Identifikacija veljavnih referenčnih genov za študij izražanja genov človeškega raka na želodcu z reverzno transkripcijo-qPCR

Identifikacija veljavnih referenčnih genov za študij izražanja genov človeškega raka na želodcu, ki ga reverzne transkripcije-qPCR
Abstract
Ozadje
reverzno transkripcijo kvantitativne realnem času verižne reakcije s polimerazo (RT-qPCR) je učinkovita metoda za analizo genske ekspresije. stopnje izraženosti ciljnega gena so ponavadi normaliziran dosledno izraženo referenčnega gena znan tudi kot internega standarda v istem vzorcu. Vendar pa je veliko truda ni bila tako daleč pri iskanju referenčnih genov, ki so primerni za proučevanje raka na želodcu s pomočjo RT-qPCR porabila, čeprav je izbor optimalnih referenčnih genov ključnega pomena za interpretacijo rezultatov.
Metode
ocenil smo ustreznost šestih možnih referenčnih genov, beta-aktin (ACTB) glyceraldehydes-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), hipoksantin fosforibozil transferaza 1 (HPRT1), beta-2-mikroglobulin (B2M), ribosomske podenote L29 (RPL29) in 18S ribosomske RNA (18S rRNA) v 20 normalnih in tumorja na želodcu tkiva parov bolnikov z rakom želodca in 6 želodca raka celičnih linij, ki jih RT-qPCR. . Zaposlujejo izraz stabilnost analize z uporabo NormFinder in geNorm algoritme smo določili vrstni red izvedbe teh referenčnih genov in njihovih različic vrednot
Rezultati
Ta RT-qPCR študije so pokazali, da obstajajo statistično značilne (p
< 0,05 ) razlike v stopnjah izražanja v HPRT1 in 18S rRNA v "plovila običajno" v primerjavi z "tumor želodčne tkiv". Stabilnost analize, ki jih geNorm kažejo B2M-GAPDH, kot najboljši referenčni genske kombinacije za "rak želodca celičnih linijah"; RPL29-HPRT1, za "vse želodčne tkiv"; in ACTB-18S rRNA, za "vse želodec celic in tkiv". NormFinder ugotovljene tudi B2M kot najboljši referenčnega gena za "rak želodca celičnih linij", RPL29-B2M za "vse želodcu tkiv", in 18S rRNA-ACTB za "vse želodec celic in tkiv". Primerjave normirane ekspresije ciljnega gena, GPNMB, je pokazala drugačno razlago ciljne izražanja genov odvisna od najboljših enotno referenčno gena ali kombinacije.
Zaključek
Ta študija potrjena RPL29 in RPL29-B2M kot najboljše posameznih referenčnih genov in kombinacija za RT-qPCR analize "vse želodčne tkiv", in B2M in B2M-GAPDH kot najboljšo enotno referenčno gena in kombinaciji, za "želodcu raka celičnih linijah". Uporaba teh validiranih referenčnih genov bi morala zagotoviti bolj natančno razlago diferencialnih genskih izrazov na ravni transkripcije raka na želodcu.
Ozadje
reverzno transkripcijo količinsko realnem času verižna reakcija s polimerazo (RT-qPCR) je močno orodje za potrjevanje opazovanih genov izraz razlike, zaradi njene večje občutljivosti in specifičnosti. V tradicionalnih študij izražanja genov, je "referenčni gen", ki se imenuje tudi "interni standard" ali "vzdrževalni gen", ki se uporablja za normalizacijo. Izraz beta-aktina (ACTB) in glyceraldehydes-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH), ki se uporablja v večini raziskav [1], so poročali, da spreminja z eksperimentalnimi pogoji [2] in kliničnega stanja tkiva preučevali (npr
astma), pri čemer so ti geni neprimerni kot notranjih standardov za uporabo v normalizacijo genske ekspresije [3]. . Tako je veljavnost referenčnega gena izbran za statistično analizo, je ključnega pomena za preprečevanje nevarnosti napačne razlage podatkov in neveljavne sklepe [4] PODJETJA
Predlagano je bilo, da je treba vsaj tri ugotovitve upoštevati pri izbiri referenčnega gena: 1) konstantnost njegovega izražanja vsej intervencije, 2) njegovo pomnoževanje učinkovitost in 3) njegova številčnost, ki naj bi bila podobna tisti genov interesa [5]. Poleg tega, da bi zagotovili ustreznost, natančnost in pravilnost razlage RT-qPCR, je priporočljivo, da je treba natančne smernice za RT-qPCR MIQE (minimalne informacije za Objava kvantitativne PCR v realnem času poskusa) držati [6] . Več orodja za statistične analize, kot so NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] so bili razviti za pomoč pri izbiri ustreznih referenčnih genov. Ta orodja oceniti razlike v izražanju številnih potencialnih referenčnih genov in predlagati kateri referenčni gen (e) je primerno za normalizacijo podatkov genske ekspresije v neki raziskavi. Rak
