40 og 45 uM), i samsvar med ML 3000 protonpumpe-inhibering. I den tredje modellen, ML 3000 hemmet både grunnlinjen og IL-1β-stimulerte interleukin-8-sekresjon fra AGS-celler (IC 50 = 0,46 og 1,1 uM henholdsvis), selv om den sistnevnte effekt synes ikke er relatert til 5-lipoksygenase-inhiberende aktivitet av ML 3000 (figur 8D).
Publisert IC 50 for omeprazol med hensyn til mage protonpumpe aktivitet varierer fra 470 nM til 36 mikrometer avhengig av forholdene i analysen [23-25]. For andre PPIs, picoprazole IC 50 er 2 mikrometer [26], Rabeprazole IC 50 er 72 nM [23], og lansoprazol IC 50 er 2,1 mikrometer [27]. Det store utvalget av publisert PPI IC 50 verdier for mikrosomal H, reflekterer K-ATPase det mekanistiske nødvendighet for sammensatte forsuring å tillate dannelsen av en tiol-reaktivt sulfoxide mellom som deretter irreversibelt derivatizes H, K-ATPase α-subenheten cysteinrester ledende enzymhemming.
Disse ML 3000 data også kontrast dramatisk med omeprazol hemming av syre opphopning i isolerte parietalceller. Syresekretoriske kapasitet IC 50-tallet (i isolerte parietalceller) av protonpumpehemmere (PPI) som omeprazol, rabeprazole, og lansoprazol er i området 59 nM til 360 nM [27, 28]. Den større potensen til PPIer i sammenheng med syre sekretorisk kapasitet i forhold til mikrosomalt H, K-ATPase (IC 50s som strekker seg fra 72 nM til 40 uM) reflekterer mer fullstendig syreaktivering av PPIer i isolerte parietalcellen canaliculi enn forekommer i i vitro assays mikrosomale ved pH 6,1 eller høyere.
PGE 2-data er i motsetning til en tidligere studie hvor ingen inhiberende virkning av PGE 2 på gris gastrisk H, K-ATPase [29] ble rapportert . Forskjeller i spesifikke ATPase test som benyttes i denne studien kan forklare dette avviket. Siden ML3000 og arakidonsyre er anioniske amfifiler, kan deres inhiberende virkninger skyldes spesifikke interaksjoner med H, K-ATPase-subenhet-bindingsseter, eller fra mindre-spesifikke hydrofobe interaksjoner med H, K-ATPase-assosiert mikrosomale membranlipider, eller en kombinasjon av begge faktorer.
reversibiliteten av ML 3000 hemming av H, K-ATPase-aktivitet in vitro, vist i figur 2B, i kontrast med den irreversibilitet av H, K-ATPase-inhibering ved hjelp av substituerte benzimidazoler så som omeprazol eller lansoprazol.

• CD44 /CD24 uttrykk i tilbakevendende magekreft: en retrospektiv analyse
• Forholdet mellom postprandial endringer i hjerte venstre ventrikkel funksjon, glukose og insulin konsentrasjoner, ventrikkeltømming og metthetsfølelse hos friske personer