Identificación de genes de referencia válidos para los estudios de expresión génica de cáncer de estómago humano por transcripción reversa-qPCR

Identificación de genes de referencia válidos para los estudios de expresión génica de cáncer de estómago humano mediante transcripción inversa-qPCR
Resumen Antecedentes

reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real para la cuantificación de transcripción (RT-qPCR) es un poderoso método para el análisis de la expresión génica. los niveles de expresión del gen diana son generalmente normalizaron a un gen de referencia expresado constantemente también conocido como estándar interno, en la misma muestra. Sin embargo, es muy difícil no se ha gastado hasta ahora en la búsqueda de genes de referencia adecuados para el estudio del cáncer de estómago mediante RT-qPCR, aunque la selección de genes de referencia óptimos es fundamental para la interpretación de los resultados.
Métodos Se evaluaron
la idoneidad de seis genes de referencia posibles, beta-actina (ACTB), deshidrogenasa gliceraldehído-3-fosfato (GAPDH), hipoxantina fosforribosil transferasa 1 (HPRT1), beta-2-microglobulina (B2M), subunidad ribosomal L29 (RPL29) y 18S ARN ribosomal (ARNr 18S) en 20 pares de tejido normal y tumoral del estómago de pacientes con cáncer de estómago y 6 líneas celulares de cáncer de estómago, por RT-qPCR. . El empleo de estabilidad de la expresión y análisis utilizando NormFinder geNorm algoritmos se determinó el orden de actuación de estos genes de referencia y sus valores de variación
Resultados
Este estudio RT-qPCR mostraron que no son estadísticamente significativas (p Hotel < 0,05 ) las diferencias en los niveles de expresión de HPRT1 y 18S rRNA en 'normal-' frente a '' tejidos del estómago tumoral. Los análisis de estabilidad por geNorm sugieren B2M-GAPDH, como mejor combinación de genes de referencia de 'líneas celulares de cáncer de estómago'; RPL29-HPRT1, de 'todos los tejidos del estómago'; y ACTB-18S rRNA, de 'todas las líneas celulares y tejidos del estómago'. NormFinder B2M también identificó como la mejor referencia de genes de 'líneas celulares de cáncer de estómago', RPL29-B2M para 'todos los tejidos del estómago', y 18S rRNA-ACTB para 'todas las líneas celulares y tejidos del estómago. Las comparaciones de la expresión normalizada del gen diana, GPNMB, mostraron diferente interpretación de la expresión del gen diana a depender del gen de referencia individual o combinada.
Conclusión Este estudio validado
RPL29 y RPL29-B2M como los mejores genes de referencia individuales y combinación, para el análisis de RT-qPCR de todos los tejidos del estómago '', y B2M y B2M-GAPDH como la mejor referencia de genes individuales y combinados, de 'líneas celulares de cáncer de estómago. El uso de estos genes de referencia validados debería proporcionar una interpretación más exacta de las expresiones de genes diferenciales a nivel de transcripción en el cáncer de estómago.
Antecedentes
reacción de transcripción inversa cuantitativa en tiempo real en cadena de polimerasa (RT-qPCR) es una poderosa herramienta para la validación de la observadas diferencias en la expresión génica, debido a su mayor sensibilidad y especificidad. En los estudios tradicionales de expresión génica, un "gen de referencia ', también llamado' patrón interno" o "limpieza de genes" se utiliza para la normalización. La expresión de beta-actina (ACTB) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH), que se utiliza en la mayoría de estudios [1], se informó a variar con las condiciones experimentales [2] y el estado clínico de los tejidos estudiados (por ejemplo,
asma), haciendo que estos genes no adecuados como patrones internos para su uso en la normalización de la expresión génica [3]. . Por lo tanto, la validez del gen de referencia elegido para el análisis estadístico es crucial para evitar el peligro de malinterpretar los datos no válidos y conclusiones [4]