želodca je četrti najpogostejši rak na svetu, s a poročali 934,000 primerov v letu 2002 [10]. Preživetja zaradi raka na želodcu, je slaba, saj so bolniki pogosto diagnosticirana šele, ko je bolezen že precej [11] napredovala, kar omogoča zgodnje odkrivanje zelo pomembno. Presejanje z namenom zgodnjega odkrivanja vključuje pregled endoskopsko. Za potrditev prisotnosti raka, ki biopsije vzete iz osumljenih tkiv in izpostavimo RT-qPCR potrditev nenormalno ekspresijo raka povezanih genov. Toda ustrezne referenčne geni morajo biti določeni za veljavne primerjave med prijavo normalno v primerjavi z rakom genov. Referenčne geni so bili opisani za študij RT-qPCR v različnih raka drugih tkiv [1, 12-21]. Vendar pa se zdi, da ni soglasja o referenčnih genov za študij izražanja genov pri raku na želodcu. Zato smo iskali PubMed z MeSH smislu "z rakom na želodcu", "realnem času" in "PCR". Pri oceni 115 člankov, objavljenih od maja 2007 do novembra 2009, smo ugotovili, da GAPDH (53 primerov; 46,1%), so najpogosteje uporabljene referenčne geni v študijah z rakom želodca in ACTB (35,7% 41 primerov); sledi 18S rRNA (8 primerov, 7,0%), beta-2-mikroglobulin (B2M, 3 primeri, 2,6%), hipoksantin fosforibozil transferaza 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), TATA vezavo proteinov (TBP, 1 primer, 0,9 %), in beta-tubulin (TUBB; 1 primera; 0,9%). V petih primerih (4,3%), se je zunanji standardna krivulja se uporablja za absolutno kvantifikacijo (AQ) namesto normalizirano vrednost z referenčnim genom.
Te študije, zato je bil zasnovan, da bi našli najboljše referenčnih genov za študij izražanja genov pri raku na želodcu . V tej študiji smo raziskovali pet referenčnih genov, ki so najpogosteje uporabljene genov pri raziskavah raka želodca (ACTB GAPDH, B2M, 18S rRNA in HPRT1) in za primerjavo, RPL29, referenčnega gena, ki se uporablja v drugih študijah raka, v "non-želodčne rakave celične linije", "v želodcu linije rakava celica", "normalne želodčne tkiva" in "tumor v trebuhu tkiva" (tabela 1). Da bi izbrali najbolj ustrezno referenčno gen iz zgornjega seznama, smo primerjali izražanje glikoprotein NMB (GPNMB), naš ciljni gen, s tistimi v zgoraj imenovano seznama možnih "referenco" genes.Table 1 Potencialni referenčne geni ovrednoteni ta študija.
Gene simbol

GenBank pristopna št
Gene ime
genomske lokalizacijo

Opis
ACTB
NM_001101
Beta-aktin
7p15-12
citoskeletnim strukturni protein
GAPDH
NM_002046
gliceraldehid-3- fosfat dehidrogenaze
12p13
oksidoreduktazo v glikoliza in glukoneogenezo
HPRT1
NM_000194
hipoksantin fosforibozil transferaza 1
Xq26
Metabolna reševanje iz purinov
B2M
NM_004048
Beta-2-mikroglobulin
15q21.1
Beta-veriga I molekul poglavitnega histokompatibilnega kompleksa razreda
18S rRNA
NR_003286
18S ribosomske RNA
22p12
Ribosom podenote
RPL29
NM_00992
ribosomski protein L29
3p21.3-p21.2
strukturnih sestavina ribosome
GPNMB
NM_001005340
glikoproteina (transmembranski) NMB
7p15 || C PODJETJA
vpleten v zamudo rasti in zmanjšanje metastatskih potencialnih
metod
celične linije in človeška tkiva
smo dobljene celične linije iz kolekcije Ameriški Type Culture (Manassas, VA, ZDA) ali korejski Cell Line Bank (Seoul, Koreja): Šest želodcu tumorske celične linije (snu-216, snu-638, snu-719, AGS, MKN-28 in KATOIII), pet tretjih želodčne rakave celične linije (JIMT1, SK-BR-3, snu-C5, A549 in U87) in dve normalne humane celične linije (HDF, HMEC). Vse celične linije so bile vzdrževane v imenovani medijih (MEDIATECH, Manassas, VA, USA), dopolnjenem z 10% fetalnega govejega seruma (Invitrogen, Calsbard, CA, ZDA). Dvajset ujema parov normalnih in tumorskih želodca tkiv so bili pridobljeni z endoskopsko resekcijo med obravnavanjem bolnikov, ki so dali privolitev (tabela 2). Vsi postopki so bili opravljeni v skladu s protokoli, ki jih institucionalnim revizijskega odbora National Cancer Center odobrenih in spremljanje izjave o Helsinki.Table 2 značilnosti bolnikov, ki so določene z želodcem rakavih tkiv.


