Identifikavimas galiojančios orientacinės genų genų ekspresijos tyrimus žmogaus skrandžio vėžio atvirkštinės transkripcijos-qPCR

Identifikavimas galiojančios orientacinės genų genų ekspresijos tyrimus žmogaus skrandžio vėžio atvirkštinės transkripcijos-qPCR
tezės
Background
atvirkštinės transkripcijos kiekybinę realaus laiko polimerazės grandininę reakciją (AT-qPCR) yra galingas metodas analizės genų ekspresiją. Tikslinė genų ekspresijos lygis paprastai yra normalizuotas pagal atitinkamai išreikšta atskaitos geno taip pat žinomas kaip vidinio etalono, į to paties mėginio. Tačiau daug pastangų nebuvo panaudota šiol ieškant atskaitos genų tinka skrandžio vėžio naudojant RT-qPCR tyrimo, nors pasirinkimas optimalių atskaitos genų yra labai svarbus aiškinant rezultatus.
Metodai
įvertinome šešių galimos nuorodos genų tinkamumas, beta aktino (ACTB), glyceraldehydes-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH), hipoksantino fosforiboziltransferazę 1 (HPRT1), beta 2-mikroglobulinas (B2M), ribosomos subvieneto L29 (RPL29) ir 18S ribosomos RNR (18S rRNR) 20 normalių ir vėžinių skrandžio audinių porų skrandžio vėžiu sergantiems pacientams ir 6 skrandžio vėžio ląstelių linijas, RT-qPCR. . Kurioje išraiška stabilumą analizės, taikant NormFinder ir geNorm algoritmai nustatėme eksploatacinių savybių iš šių referencinių genų ir jų kitimo vertybių tvarką
rezultatai
Šiuo RT-qPCR tyrimas parodė, kad yra statistiškai reikšmingas (p
< 0,05 ) skirtumai ekspresijos lygio HPRT1 ir 18S rRNR į "normal-" prieš "auglys pilvo audiniuose". Stabilumo analizes geNorm rodo B2M-GAPDH, kaip geriausia nuoroda genų derinys "skrandžio vėžio ląstelių linijų"; RPL29-HPRT1, "visoms skrandžio audinių"; ir ACTB-18S rRNR, "visoms skrandžio ląstelių linijų ir audinių". NormFinder taip pat nustatė B2M kaip geriausias atskaitos genu "skrandžio vėžio ląstelių linijų", RPL29-B2M "visų skrandžio audinių" ir 18S rRNR-ACTB "visų skrandžio ląstelių linijų ir audinių". Į normalizuotas išraiška taikinio geno, GPNMB, palyginimai parodė skirtingą aiškinimą tikslas genų ekspresijos priklauso nuo geriausio vieno etaloninio geno arba kartu.
Išvada
Šis tyrimas patvirtintas RPL29 ir RPL29-B2M kaip geriausių vieną orientacinį genų ir derinys, už AT-qPCR analize "visoms skrandžio audinių" ir B2M ir B2M-GAPDH kaip geriausias vieno etaloninio genų ir kartu, dėl "skrandžio vėžio ląstelių linijų". Naudojant šiuos įteisintais pamatiniais genų turėtų teikti daugiau interpretavimas diferencialinių genų išraiškos ne transkripcijos lygio skrandžio vėžio.
Faktai
atvirkštinės transkripcijos kiekybinę realaus laiko polimerazės grandininę reakciją (RT-qPCR) yra galingas įrankis, patvirtinantys pastebėtų genų ekspresijos skirtumai, nes jos didesnio jautrumo ir specifiškumo. Tradiciniuose ekspresijos tyrimų metu buvo stebėtas "nuoroda genas", taip pat vadinamas "vidinis standartas" arba "Namų ūkis genas" yra naudojamas normalizavimo. Beta-aktino išraiška (ACTB) ir glyceraldehydes-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH), naudojamas studijų balsų dauguma [1], buvo pranešta, kad skiriasi su eksperimentinėmis sąlygomis [2] ir klinikinės būklės audinio studijavo (pvz
astma), todėl šie genai netinkamos kaip vidaus standartų naudojimo normalizuoti genų ekspresiją [3]. . Taigi atskaitos geno galiojimo pasirinko, statistinės analizės yra labai svarbu išvengti klaidingai aiškina duomenis ir nepagrįstus išvadas pavojaus [4]