Se sugirió que al menos tres consideraciones deben ser tenidas en cuenta en la elección de un gen de referencia: 1) la constancia de su expresión a través de la intervención, 2) su eficiencia de amplificación y 3) su abundancia, que debe ser similar a la de los genes de interés [5]. Además, para garantizar la pertinencia, la precisión y la exactitud de las interpretaciones de RT-qPCR, se recomienda que las directrices precisas para la RT-qPCR MIQE (Información mínima para Publicación de cuantitativa en tiempo real Experimento PCR) se deben adherir a [6] . Existen varias herramientas para el análisis estadístico como NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] han sido desarrollados para ayudar en la elección de los genes de referencia adecuados. Estas herramientas evalúan las variaciones en la expresión de un número de genes de referencia potenciales y sugieren que el gen (s) de referencia que es apropiado para la normalización de los datos de expresión de genes en un estudio dado. Cáncer
estómago es el cuarto cáncer más común en todo el mundo, con una reportado 934.000 casos en 2002 [10]. La supervivencia de cáncer de estómago es pobre ya que los pacientes a menudo se diagnostica sólo después de que la enfermedad ya ha avanzado significativamente [11], lo que hace que la detección temprana muy importante. Screening destinado a la detección temprana implica el examen endoscópico. Para confirmar la presencia de cáncer, las biopsias se toman a partir de tejidos sospechosos y se sometieron a RT-qPCR para confirmar la expresión anormal de genes relacionados con el cáncer. Pero los genes de referencia adecuados tienen que ser identificados para realizar comparaciones válidas entre las expresiones de lo normal en comparación con los genes del cáncer. genes de referencia se han descrito para los estudios de RT-qPCR en varios tipos de cáncer de otros tejidos [1, 12-21]. Sin embargo no parece haber consenso sobre los genes de referencia para estudios de expresión génica en el cáncer de estómago. Por lo tanto, se realizaron búsquedas en PubMed con los términos MeSH "cáncer gástrico", "en tiempo real", y "PCR". En una evaluación de 115 artículos publicados entre mayo de 2007 noviembre de 2009, se encontró que GAPDH (53 casos; 46,1%) y ACTB (41 casos; 35,7%) fueron los genes de referencia más utilizados en los estudios de cáncer gástrico; seguido de 18S rRNA (8 casos; 7,0%), beta-2-microglobulina (B2M; 3 casos; 2,6%), hipoxantina fosforribosil transferasa 1 (HPRT1; 2 casos; 1,7%), proteína de unión a TATA (TBP; 1 caso; 0,9 %), y beta-tubulina (TUBB; 1 caso; 0,9%). En cinco casos (4,3%), la curva de estándar externo se utilizó para la cuantificación absoluta (AQ) en lugar de valor normalizado por el gen de referencia.
El presente estudio, por tanto, ha sido diseñado para encontrar las mejores genes de referencia para los estudios de expresión génica en el cáncer de estómago . En este estudio, hemos investigado los cinco genes de referencia que se han utilizado con mayor frecuencia los genes en estudios de cáncer de estómago (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNA, y HPRT1) y para la comparación, RPL29, un gen de referencia utilizado en otros estudios de cáncer, en "líneas no celulares de cáncer de estómago», «líneas celulares de cáncer de estómago», «tejidos normales del estómago» y «tejidos del estómago tumorales (Tabla 1). Con el fin de elegir el gen de referencia más adecuado de la lista anterior, se compararon las expresiones de NMB glicoproteína (GPNMB), nuestro gen diana, con los de la lista anterior con nombre de posible "de referencia" 1 genes.Table posibles genes de referencia evaluados en este estudio.
símbolo de genes

GenBank Nº de acceso
nombre de gen
localización genómica
Descripción
ACTB
NM_001101
Beta-actina del citoesqueleto
7p15-12
proteína estructural GAPDH

NM_002046
gliceraldehído-3- fosfato deshidrogenasa
12p13
oxidorreductasa en la glucólisis y la gluconeogénesis
HPRT1
NM_000194
hipoxantina fosforribosil transferasa 1

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