Število bolnikov
število bolnikov
Skupaj
20
moški
14
ženska
6
dobe pri diagnozi (leta)
Domet
34-77
povprečje ± SD
60,8 ± 12,1
bolezni Stage †
fazi tumor
T1
8
T2
8
T3
4
stage Node
N0
8
N1
6
N2
2
N3
4
† razvrstitev Stage sledi sistem klasifikacije TNM International proti raku unije (UICC) [27]. ekstrakcija
RNA in cDNA zbirnega
vzorci rak želodca tkiva so ohranjeni v RNAlater raztopine (Qiagen, Hilden, Nemčija) do uporabljajo za ekstrakcijo RNA. Celotno RNA smo ekstrahirali z TRIzola regent po protokolu proizvajalca (Invitrogen) in obdelamo z DNaseI na RNeasy Mini stolpcu (Qiagen), za odstranitev preostalega genomske DNA. Koncentracija in A 260/280 razmerje prečiščene RNA smo izmerili z Nanodrop ND-1000 (Thermo Scientific, Wilmington, DE, ZDA), in kakovost je bila ocenjena na Agilent 2100 Bioanalyzer pomočjo RNA 6000 Nano komplet za (Agilent Technologies, Santa Clara , CA, ZDA). Dva ig poli-dT napolniti celotne RNA (random heksamerni napolniti celotne RNK za 18S rRNA ojačanje) so bile obrnjene prepisani z Transcriptor reverzne transkriptaze po protokolu proizvajalca (Roche Applied Science, Mannheim, Nemčija).
Reverzno transkripcijo kvantitativno pravi -time PCR (RT-qPCR)
na podlagi prejšnjih poročilih smo sprejeli temeljni premazi dolžine pomnožkov pod 200 bazičnih točk, razen za ACTB, naj bo dosledna v učinkovitosti ojačanja (tabela 3). Primerji za ojačanje GPNMB je oblikoval Primer 3 programske opreme http: //Frodo wi mit edu /primer3 /.... Mi količinsko mRNA izražanje 6 referenčnih genov in enega ciljnega gena z RT-qPCR na Svetlobno ciklerja 480 II (Roche Applied Science). RT-qPCR reakcijo smo izvedli z uporabo 5 ng razredčenih cDNA, 5 pmole vsakega temeljni premaz (tabela 3), 5 ul do 2 × Lahka ciklerja Fast DNK MasterPlus SYBR Green I v končnem volumnu 10 ul. Pogojev PCR ciklom bili določeni takole: predinkubacijo 5 minut pri 95 ° C, čemur sledi 45 ciklov, pri čemer vsak cikel vključno 15 sekund pri 95 ° C, 30 sekund pri 58 ° C in 30 sekund pri 72 ° C. Relativna kvantifikacija je opravil luč ciklerja Software 1.5.0 (Roche Applied Science), ki temelji na "prehod Rafa" vrednost (Cp), ki določa število ciklov, pri kateri fluorescenčni signal vzorca presega ozadje fluorescence value.Table 3 premazi za šest referenčne geni in ciljno gen.
gen
Forward primer [5 '→ 3']
Obratno zaporedje [5 '→ 3']
Sidranje
eksonov
AMPLICON
velikost
Segajo on
genome

Amplification
efficiency

Reference

ACTB
CATCGAGCACGGCATCGTCA
TAGCACAGCCTGGATAGCAAC
Exon 3
Exon 4
211 bp
652 bp
1,971
[28]
GAPDH
TGCACCACCAACTGCTTA
GGATGCAGGGATGATGTTC
Exon 7
Exon 8
177 bp
370 bp
1.999
[29]
HPRT1
AGACTTTGCTTTCCTTGGTCAG
TCAAGGGCATATCCTACAACAA
Exon 6
Exon 8
151 bp
5120 bp
1,949
[30]
B2M
ACTGAATTCACCCCCACTGA
CCTCCATGATGCTGCTTACA
Exon 2
Exon 4
114 bp
741 bp
1,924
[ ,,,0],28]
18S rRNA
GTAACCCGTTGAACCCCATT
CCATCCAATCGGTAGTAGCG
NA1
151 bp
151 bp
2.000
[31]
RPL29
GGCGTTGTTGACCCTATTTC
GTGTGTGGTGTGGTTCTTGG
Exon 1
Exon 2
120 bp
507 bp
1,937
[16]
GPNMB
TGCGTCCGTGAGAATTCA
TGTGCTCCCTCATGTAAGCA
Exon 1
Exon 2
144 bp
bilo 6522 bp
1.945
v hiši design2
1. Ni na voljo
2. premazi zasnoval Primer 3 z možnostmi človeško mispriming knjižnica presejanja.