Buvo pasiūlyta, kad renkantis tam tikrą pamatinę geną turėtų būti atsižvelgta bent tris aplinkybes: 1) pastovumas savo išraiška visoje intervencijos, 2) jo amplifikacijos efektyvumas ir 3) jos gausa, kuri turėtų būti panašus į, kad iš interesų genų [5]. Be to, siekiant užtikrinti, aktualumą, tikslumą ir teisingumą RT-qPCR interpretacijų, yra rekomenduojama, kad tikslios gairės RT-qPCR MiQE (minimalią informaciją paskelbti Kiekybiniai realiojo laiko PGR eksperimentas) turėtų būti laikomasi [6] , Keletas įrankiai statistinės analizės, pavyzdžiui, NormFinder [7], geNorm [8], BestKeeper [9] buvo sukurta siekiant padėti atitinkamų referencinių genų pasirinkimas. Šie įrankiai įvertinti svyravimus potencialių atskaitos genų skaičiaus išraiška ir pasiūlyti kurį nuoroda geną (-ai) yra tinkamas normalizuoti genų ekspresijos duomenų tam tikroje studijų.
Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio visame pasaulyje, apie kurį pranešta 934,000 atvejų 2002 [10]. Išgyvenimo nuo skrandžio vėžio yra prasta, nes pacientai dažnai diagnozuojama tik po to, kai liga jau pažengusi gerokai [11], kuri leidžia anksti aptikti labai svarbus. Atranka siekiant anksti nustatyti apima endoskopinio tyrimo. Norėdami patvirtinti vėžio buvimą, biopsijos paimti iš įtariamų audinių ir taikomos RT-qPCR patvirtinti nenormalus išraišką vėžio susiję genai. Bet tinkamų pagalbos genai turi būti nustatytos dėl svarbių palyginimų tarp išraiškų normalu, palyginti su vėžio genais. Pagalbos genai buvo aprašyta RT-qPCR tyrimų įvairiose vėžio kituose audiniuose [1, 12-21]. Tačiau atrodo, kad nėra sutarimo dėl orientacinių genų ekspresijos tyrimus su skrandžio vėžiu. Todėl ieškoma PubMed, kurių akies sąlygomis "skrandžio vėžys", "realaus laiko" ir "PGR". Be 115 paskelbtų straipsnių nuo 2007 metų gegužės iki 2009 m įvertinimo, mes nustatėme, kad GAPDH (53 atvejai; 46,1%) ir ACTB (41 atvejai; 35,7%) buvo dažniausiai naudojamas pagalbos genai skrandžio vėžio tyrimų; po 18s rRNR (8 atvejais; 7,0%), beta-2-mikroglobulinas (B2M; 3 atvejai; 2,6%), hipoksantino fosforiboziltransferazę 1 (HPRT1; 2cases; 1,7%), TATA surišančio baltymo (TBP; 1 atveju; 0,9 %), ir beta-tubulino (TUBB; 1 atvejis; 0,9%). Penkiais atvejais (4,3%), išorės standartinė kreivė buvo naudojamas absoliutus kiekybinio (AQ) vietoj normalizuotas verte, atsižvelgiant geno.
Šiame tyrime, todėl buvo sukurta siekiant surasti geriausius atskaitos genų genų ekspresijos tyrimus skrandžio vėžio , Šiame tyrime mes ištirti penkis informacinius genus, kurie buvo dažniausiai naudojamas genų skrandžio vėžio tyrimų (ACTB, GAPDH, B2M, 18S rRNR ir HPRT1) ir palyginimui, RPL29, atskaitos geno naudojamas kituose vėžio tyrimus, "ne skrandžio vėžio ląstelių linijos", "skrandžio vėžio ląstelių linijas", "normalus skrandžio audiniai" ir "naviko skrandžio audiniai" (1 lentelė). Norint pasirinkti Jums tinkamiausią atskaitos geną iš pirmiau nurodyto sąrašo, mes palygino glikoproteino NMB išraiškas (GPNMB), mūsų tikslas geną su tais, pirmiau pavadintas sąrašą galima "nuoroda" genes.Table 1 Galimos pagalbos genai įvertinta šis tyrimas.
Genų simbolis

GenBank prisijungimas Nr
Gene vardas

Genomo lokalizacija

Aprašymas
ACTB
NM_001101
Beta aktino
7p15-12
Citoskeletas struktūrinis baltymas
GAPDH
NM_002046
gliceraldehid-3- fosfatdehidrogenazės
12p13
oksidoreduktazė į glikolizės ir gliukoneogenezėje
HPRT1
NM_000194
hipoksantin fosforiboziltransferazę 1
Xq26
Metabolinis gelbėjimas purino
B2M
NM_004048
Beta 2-mikroglobulinas
15q21.1
Beta grandinė I pagrindinis Audinių suderinamumas kompleksas klasės molekulių
18S rRNR
NR_003286
18S ribosomos RNR
22p12
Ribosoma subvieneto
RPL29
NM_00992
ribosomų baltymas L29
3p21.3-p21.2
struktūrinės sudedamoji ribosomos
GPNMB
NM_001005340
glikoproteino (transmembraninis) NMB
7p15

• Be Silico analizės Skrandžio vėžiu Serial analizė genų ekspresijos bibliotekų atskleidžia skirtingus profilius, susijusius su ethnicity
• Pagalbinis Chemoterapija spinduliuotės skrandžio adenokarcinoma: institucinė experience