podatki analize
statistične analize so bile izvedene z GraphPad Prism V4.03 (GraphPad Software, La Jolla, CA, ZDA). Normalnost je bila ocenjena v skladu s Kolmogorov-Smirnov (KS), D'Agostino-Pearson (DAP), in Shapiro-Wilk (SW) teste. Za distribucijo neobičajnih razdeljenih skupin, non-parametrični Mann-Whitney U-test in Wilcoxonov podpisan rang test smo opravili. P-vrednosti s p
< 0.05 so bile upoštevane statistično značilne. Uporabili smo NormFinder V12 [7] in geNorm ™ V3.44 [8] programska oprema za določanje vrednosti izraz šest kandidatk referenčnih genov.
Rezultati
ocenjevanja kakovosti RNA
smo ocenili kakovost RNA uporablja kot zagon Material na več načinov. A 260/280 razmerje merjena z Nanodrop je 2,08 ± 0,09 (povprečje ± SD), ki potrjuje, da je bila RNA čista in brez beljakovin. Kakovost RNA poroča kot število celovitosti RNA (RIN), ki ga RNA 6000 Nano Labchip za kultiviranega celične linije je bila 9,7 ± 0,2 (povprečje ± SD), in 7,4 ± 1,0 pri vzorcih bolnikov tkiva. Za izravnanih parov vzorcev želodec tkiva, nismo ugotovili statistično pomembnih razlik v A razmerje obeh 260/280 med normalno (2,05 ± 0,03) in tumorja (2,04 ± 0,05) tkiva (paru Studentov t
- Test p
-vrednost = 0,214) ali RIN vrednosti med normalno (7,2 ± 0,5) in tumor (7,5 ± 1,4) tkivo vzorčnih skupin (v paru Studentov t
-test p
-vrednost = 0.340).
Expression razponi kandidatk referenčnih genov in ciljnega gena
smo izvedli RT-qPCR in določi učinkovitost ojačevanja vsakega seta začetnih oligonukleotidov (tabela 3). Izraz šest kandidatk referenčnih genov v smislu Cp vrednot, ustvarjenih z RT-qPCR, so prikazani na sliki 1 kot graf raztrosa. So celične linije pokazal spekter vrednosti Cp, kar predstavlja veliko razliko v izrazu, ki sega med 14.56 in 34.89, odvisno od referenčnega gena uporabljeno. ACTB in GAPDH pokazala najbolj bogate izraz v obeh "rak želodca celičnih linij" in "non-rak želodca celičnih linijah", vendar v nasprotju HPRT1 pokazala najnižjo stopnjo izražanja. Izraz ciljnega gena GPNMB vrednot Cp gibala od 27,7 do 32,1 v celičnih linijah. Ocena normalnosti pokazala HPRT1 v "želodcu raka celičnih linij" in 18S rRNA v "non-želodec celične linije" se običajno ne prodajajo KS-test. Tako smo uporabili neparametrska Mann-Whitney U-test za primerjavo niso normalno porazdeljene neprimerljivo skupin, in je pokazala velike razlike v prijavo GAPDH (p
= 0,014) in B2M (p
= 0,035) med "rak želodca celičnih linij" in "non-rak želodca celičnih linijah". Slika 1 ravni Expression za šest kandidatk RT-qPCR ugotovljenih referenčnih genov. Vrednosti prehod (Cp) v "želodcu raka celičnih linij" in "non-rak želodca celičnih linijah", "normalnih želodčne tkiva" in "tumorjev želodca tkiv" so zastopali ravni izražanja. Drogu sredi razpršenih mestih kaže povprečno raven izražanja. Nižja kot je Cp vrednost, večja je izražanje genov.
Človekove želodčne tkiva je pokazala tudi velike razlike v vrednostih Cp od 13,3 do 29,4 (slika 1), z najvišjo izražanje B2M in 18S rRNA in najnižjo izražanje HPRT1 . Izraz ciljnega gena GPNMB v Cp gibala od 28,5 do 34,7 v želodcu tkivih. V testu normalnost, ACTB HPRT1 in 18S rRNA v skupino "normalnih želodcu tkiva" in vseh genov, razen za GAPDH v "tumorskih želodčne tkiv", ki ji sledi normalne porazdelitve s KS-test. HPRT1, B2M in RPL29 v tumorskih želodcu tkivih opravil normalnost v DAP- in SW-testov. Tako, za primerjavo niso normalno porazdeljene parnih skupin smo izvedli neparametrična Wilcoxonovim testom. Pomemben izraz povečanje od običajnih do tumorja na želodcu tkiva (str
< 0,05) so v HPRT1 ugotovili (p
= 0,011) in 18S rRNA (p
= 0,021), vendar ne v ACTB (p
= 0,058), GAPDH (p
= 0,918), B2M (p
= 0,740), ali RPL29 (p
= 0,208).
Izražanje stabilnost kandidatk referenčnih genov
da identificirati najbolj stabilnih referenčnih genov, smo analizirali podatke izražanja z geNorm in NormFinder. kategorizirane smo celične linije in tkiva v naslednje skupine - "non-želodčne linije rakava celica", "rak želodca celičnih linij", "normalne želodec tkiv", "tumor v želodcu tkiva ',' vse želodčne tkiva (normalna + tumor želodčne tkiva ) "in" vse rak želodca celične linije in tkiv ". Uporaba geNorm zamudne mejo (M < 1,5) izključena nestabilne referenčnih genov in pustimo minimalno število primernih referenčnih genov za vsako skupino na koncu (slika 2). Za določitev optimalnega števila genov, ki so potrebni za geometrični srednji normalizacijo smo primerjali paroma razlike (V n /V n + 1), ki jo izračuna geNorm med vsako kombinacijo zaporednih normalizacija dejavnikov (NF n in NF n + 1) na vseh vzorcih v skupini. Uporabili smo privzeti prag (0,15) za ločitev [8], pod katero vključitev dodatnih referenčnih genov ni potrebno. V vseh skupin, v tej študiji, se par-pametno razlike so že pod pragom (slika 3), kar je bilo razumeti, da so s pomočjo več kot dva optimalne geni ni koristno za večjo natančnost. Po drugi strani pa smo ugotovili korelacijo med variance in naklon krivulje M-vrednosti. V primeru "non-želodcu raka celičnih linijah" dodajanje GAPDH kot tretji gen na obeh optimalno pričakovanih genov B2M-RPL29 poveča za 0.0218 vrednostne stabilnost M, s svojo par kapljic variance V 2 /3 od 0,032. Na ta način je bil koeficient korelacije med paroma variacije in prirastek M-vrednosti na vsakem intervalu v tej skupini, ugotovi, da je r
2 = 0,956. Za "želodcu raka celičnih linij, večja V 05/04 (0,018) in V 06/05 (0,028) vrednosti kot V 2/3 ali V 3/4 pojasniti, zakaj high-sedaj HPRT1 in ACTB geni, je treba izključiti. Korelacija je r
2 = 0,895. Korelacijske koeficiente v "normalnih želodcu tkiv", "tumor želodčne tkiv" in "vse želodčne tkiv" je bilo r
2 = 0,971, 0,996 in 0,960 oz. V "vseh celičnih linijah raka želodca in tkiv", je pokazala manj korelacijo (r
2 = 0,718). Slika 2 Povprečna stabilnost izraz (M) iz šestih referenčnih kandidat genov, ki jih geNorm analize. Stabilnost Expression so narisane v "non-rak želodca celičnih linijah" (a), "v želodcu rakave celične linije" (B), "običajni želodčne tkiva" (C), tumor želodčne tkiva "(D)," vse v trebuhu tkiva " (E) in "vse celične linije in tkiv rak želodca" (F). Najmanj stabilen referenčni gen (višje vrednosti M) je na levi in ​​najbolj stabilno kombinaciji (nižja M vrednost), je na desni strani parcele. Najbolj stabilne referenčne geni so izpeljati postopno izključitev najmanj stabilnih genov.
Slika 3 par-pametno analizo variacije šestih referenčnih kandidat genov. Paroma vrednost sprememba (Vn /n + 1) je bil ustvarjen z analizo geNorm. Optimalno število genov je bila ocenjena s primerjanjem Vn /n + 1. Vse različice so s privzetim mejo 0,15.
Smo tudi program za NormFinder za iste nize podatkov in izračunanih vrednosti stabilnosti. Kot je prikazano v tabeli 4, kar je najnižja vrednost stabilnosti kaže najbolj stabilno izražanje in smo zato uvrstili gene. Najbolj ene referenčne gen za vsako skupino, je, kot sledi; "non-želodčne rakave celične linije" - GAPDH (0.036), "v želodcu linije rakava celica" - B2M (0,014), "običajni želodčne tkiva" - RPL29 (0,028), "tumor v želodcu tkiva" - RPL29 (0,028), "vse želodcu tkiva "- RPL29 (0.032) in" vse želodec celične linije in tkiva "- ACTB (0,029). Čin referenčnih genov za "rak želodca celičnih linijah" je identičen s tistim iz analize geNorm, vendar je bila nekoliko drugačna v drugih kategorijah. NormFinder tudi ocenjuje najboljšo kombinacijo referenčnih genov, ki jih pod-skupin v "vse želodčne tkiva" - RPL29-B2M (0.005) in v "vse želodec celic in tkiv" - 18S rRNA-B2M (0,013) .table 4 vrstni red kandidat single referenčne geni na osnovi njihove vrednosti stabilnosti, izračunanimi iz NormFinder.
rak Non-želodec celične linije
rak želodca celičnih linij Poslovni
Normalno želodec tkiva
tumorja na želodcu tkiva Poslovni
vse želodčne tkiva

Vsi želodec celične linije + tkiva
Gene v razvrstitvi
vrednost stabilnosti
Gene v razvrstitvi
vrednost stabilnosti
Gene po razvrstitvi
stabilnosti vrednost
Gene po razvrstitvi
stabilnosti vrednost
Gene po razvrstitvi
vrednost stabilnosti

Gene po razvrstitvi
stabilnost value

GAPDH
0.036
B2M
0.014
RPL29
0.028
RPL29
0.028
RPL29
0.032
ACTB
0.029
RPL29
0.052
GAPDH
0.021
B2M
0.035
B2M
0.039
B2M
0.041
HPRT1
0.038
B2M
0.053
RPL29
0.029
HPRT1
0.038
HPRT1
0.042
HPRT1
0.044
RPL29
0.068
HPRT1
0.110
18S rRNA
0,036
ACTB
0,043
ACTB
0,065
ACTB
0,052
18S rRNA
0,071
18S rRNA
0,112
ACTB
0,060
18S rRNA
0,062
18S rRNA
0,067
18s rRNA
0.055
GAPDH
0.082
ACTB
0.143
HPRT1
0.115
GAPDH
0.140
GAPDH
0.147
GAPDH
0.140
B2M
0.084
Ciljna izražanje genov profili so pod vplivom referenčnih genov, ki delajo, za normalizacijo
Za oceno referenčnih genov v dejansko stanje, smo se odločili za "rak želodca celičnih linij", "vse želodčne tkiva" in "vse želodec celične linije in tkiv", saj poudarek raziskovalcev z rakom na primerjavo izražanje genov v normalnih in tumorskih tkivih, kot tudi želodec izvira linij rakavih celic za študije in vitro. Uporabili smo posamezne referenčnih genov in kombinacije v relativno kvantifikacijo (RQ) za GPNMB
kot ciljnega gena. GPNMB je transmembranski glikoprotein in igra sodelovanja vlogo pri p53 in citokinsko transkripcijskih faktorjev v diferenciranih imunskih celic [22] in raka dojke [23]. RQ od GPNMB izražanja po šest posameznih referenčnih genov in B2M-GAPDH kombinaciji v "želodcu raka celičnih linijah" so primerjali (slika 4). RQs ga B2M, GAPDH kot enoten referenčni genom in B2M-GAPDH, ki so bile napovedane za najbolj optimalno kombinacijo referenčnih genov za "rak želodca celičnih linijah" s geNorm pokazala podobno visoko-nizko vzorcev (slika 4A, B in 4G). Za primerjavo, RQ z RPL29 povzročila navidezno povišano izražanja v snu-216, vendar zmanjša ekspresijo v snu-719 celičnih linij (slika 4C). RQ ga 18S rRNA je tudi pokazala povišano izražanje v snu-216 vendar znižala izraza v MKN-28 (Slika 4D). RQ ga ACTB in HPRT1 pokazal izredno zmanjša izražanje v snu-719 in KATOIII (Slika 4E in 4F). Slika 4 Relativna kvantifikacija GPNMB izražanja v celičnih linijah raka želodca odvisna od različnih referenčnih genov. Izraz GPNMB v šestih želodcu raka celičnih linij smo normalizirali šest posameznih referenčnih genov in najboljše kombinacije, ki jih pridobijo geNorm (povprečje ± SD); normalizirana s B2M (A), ki ga GAPDH (B), ki ga RPL29 (C), ki ga je 18S rRNA (D), ki ga ACTB (E), HPRT1 (F) in aritmetična B2M-GAPDH kombinaciji (G).
razlika GPNMB RQ od normalnih in tumorskih želodca tkivih je bolnik odvisen. RQ je večje pri nekaterih tumorjih, ampak nasprotno v drugih. RQ normaliziralo vsake šest enotno referenčno gena ni pokazal točno isto vzorec. V primeru normalizacije, ki ga RPL29, ki je bila predvidena kot najbolj stabilen enotno referenčno gena v NormFinder in najbolj stabilno kombinaciji z HPRT1 v geNorm, je high-low vzorec RQ razliko med normalno in tumorja (slika 5A) podobna RQ jih HPRT1 čeprav so bile razlike pri treh bolnikih (slika 5B). RQ ga B2M (slika 5c) in 18S rRNA (Slika 5d) so pokazali drugačen vzorec iz visoko uvrstil posameznih referenčnih genov pri več bolnikih. S ACTB (slika 5E) GAPDH (slika 5F), razlika je postala večja; obstajajo razlike v 35% vseh bolnikov. RQ s geometrijskih pomočjo RPL29-HPRT1 kombinaciji z geNorm (slika 5G) in RPL29-B2M od NormFinder (slika 5h) normaliziral pokazala podoben vzorec. Ko je skupna sprememba krat (Tumor /Normal) so primerjali, RQ od GPNMB s B2M (T /N = 2,46 x, paru t
-test p
= 0,017) in RPL29-B2M (T /N = 2,08 x, p
= 0,025) je pokazala znatno povečanje od normalnega do tumorja na želodcu tkiva. RQ s RPL29 (T /N = 2,23 x, p
= 0,071), HPRT1 (T /N = 1,34 x, p
= 0,258), ACTB (T /N = 1,60 x, p
= 0,395), 18S rRNA (T /N = 1,36 x, p
= 0,527) in RPL29-HPRT1 (T /N = 1,76 x, p
= 0,086), je pokazala tudi povečanje GPNMB izraz v tumorskih želodcu tkivih, vendar ni bila statistično značilna. V primerjavi s tem je pokazala nasprotno smer izražanja razlike (T /N = 0,75 x, p
= 0,637), ki ga GAPDH. To kaže, da so GAPDH izražanje v tumorskih želodčne tkivu močno povišano v primerjavi z drugimi referenčnimi genov. Ti rezultati tudi kažejo, da je mogoče RQ podatki ciljnega gena razlagajo na različne načine, odvisno od referenčnih genov, uporabljenih za normalizacijo. Slika 5 Relativna kvantifikacija GPNMB izražanja v normalnih in tumorskih želodca tkiv je odvisna od različnih referenčnih genov. Izraz GPNMB na raka želodca tkivih (solid bar: Normalno, odprt bar: Tumor) smo normalizirali šest posameznih referenčnih genov in dveh kombinacijah, ki izhajajo iz geNorm in NormFinder (povprečje ± SD); normalizirana s RPL29 (A), ki ga HPRT1 (B), ki ga B2M (C), po 18S rRNA (D), po ACTB (E), GAPDH (F), aritmetična RPL29-HPRT1 (G) in RPL29-B2M (H).
Za "vseh celičnih linijah in tkiv raka želodca", NormFinder in geNorm napovedal 18S rRNK-B2M in 18S rRNK-ACTB kot najboljše kombinacije. Vzorec GPNMB RQ s aritmetična teh kombinacij je bilo podobno med njimi. GPNMB RQs med "rak želodca celičnih linij" in "vse želodčne tkiv" mogoče primerjati v istem območju z 18S rRNA-ACTB, vendar je bil 1 dnevnik naročila razlike, ki jo 18S rRNA-B2M kombinaciji. Vzorci RQ v "želodcu raka celičnih linijah" (slika 6A, 6B) je bila podobna RQ jih B2M-GAPDH (Slika 4G), vendar RQ o "vseh želodčnih tkiv", ki jih 18S rRNA-ACTB (slika 6B) so bili drugačni od ( Slika 5G, 5H). Zdi se, da je bistveno povečala 18S rRNA izraz v tumor želodčne tkiva (slika 1), bi lahko prispevali k temu rezultatu. Tako, čeprav so bile te kombinacije napovedano kot najboljši, niso primerne za razlago podatkov. Slika 6 Relativna kvantifikacija GPNMB izražanja v bazenu vseh celičnih linijah in tkivih raka želodca odvisna od različnih kombinacij referenčnih genov. Izraz GPNMB v celičnih linijah raka želodca in želodčne tkiv (solid bar: Normalno, odprt bar: Tumor) smo normalizirali dveh kombinacijah, ki izhajajo iz geNorm in NormFinder (povprečje ± SD); normalizirana s 18S rRNA-ACTB v rak želodca celičnih linijah (A) in želodca tkiv (C) in normalizirana s 18S rRNA-B2M v rak želodca celični liniji (B) in želodčne tkiv (d).
Razprava
diferencialom izražanje genov v raka, ki je iz študije transkriptomov predlaga, da bi se nekatere posebne geni vključeni v tumorigeneze in metastaz raka. RT-qPCR je robusten in specifična metoda za potrjevanje identitete kandidatnih genih raka na želodcu, ker zazna tudi zelo šibke signale iz izredno majhnih količin biopsijo vzorce, če je bolnik v zgodnji fazi raka. Vendar pa je v odsotnosti ustreznih referenčnih genov, pridobljeni podatki so na voljo na vprašanje vodi do napačnih interpretacij. Pred to študijo, ni bil potrjen referenčni gen identificiran za "rak želodca celične linije" ali "v želodcu tkiva raka", vendar ACTB in GAPDH so bili uporabljeni najpogosteje do sedaj brez upoštevanja njihovih neskladnih izražanja v različnih eksperimentalnih nastavitev in kliničnih stanj . Pregledali smo, poleg ACTB in GAPDH, štiri druge referenčne geni, HPRT1, RPL29, 18S rRNA in B2M, ki so bili ocenjeni kot referenčne genov v zadnjih študijah pri drugih oblikah raka.
Očitno je, da izberete ustrezen premaz, komplet je pomembno izhodišče za pridobitev natančne rezultate. Upoštevali smo naslednje točke, pri izbiri začetnih oligonukleotidov. Najprej smo sprejeli sete začetnih oligonukleotidov, ki so se prej poročali, da imajo ali so namenjeni poseduje dolžino amplikonske okoli 200 bazičnih točk. Drugič, vse od primarnih nizov so morali nanesti vsaj dva sosednja eksonov razen 18S rRNA gen, ki ni mRNA. Zgornjih dveh točk se nanašajo na učinkovitost pomnoževanja. Potrebno je, da referenčni gen in ciljni gen ohranili približno enako učinkovitost ojačevanja [13]. Dolžina pomnožkov je tesno povezana z učinkovitostjo ojačanja [24]. Torej bi pričakovali podobno učinkovitost iz AMPLICON podobne dolžine in večje učinkovitosti od krajšega pomnožkov. Korist krajši AMPLICON, 70-250 bp, v RT-qPCR je, da je ojačanje "neodvisni" kvalitete RNA [25]. Učinkovitost pomnoževanja je zaradi kontaminacije gDNA vpliva tudi, ker kompetitivno vezavo začetnih oligonukleotidov deluje kot omejitveni dejavnik, ki povzroča zmanjšanje učinkovitosti pomnoževanja [13]. V tem okviru je zdravljenje DNaseI med čiščenjem RNA je ključnega pomena, da se prepreči širšo preostale gDNA, vendar morda ne bo povsem učinkovito. Zato je naš drugi vidik pomaga odkriti možne kontaminacije z gDNA različnih velikosti pomnožkov. Potrdili smo, da je vsak naprej in nazaj primer je zasidrana na različnih eksonu ga Blaž iskanja o človekovih zaporedjem nukleotidov, in tudi to, da ni bilo ojačan proizvod kontaminira gDNA s podaljšano dolžino pomnožkov (tabela 2). Poleg tega smo tudi zagotoviti visoko kakovost RNA izhodnega materiala, na več načinov. Prav tako smo izvedli eksperimente v treh izvodih za vsakega gena in vsak vzorec.
Ker razvoj qPCR, je bilo razvitih več statističnih programov ugotoviti optimalne referenčnih genov. Izbrali smo geNorm in NormFinder za analizo stabilnosti šestih referenčnih genov smo študirali. Program geNorm izračuna M-vrednosti, ki temeljijo na povprečni par kapljic variacije določenega gena v primerjavi z vsemi drugimi proučevanih kandidatke referenčnih genov in jih uvršča [8]. Za primerjavo, NormFinder sprejme strategijo, imenovano "pristop, ki temelji na modelu za oceno variacije izraz" [7].

• Silico analizo želodca karcinoma Serijska analiza izražanja genov knjižnic razkriva različne profile, povezane z narodnostjo
• Adjuvantno kemoterapijo sevanja za adenokarcinomom želodca: institucionalna izkušnje